快速低成本制备DNA Ladder的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及植物基因工程领域，尤其是一种快速低成本制备DNA Ladder的方法。
【背景技术】
[0002]DNA ladder是一组已知大小和浓度的DNA片段混合样品，可以与未知的DNA样品一起进行凝胶电泳用于初略指示其分子量与浓度，是分子生物学实验常用的试剂耗材之
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早期的DNA ladder是使用限制性内切酶(如ECOR I或者Hind ΠΙ等)酶切λ噬菌体的基因组DNA或猴病毒细菌的质粒DNA片段而获得大小不同的DNA片段。这种方法的人力、物力以及仪器维护成本特别高，并且产生DNA片段的大小常常受到限制性酶切位点的限制，不能人工调控DNA ladder的片段大小和浓度。
PCR能够快速有效地获得大量目标片段，并且在合适的范围(100bp-3000bp)内可通过引物设计高效廉价的获取任意大小的片段，通过将含有目标大小片段构建到PMD18-T载体上，利用载体上的通用引物分别对每个片段进行PCR扩增，DNA ladder的每一个DNA片段再按照设计好浓度进行稀释与混合，最终快速廉价的制备大小、浓度均可控的DNA ladder。
【发明内容】
[0003]本发明的目的是:提供一种快速低成本制备DNA Ladder的方法，它解决了传统酶切方法成本高、获得DNA片段大小与浓度不可控制的难题，以克服现有技术的不足。
本发明是这样实现的:快速低成本制备DNA Ladder的方法，根据DNA Ladder所需要的条带大小，从已知基因组序列中选取目标大小的DNA序列，采用设计好的引物进行PCR进行扩增，切胶回收后将不同大小的条带分别构建到PMD18-T载体，并提取质粒，获得各个片段的模板；测定各纯化后的目的片段的浓度，按照设计好的浓度进行混合与稀释，得到最终DNA ladder。
将每个DNA片段的扩增产物进行纯化具体是:利用pMDlS-Τ载体上的通用引物M13F与M13R，分别对每一个目的片段进行扩增，通过脱盐纯化PCR产物，获得各目的片段，利用10 X TE缓冲液溶解，，可以长期保存。
PCR能够快速有效地获得大量目标片段，并且在合适的范围(100bp-3000bp)内可通过引物设计高效廉价的获取任意大小的片段，
由于采用了以上技术方案，本发明通过PCR扩增的方法获得DNA Ladder所需要的条带，所有条带的大小和浓度都可以精确控制，不受传统方法(如EcoR I酶切λ DNA)受酶切位点和质粒浓度的限制，生产成本能降低90% ;再通过将含有目标大小片段构建到pMD18-T载体上，利用载体上的通用引物分别对每个片段进行PCR扩增，DNA ladder的每一个DNA片段再按照设计好浓度进行稀释与混合，最终快速廉价的制备大小、浓度均可控的DNAladder。解决了传统酶切方法成本高、获得DNA片段大小与浓度不可控制的难题。而采用本发明方法制造的DNA ladder清晰度与指示效果与商用DNA ladder基本相当，可以代替商用DNA ladder使用。本发明方法简单，易于实施，成本低廉，使用效果好。
【附图说明】，
图1为本发明的流程示意图；
图2为本发明的制备DNA ladder与商用DNA ladder的对比图。
【具体实施方式】，
本发明的实施例:快速低成本制备DNA Ladder的方法步骤一、TlOO?T3000模板的克隆与构建
在Tair数据库中检索挑选合适长度的DNA序列，设计扩增引物，以拟南芥幼嫩花cDNA为模板进行PCR扩增，从拟南芥基因组中克隆3000bp、2000bp、1500 bpUOOO bp,750 bp、500 bp,300 bp、100bp 的 DNA 片段，引物组合依次为(DLF+3000R，DLF+2000R，DLF+1000R，DLF+750R，DLF+500R，DLF+300R，DLF+100R)其对应扩增引物序列见序列表，并分别构建到PMD8-T载体，分别命名为T-100?T3000 ;挑选出阳性克隆，并用质粒提取试剂盒(上海生工)制备阳性质粒，具体操作参考示意图1，序列信息见序列表。
