同时的化学疗法和免疫疗法的制作方法

专利名称：同时的化学疗法和免疫疗法的制作方法
技术领域：
本发明涉及癌症免疫疗法的领域。特别地，其涉及对肿瘤 疫苗的增强的应答。发明背景
尽管有广泛手术切除、大剂量集中放射性疗法和化学疗法， 被诊断患有GBM的患者在诊断后的平均存活时间小于15个月(Stupp等， Optimal role of temozolomide in the treatment of malignant gliomas ，Cmr Neurol N画sci Rep. 2005年5月；5(3):198-206)。治疗的失败至 少可被部分归因于相对较窄的治疗指数，以至于增大剂量的尝试导致 剂量限制的全身或神经性毒性。虽然免疫疗法的使用很有希望成为这 些肿瘤的潜在治疗方式，但是直到最近，几乎没有显示出临床效力。 若干用选定患者进行的临床实验，包括用树突细胞(DCs)及酸洗脱的肤 (Ashkenazi 等，A selective impairment of the IL-2 system in lymphocytes of patients with glioblastomas: increased level of soluble IL-2R and reduced protein tyrosine phosphorylation ，Neuroimmunomodulation. 1997; Kolenko等，Tumor-induced suppression of T lymphocyte proliferation coincides with inhibition of Jak3 expression and IL-2 receptor signaling: role of soluble products from human renal cellcarcinomas. J Immunol. 1997年9月15日；159(6):3057-67; Liau等， Dendritic cell vaccination in glioblastoma patients induces systemic and intracranial T-cell responses modulated by the local central nervous system tumor microenvironment. Clin Cancer Res. 2005年8月1日；11(15): 5515-25)或抗原特异性肽(Heimberger AB, Archer GE等，Dendritic cells pulsed with a tumor-specific peptide induce long-lasting immunity and are effective against murine intracerebral melanoma. Neurosurgery. 2002年1 月；50(1):158-64;讨论164-6)接种神经胶质瘤患者，己经通过提高平 均存活时间到20-31个月的范围显示出希望。而且，在最近完成的使用 抗原特异性免疫治疗方法的II期临床试验中，GBM患者病情发展的时 间(time to progression (TTP))被延迟到15个月，这与具有7个月TTP 时间(Stupp等，2005，上文)和平均生存时间为29个月(Heimberger 等，J Transl Med. 2005年10月19日；3:38 The natural history of EGFR and EGFRvIII in glioblastoma patients)的包含放射性疗法和替莫唑胺 (temozolomide)的护理标准明显形成对照。总之，这些免疫疗法实验 说明尽管恶性神经胶质瘤患者有内在的免疫抑制，但是仍然能够产生 有效的免疫应答。然而，考虑到最近建立的护理标准和总体较差的预 后，不使用某些形式的化学疗法治疗GBM患者是勉强的。
在本领域内，有开发出通常地治疗肿瘤和特别地治疗胶质 母细胞瘤的更好的方法的持续需求。发明概述
提供了一种治疗受治疗者肿瘤的方法。给予受治疗者治疗 有效量的EGFRvIII肽和治疗有效量的、引发淋巴细胞减少症的化学治 疗剂。
根据另一个实施方式，提供了一种治疗受治疗者体内肿瘤 的方法。治疗有效量的与KLH结合的EGFRvIII肽被给予患有肿瘤的 受治疗者。粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(Granulocyte/macrophage colony stimulating factor (GM-CSF))作为佐剂，也以有效量与EGFRvIII 肽同时给予受治疗者。治疗有效量的烷化剂也给予受治疗者。
根据其它另一实施方式，提供了一种治疗受治疗者肿瘤的的替莫唑胺或其药物上 可接受的盐被给予受治疗者。
根据另一实施方式，提供了一种治疗受治疗者肿瘤的方法。 治疗有效量的抗肿瘤疫苗和治疗有效量的，引发淋巴细胞减少症的化 学治疗剂被给予受试者。
这些以及其它在本领域普通技术人员阅读本说明书后明了的实施方式为本领域提供了治疗难以治疗的肿瘤的方法。 发明详述
由于担心化学疗法引起的淋巴细胞减少症会抵消免疫疗法 的治疗效力，化学疗法和免疫疗法的同时施用被认为是不当的。替莫 唑胺对患有恶性神经胶质瘤的患者已经显示出有效的化学治疗，而使 患有胶质母细胞瘤的患者丧失这种试剂以便用免疫疗法治疗是有争议 的。尽管有传统的教条，发明人演示了化学疗法和免疫疗法能够被同 时给予而不抵消免疫疗法的效力。事实上，替莫唑胺引发的淋巴细胞 减少症实际可与肽疫苗协同作用。尽管申请人不希望被特定的有关作 用机理的理论所限制，观察到的协同可能从属于调节性T细胞(Tregs) 的抑制或Tregs恢复的失败，这允许效应物(effector)细胞毒性 (cytotoxic) CD8+T细胞增加。可能也涉及其它机理。
