专利名称：Dna分子标记鉴别技术鉴别头花蓼与尼泊尔蓼的方法
技术领域：
本发明涉及一种利用DNA分子标记鉴别技术鉴别头花蓼与尼泊尔蓼的方法，属于生物技术的领域。
背景技术：
蓼科植物头花蓼Polygonum capitatum Buch-Ham. ex D. Don为贵州苗族人民的习用药材，对于治疗泌尿系统疾病具有显著疗效；是著名苗药“热淋清颗粒”的唯一原料药材。头花蓼是一种药用价值很高的中草药，也是贵州具有代表性的苗药。对头花蓼及其近缘种的药用情况进行调查结果表明，目前头花蓼及其同组植物火炭母、赤胫散、德氏蓼、尼泊尔蓼在贵州运用广泛，并且都用于风湿痹痛等疾病的治疗，民间多将同科同属植物，如火炭母 P. chinense L. var. chinense、赤胚散 P. runcinatum Buch. -Ham. ex D.Don var. sinense Hemsl.、尼泊尔藝P. η印alense Meisn、德氏藝P. dielsii Leil植物混作头花蓼使用，特别是尼泊尔蓼与头花蓼原植物形态相似，多误认作头花蓼用，但实际上二者在临床使用上是有区别的，头花蓼偏重于利尿通淋，尼泊尔蓼则偏重于治疗风湿痹痛之症。但作为干燥药材收购时，彼此之间的植物形态因皱缩而不易分辨和鉴别，从而易造成药材的混淆使用。对于头花蓼的检测，传统的鉴定方法主要依靠形态学鉴定，缺点是主观性强。近年来，以PCR为基础的DNA分子标记鉴别技术在中药材真伪鉴别中发挥了重要的辅助鉴定作用。RAPD操作技术简便，工作效率高，DNA样品需要量少，不受环境、发育、数量性状等影响，是一种理想和有效的分子生物学技术，在中药材种属分类、亲缘鉴别、种质资源的道地性研究等方面广泛应用。但RAPD标记有反应温度低，实验结果的重复性、稳定性较低，使研究结果无法作为有效的标记保存下来。而若在RAPD研究的基础上进一步建立SCAR标记， 就能有效地克服RAPD重复性不好的缺点。SCAR (Sequence characterized amplified regions) ^^^ Ψ^Μ^ Τ^Β 记，是一种基于PCR技术的单基因位点多态性遗传标记，其原理是在序列未知的DNA标记 (RAPD，AFLP等)基础上，通过对RAPD片段中某一目的基因的克隆和测序，设计一对互补于该RAPD片段的序列引物，再去扩增原来的模板DNA，可得到产生单位点的SCAR DNA标记。与RAPD技术相比，SCAR技术用一对互补到专一基因组位点的长引物和严格的PCR 条件，退火温度高，选用较长的寡核苷酸引物，因此可靠性高，重复性好，对反应条件不敏感，同时揭示的信息多，有利于构建高密度的遗传图谱，能为物种的鉴别提供高效、快速、准确的方法。经对现有技术文献的检索发现，杜明凤、陈庆富于2009年发表了 “贵州和四川头花蓼居群的RAPD多态性研究”(武汉植物学研究2009，27(1) 8 11)，但上述文献是针对不同产地的头花蓼作遗传多样性分析，目的是分析来源于不同地区的同一物种之间的遗传差异，立足点在头花蓼这一个植物种内，并没有针对头花蓼与其近缘种尼泊尔蓼进行SCAR标记的鉴别研究内容。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种利用DNA分子标记鉴别技术鉴别头花蓼与尼泊尔蓼药材的方法。从而克服现有技术中，头花蓼与尼泊尔蓼的药材干品不易分辨和鉴别，预防及避免“热淋清颗粒”的原料药材混淆使用的问题。为保证“热淋清颗粒”的原料供应、解决上述技术问题，本发明采用如下的技术方案一种鉴别头花蓼与尼泊尔蓼的引物，所述引物序列如下5’ -GCTCGGTTTCAGAATAAGT-3‘5，-TCCCTGAGGTGTTCGTTT-3，。一种利用DNA分子标记鉴别技术鉴别头花蓼与尼泊尔蓼的方法，操作步骤如下1)合成特异性鉴别引物按序列5，-GCTCGGTTTCAGAATAAGT-3，，5，-TCCCTGAGGTGTTCGTTT-3，合成一对特异性鉴别引物；2)以改良CTAB法分别提取头花蓼DNA基因、尼泊尔蓼DNA基因；3)以步骤2)所得的头花蓼DNA基因和尼泊尔蓼DNA基因为模板，进行PCR扩增；4)检测PCR反应结果。