2倍体积的-20°C-70°C无水己醇，轻轻混匀；在4°C，ISGOOiiM/min，离屯、5min 条件下，将沉淀用70%己醇溶液洗漆2次，风干，加100y1TE液溶解，低温保存。
[0018] 表1不同来源头花寥编号及采集地
2.头花寥基因组DNA纯度检测 应用紫外分光光度计检测不同来源头花寥样品的DNA纯度，测得吸光度数值(见表2): 表2不同来源头花寥DM纯度
表2所示，不同来源头花寥DNA浓度最高值为440yg/ml最低值为80yg/ml，A260最 高值为0. 048,最低值为0. 01。A280最高值为0. 035,最低值为0. 005。A260/A280比值在 1. 1-2. 0之间，所有样品达到PCR扩增标准。
[0019] 3.不同来源头花寥中rbcL/rDNA ITS序列的PCR扩增 将已达到PCR扩增标准的6个不同来源头花寥DNA样品，用rbcL序列通用引物进行PCR扩增，并对所获得的扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测。
[0020] 如图1所示，rbcL序列长度与marker条带相比，在900bp到lOOObp之间，条带无 拖尾，单一清晰，符合测序要求。
[002。将不同来源头花寥6个DNA样品用rDNA ITS序列通用引物对rDNA ITS序列PCR 扩增。
[002引如图2所示，PCR扩增产物条带与marker条带相比，ITS序列的长度都在 600bp-700bp到之间，电泳条带清晰单一，符合测序要求。
[0023] 4.改良CTAB法与传统SDS法、CTAB法提取头花寥DNA纯度对比 表3不同方法提取头花寥DNA纯度
表3所示，本发明改良CTAB法提取头花寥DNA中RNA、蛋白质杂质较传统SDS法、CTAB法中更少。因此，改良CTAB法提取头花寥DM纯度得到进一步提高。
[0024]W上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用W限制本发明，凡在本发明的精神和 原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种改良CTAB法提取头花寥DNA，其特征在于，包括如下步骤： 取材料，用液氮研成粉末，移入离心管，加入CTAB提取缓冲液，充分摇匀，并进行水浴、 离心； 取上清液，加入等体积的氯仿、异戊醇，取上清转移至另一离心管中，再次取上清液用 氯仿、异戊醇抽提； 将上清加入NaAc、异丙醇，轻轻颠倒混匀、离心，弃去上清液，用70%乙醇洗涤沉淀、离 心，用小枪头吸干乙醇，风干； 去除沉淀中的乙醇，用含RNA酶的TE溶解、消化至RNA完全裂解； 分别用等体积的苯酚、氯仿、异戊醇，各抽提一次； 将上清加入NaAc、冰冷无水乙醇，轻轻混匀、离心，沉淀用70%乙醇溶液洗涤，风干，加 TE液溶解，低温保存。2. 根据权利要求1所述一种改良CTAB法提取头花寥DNA，其特征在于，所述取材料，用 液氮研成粉末，移入离心管，加入CTAB提取缓冲液，充分摇匀，并进行水浴、离心步骤的具 体实现如下： 称取121. Ig Tris，溶于800ml水中，加入浓盐酸并在不断搅拌条件下，调节pH值至 8. 0,加入双蒸水至总体积为1L，分装并高压灭菌后4°C保存； 称取186. Ig EDTA-Na2，H20,加入900ml双蒸水，磁力搅拌器上搅拌，加入NaOH调节pH 值至8.0,加双蒸水定容至IL ; 称取 4g CTAB，加 100mL 双蒸水溶解，再加 20ml/L Tris-HCl (pH8. 0)，8ml， 0.5mol/L EDTA(pH8.0)，56m 15mol/L NaCl，加双蒸馏水至 200ml，室内保存； 取头花寥幼嫩叶片，_70°C的低温冰箱中保存备用，取冷冻头花寥材料2g，立即放入冰 冻过的研钵中，迅速在叶片上均匀撒上40-50mg的DIECA晶体，加入液氮后，快速研磨成粉 末状； 将粉末快速移入I. 