步骤二、T100?T3000快速扩增与纯化
采用pMD8-T载体上公用引物M13F和M13R分别对T100?T3000的进行扩增，采用氯仿乙醇纯化方法进行脱盐处理，用10XTE buffer溶解，获得浓度大、纯度高可以长期保存的各个DNA目的片段。
(1)配置PCR反应混合物(上海生工2X Taq PCR反应试剂盒):
2 X Taq PCR Mixture10 μ I
正向引物 Μ13 F (10μΜ ) I μ I 反向引物 Μ13 R (10μΜ) I μ I 质粒 DNA (lOng/μ I) 2 μ I dd H2O6 μ I
每个不同大小的DNA片段分别配制10份。
(2)进行PCR反应，反应的时间和温度如下:
94°C 3min
94°C 30s，
58°C 30s?3min (根据目标片段长度，I Kb/min)
72°C 30s，40cycles72 °C 5min
(3)纯化与溶解:
分别将每个DNA片段的扩增产物收集到一起，加入200 μ I氯仿(国药)，剧烈振荡30s，室温放置5min，12000g，4°C，离心lOmin，取上清至新管中，加入500 μ I无水乙醇，混勾后-20°C放置 20min，12000g，4°C，离心 lOmin，去上清，加入 Iml 75% 乙醇，10000g，5min，4°C，离心 lOmin，去上清，空气干燥 15min，加 50 μ I 10 X TE buffer 50_60°C溶解 5min ;取I μ I稀释10倍，测定浓度备用。
步骤三、DNA ladder的混合与检测
按照DNA ladder所需要的浓度，用10XTE buffer稀释混合每一个DNA片段；加入溴酚蓝使终浓度为lg/L ;取5 μ I与商用DNA ladder 一起电泳，如图2所示，采用本发明制备的DNA ladder与商用DNA ladder效果相当。
本发明所述并不限于【具体实施方式】中所述的实施例，本领域技术人员根据本发明的技术方案得出其他的实施方式，同样属于本发明的技术创新范围。显然本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术范围内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
【主权项】
1.一种快速低成本制备DNA Ladder的方法，其特征在于:根据DNA Ladder所需要的条带大小，从已知基因组序列中选取目标大小的DNA序列，采用设计好的引物进行PCR进行扩增，切胶回收后将不同大小的条带分别构建到PMD18-T载体，并提取质粒，获得各个片段的模板；采用载体上公用引物大量扩增获得个目的片段，测定其浓度，按照设计好的浓度进行混合与稀释，得到最终DNA ladder。2.根据权利要求1所述的快速低成本制备DNALadder的方法，其特征在于:将每个DNA片段的扩增产物进行纯化具体是:利用pMD18-T载体上的通用引物M13F与M13R，分别对每一个目的片段进行扩增，通过脱盐纯化PCR产物，获得各目的片段，利用10 X TE缓冲液溶解。
【专利摘要】本发明提供了一种快速低成本制备DNA Ladder的方法。本发明通过PCR扩增的方法获得DNA Ladder所需要的条带，所有条带的大小和浓度都可以精确控制，不受传统方法（如EcoR I 酶切λ DNA）受酶切位点和质粒浓度的限制，生产成本能降低90%；再通过将含有目标大小片段构建到pMD18-T载体上，利用载体上的通用引物分别对每个片段进行PCR扩增，DNA ladder的每一个DNA片段再按照设计好浓度进行稀释与混合，最终快速廉价的制备大小、浓度均可控的DNA ladder。解决了传统酶切方法成本高、获得DNA片段大小与浓度不可控制的难题。而采用本发明方法制造的DNA ladder清晰度与指示效果与商用DNA ladder基本相当，可以代替商用DNA ladder使用。
【IPC分类】C12N15/10, C12Q1/68
【公开号】CN104988134
【申请号】CN201510265744
【发明人】李小冬, 于二汝, 舒健虹, 王小利, 莫本田, 蔡一鸣, 吴佳海
【申请人】贵州省草业研究所
【公开日】2015年10月21日
【申请日】2015年5月24日