步骤2)中，所述以改良CTAB法分别提取头花蓼DNA基因、尼泊尔蓼DNA基因的步骤如下①取头花蓼、尼泊尔蓼药材各50mg，放入已消毒的2个研钵中，分别加入CTAB提取液约MOO μ L，分别迅速研磨，在研磨的过程中加入20 μ L β -巯基乙醇，研磨至粉末糊状；②用镊子取离心管放在离心板上，编号，待用；③分别用移液枪将研磨好的药材提取液吸取700 μ L至离心管中；离心管插于漂浮板上，60°C水浴加热60min，每IOmin振摇一次；④取出离心管，分别加入700 μ L氯仿异戊醇=24 1的混合溶液，充分混勻， 室温下12，OOOrpm离心IOmin ；⑤将离心管的上层水相转入一新离心管中，分别加入700μ L CTAB沉淀缓冲液，混勻，室温下静置浊；⑥室温下12，OOOrpm离心lOmin，弃废液；⑦向离心管中加入700 μ L70%的乙醇，室温下12，OOOrpm离心5min，弃废液；⑧再加入700yL 95%的乙醇，室温下12，OOOrpm离心5min，弃废液；⑨敞开离心管口，在室温下放置5h，挥干乙醇，得到所提取的药材总DNA ；⑩装有药材DNA的离心管中于_20°C贮存备用。步骤3)中，所述PCR扩增反应体系为分别取4支50 μ L的PCR反应管，建立头花蓼药材、尼泊尔蓼药材、阴性对照1、阴性对照2的PCR扩增反应体系①头花蓼PCR反应管中加入以下成分头花蓼DNA模板1 μ L，IOmmol · L—1的 dNTPmiX13l·! L，一对IOpmol .L—1的高度特异性鉴别引物各1 μ L，加入双蒸水补齐至25 μ L ；
②尼泊尔蓼PCR反应管中加入以下成分尼泊尔蓼DNA模板1 μ L，IOmmol ·厂1 的dNTPmix 13 μ L，一对IOpmol · L-1的高度特异性鉴别引物各1 μ L，加入双蒸水补齐至 25μ L ；③阴性对照1的PCR反应管中加入以下成分头花蓼DNA模板1 μ L，IOmmol · L—1 的dNTPmix 13 μ L，加入双蒸水补齐至25 μ L ；④阴性对照2的PCR反应管中加入以下成分IOmmol 'Γ1的dNTPmix 13 μ L，一对 IOpmol · L-1的高度特异性鉴别引物各1 μ L，加入双蒸水补齐至25 μ L。步骤3)中，所述PCR扩增反应条件为94°C预变性5min ；94°C变性lmin，51°C退火 45s，72°C延伸2min，循环40次；72°C后延伸7min，4°C保存。步骤4)中，所述检测PCR反应结果的步骤为分别自4支PCR反应管中取5μ L 反应液加入1 μ L溴酚蓝溶液染色后，再将染色液加入1. 0%琼脂糖凝胶梳孔，在TE缓冲液中电泳lh，取出，在紫外凝胶成像系统下拍照观察；结果在琼脂糖凝胶上，头花蓼药材在与 Mark 300bp相对应位置，可见一条明亮的电泳带，而尼泊尔蓼药材在相同位置无任何条带出现。与现有技术相比，本发明以贵州具有代表性的民族药热淋清颗粒的唯一原料药材头花蓼为研究对象，探索使用RAPD分析方法对头花蓼及近缘种进行遗传多样性分析；并在 RAPD的实验基础上，将RAPD方法转化为SCAR标记，为头花蓼及其近缘种鉴定提供准确可靠、快速稳定的方法。本发明用筛选18条RAPD引物对头花蓼、尼泊尔蓼进行PCR扩增，建立了头花蓼及其近缘种的RAPD指纹图谱，从RAPD图谱中找到能特异性区分头花蓼和尼泊尔蓼的电泳条带，对之进行切胶、回收并进行测序，然后根据序列设计出4对特异性引物进行PCR扩增，将 RAPD 转化为 SCAR0 其中的引物 THL12f 和 THL 12r (5，-GCTCGGTTTCAGAATAAGT-3，， 5’ -TCCCTGAGGTGTTCGTTT-3’ )在300bp时可以明确鉴别出头花蓼(头花蓼有电泳带，尼泊尔蓼无电泳带)。本发明所提供的SCAR标记特异性好，稳定可靠，操作简单，可鉴别头花蓼与尼泊尔蓼，达到了发明目的，并在“热淋清颗粒”原药材的使用中得到较好推广应用。发明人进行了系列实验，结果如下实验例1 头花蓼与尼泊尔蓼的RAPD分析1材料和仪器1. 1实验材料采集贵州头花蓼、尼泊尔蓼用硅胶迅速干燥，-20°C保存。各样品由贵阳中医学院生药教研室江维克教授鉴定。见表1表1实验材料
权利要求
1.一种鉴别头花蓼与尼泊尔蓼的引物，其特征在于所述引物序列如下5’ -GCTCGGTTTCAGAATAAGT-3‘5， -TCCCTGAGGTGTTCGTTT-3，。