5ml离心管，加入600 y I 65°C预热的CTAB提取缓冲液，充分摇匀， 65°C水浴60min，期间混匀10-15次。3. 根据权利要求1所述一种改良CTAB法提取头花寥DNA，其特征在于，所述取上清液， 加入等体积的氯仿、异戊醇，取上清转移至另一离心管中，再次取上清液用氯仿、异戊醇抽 提步骤的具体实现如下： 取上清液，加入等体积的氯仿：异戊醇，其中氯仿、异戊醇体积比为24:1，颠倒混匀 10-15次，取上清转移至I. 5ml离心管中，再次取上清液用氯仿：异戊醇抽提1次，其中氯 仿、异戊醇体积比为24:1。4. 根据权利要求1所述一种改良CTAB法提取头花寥DNA，其特征在于，所述将上清加 入NaAc、异丙醇，轻轻颠倒混匀、离心，弃去上清液，用70%乙醇洗涤沉淀、离心，用小枪头吸 干乙醇，风干步骤的具体实现如下： 称取24. 608g无水醋酸钠，加入双蒸水70ml加热至50-80°C溶解，再加入双蒸水定容至 100ml，高压灭菌20min，保存于4°C冰箱中备用； 将上清加入1/10体积3mol/L NaAc和2/3体积异丙醇，轻轻颠倒混勾，12000rpm/min， 离心5min，弃去上清液，用70%乙醇洗涤沉淀1次，12000rpm/min离心lmin，用小枪头吸干 乙醇，风干。5. 根据权利要求1所述一种改良CTAB法提取头花寥DNA，其特征在于，所述去除沉淀 中的乙醇，用含RNA酶的TE溶解、消化至RNA完全裂解步骤的具体实现如下： 去除沉淀中的乙醇，用700 yl含RNA酶（20μg/ml)的TE溶解，37°C消化2h以裂解 RNA06. 根据权利要求1所述一种改良CTAB法提取头花寥DNA，其特征在于，所述分别用等 体积的苯酚、氯仿、异戊醇，各抽提一次步骤的具体实现如下： 分别用等体积的苯酷：氯仿：异戊醇，氯仿：异戊醇，在4°C，12000rpm/min，5min条件下 各抽提一次，其中苯酚、氯仿、异戊醇体积比为25 :24 :1，氯仿、异戊醇体积比为24 :1。7. 根据权利要求1所述一种改良CTAB法提取头花寥DNA，其特征在于，所述将上清加 入NaAc、冰冷无水乙醇，轻轻混匀、离心，沉淀用70%乙醇溶液洗涤，风干，加TE液溶解，低温 保存步骤的具体实现如下： 将上清加入1/10体积3mol/L NaAc和2倍体积的-20°C -70°C无水乙醇，轻轻混匀； 在4°C，12000rpm/min，离心5min条件下，将沉淀用70%乙醇溶液洗绦2次，风干，加 IOOyl TE液溶解，低温保存。
【专利摘要】本发明涉及一种改良CTAB法提取头花蓼DNA，包括如下步骤：取材料，用液氮研成粉末，移入离心管，加入CTAB提取缓冲液，充分摇匀，并进行水浴、离心；取上清液,加入等体积的氯仿、异戊醇，取上清转移至另一离心管中，再次取上清液用氯仿、异戊醇抽提；将上清加入NaAc、异丙醇，轻轻颠倒混匀、离心，弃去上清液，用70%乙醇洗涤沉淀、离心,用小枪头吸干乙醇，风干；去除沉淀中的乙醇，用含RNA酶的TE溶解、消化至RNA完全裂解；分别用等体积的苯酚、氯仿、异戊醇，各抽提一次；将上清加入NaAc、冰冷无水乙醇，轻轻混匀、离心，沉淀用70%乙醇溶液洗涤，风干，加TE液溶解，低温保存。本发明采用改良CTAB法提取头花蓼DNA，方法简单、成本低廉，提取的头花蓼DNA纯度更高。
【IPC分类】C12N15/10
【公开号】CN104988137
【申请号】CN201510430334
【发明人】何翠, 马海东
【申请人】重庆医科大学附属永川医院
【公开日】2015年10月21日
【申请日】2015年7月22日