2.一种利用DNA分子标记鉴别技术鉴别头花蓼与尼泊尔蓼的方法，其特征在于操作步骤如下1)合成特异性鉴别引物按序列 5，-GCTCGGTTTCAGAATAAGT-3，，5，-TCCCTGAGGTGTTCGTTT-3，合成一对特异性鉴别引物；2)以改良CTAB法分别提取头花蓼DNA基因、尼泊尔蓼DNA基因；3)以步骤2)所得的头花蓼DNA基因和尼泊尔蓼DNA基因为模板，进行PCR扩增；4)检测PCR反应结果。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于步骤幻中，所述以改良CTAB法分别提取头花蓼DNA基因、尼泊尔蓼DNA基因的步骤如下①取头花蓼、尼泊尔蓼药材各50mg，放入已消毒的2个研钵中，分别加入CTAB提取液约 MOO μ L，分别迅速研磨，在研磨的过程中加入20 μ L β-巯基乙醇，研磨至粉末糊状；②用镊子取离心管放在离心板上，编号，待用；③分别用移液枪将研磨好的药材提取液吸取700μ L至离心管中；离心管插于漂浮板上，60°C水浴加热60min，每IOmin振摇一次；④取出离心管，分别加入700yL氯仿异戊醇=M 1的混合溶液，充分混勻，室温下 12，OOOrpm 离心 IOmin ；⑤将离心管的上层水相转入一新离心管中，分别加入700μ L CTAB沉淀缓冲液，混勻， 室温下静置浊；⑥室温下12，OOOrpm离心lOmin，弃废液；⑦向离心管中加入700μL70%的乙醇，室温下12，OOOrpm离心5min，弃废液；⑧再加入700μ L 95%的乙醇，室温下12，OOOrpm离心5min，弃废液；⑨敞开离心管口，在室温下放置釙，挥干乙醇，得到所提取的药材总DNA；⑩装有药材DNA的离心管中于_20°C贮存备用。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于步骤3)中，所述PCR扩增反应体系为分别取4支50 μ L的PCR反应管，建立头花蓼药材、尼泊尔蓼药材、阴性对照1、阴性对照2的PCR扩增反应体系①头花蓼PCR反应管中加入以下成分头花蓼DNA模板1μ L，IOmmol · L—1的 dNTPmiX13l·! L，一对IOpmol .L—1的高度特异性鉴别引物各1 μ L，加入双蒸水补齐至25 μ L ；②尼泊尔蓼PCR反应管中加入以下成分尼泊尔蓼DNA模板1μ L，IOmmol · L—1的 dNTPmix 13 μ L，一对IOpmol · Γ1的高度特异性鉴别引物各1 μ L，加入双蒸水补齐至 25μ L ；③阴性对照1的PCR反应管中加入以下成分头花蓼DNA模板1μ L，IOmmol · L—1的 dNTPmix 13 μ L，加入双蒸水补齐至25 μ L ；④阴性对照2的PCR反应管中加入以下成分10mmol· Γ1的dNTRnix 13 μ L，一对 IOpmol · Γ1的高度特异性鉴别引物各1 μ L，加入双蒸水补齐至25 μ L。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于步骤幻中，所述PCR扩增反应条件为 94°C预变性5min ；94°C变性lmin，51°C退火45s，72 °C延伸2min，循环40次；72°C后延伸 7min，4°C 保存。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于步骤4)中，所述检测PCR反应结果的步骤为分别自4支PCR反应管中取5 μ L反应液加入1 μ L溴酚蓝溶液染色后，再将染色液加入 1. 0%琼脂糖凝胶梳孔，在TE缓冲液中电泳lh，取出，在紫外凝胶成像系统下拍照观察；结果在琼脂糖凝胶上，头花蓼药材在与Mark 300bp相对应位置，可见一条明亮的电泳带，而尼泊尔蓼药材在相同位置无任何条带出现。
全文摘要
本发明以贵州具有代表性的民族药头花蓼为研究对象，探索使用RAPD分析方法对头花蓼与尼泊尔蓼进行遗传多样性分析；并在RAPD的实验基础上，将RAPD方法转化为SCAR标记，为头花蓼与尼泊尔蓼的药材鉴定提供了准确可靠、快速稳定的方法。
文档编号C12Q1/68GK102296118SQ20111026322
公开日2011年12月28日 申请日期2011年9月7日 优先权日2011年9月7日
发明者周涛, 张丽艳, 李孟林, 梁斌, 江维克, 王尚华, 谢宇 申请人:贵州威门药业股份有限公司