"EGFRvIII"或"表皮生长因子受体突变体III (Epidermal Growth Factor Receptor mutation III)"是表皮生长因子受体的已知突变 形式。见，例如美国专利号6,503,503;也参见美国专利号6，900，221; 6,673,602; 6,479,286禾[]6,129,915。引起vIII蛋白产生的突变体通常由 801对碱基对从胞外域一致的和肿瘤特异性的符合读码框的缺失来表 征，所述缺失将一个密码子分开并在融合点产生一个新的甘氨酸。
"EGFRvIII肽"用在此处是指合适长度的肽，如至少10 个或12个氨基酸，以及达到16个、20个或30个氨基酸或更多，该肽 跨过对应EGFRvIII蛋白的突变剪接点。例子包括但不限于 H-LEEKKGNYWTDHS-OH或"PEP-3"。所述EGFRvIII肽可能来自(或 在序列上对应于)任何哺乳动物物种的EGFRvIII,但是优选的是人类。 特定的野生型EGFR序列在SEQ ID NO:6到9中显示。
"载体蛋白"用在这里是指与在该物种中发现的，接受本发明所述组合物并引起免疫应答的蛋白不具有高同源性的蛋白。按照 用于比较两个氨基酸序列的已知数学算法确定， 一种蛋白与另一蛋白如果至少75%相同，更优选地至少85%相同或至少90%相同，那么该 蛋白与另一蛋白具有高同源性(参见，例如Karlin and Altschul ， 1990， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264-2268; Karlin和Altschul, 1993， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5877; Torellis和Robotti， 1994， Comput Appl. Biosci. 10: 3-5;及Pearson禾口 Lipman， 1988， Proc. Natl. Acad. Sci. 85:2444-8)。优选地，两个氨基酸序列的相同百分数用XBLAST程序， 得分=50，字长=3，由BLAST蛋白质搜索确定。异源载体蛋白的例子 包括，但不限于KLH， PhoE， mLT， TmT或来自BhV-1病毒的gD。 参见，例如美国专利号6,887,472。这些载体蛋白可能根据已知技术直 接或通过一个间插接头片段(intervening linker segment),如一个或多 个(如2个、4个、6个)间插氨基酸(如间插半胱氨酸(CYS)残基) 的链，与肿瘤抗原结合(conjugated)或连接(linked)。
"KLH"或"匙孔血蓝蛋白(keyhole-limpet hemocyanin)" 是一种已知的载体蛋白，其可根据已知技术与另一种蛋白结合。参见 如美国专利号6,911,204。
"佐剂"用在此处是指增强与佐剂同时给药的疫苗治疗效 力的不同种类化合物中的任何一种。在一些实施方式中，所述佐剂是 造血细胞生长因子，如GM-CSF。常见的佐剂的例子包括但不限于氢 氧化铝、磷酸铝或氧化铝；基于例如矿物油的水包油型或油包水型乳 剂，如Bayol Fo或Marcol 52TM，或植物油的水包油型或油包水型乳 齐IJ，如醋酸维生素E、皂草甙(saponins)、卡介菌(BCG)、 M vaccae 、 破伤风类毒素(Tetanus toxoid)、白喉类毒素(Diphtheria toxoid)、百 日咳博德特氏菌(SoW&e〃G/^加^s)、白细胞介素2、白细胞介素12、 白细胞介素4、白细胞介素7、完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂和非特 异性佐剂。参见，例如美国专利号6，699，483。
"造血细胞生长因子(hematopoietic growth factors)"或 "HGFs"已公知。参见，例如美国专利号6,863,885。通常，HGFs是 调控造血祖细胞(hematopoietic protenitor cells)增殖和分化的糖蛋白子)、GM-CSF (粒细胞/巨噬细胞 集落刺激因子)、IL-1 (白细胞介素-l)、 IL-3、 IL-6、 IL-8、 IL陽ll、 IL-12、 LIF (白血病抑制因子)、FGF-P (成纤维细胞生长因子P)、 FLT-3或它 们组合的种类。这些生长因子可以购买(如，R&D Systems,Minneapolis, MN)或按照通常在本领域内和在描述这些因子的文献中所述的步骤制 备。此外，所述造血细胞生长因子可以是该因子的修饰形式或选自 GCSF、 SCF、 GM-CSF、 IL陽I、 IL-3、 IL-6、 IL-8、 IL-ll、 IL-12、 LIF、 FGF-卩的造血细胞生长因子的融合蛋白。HGFs包括修饰的生长因子 (如，突变蛋白)和融合蛋白，其可按照本领域已知方法制备。参见， 例如(Samb腦k等，《分子克隆实验室手册(Molecular Cloning: A Laboratory Manual)》，第2版，冷泉港实验室，冷泉港，纽约，1989)。 刺激巨噬细胞功能的造血细胞生长因子，如GM-CSF，是特别优选的。 这些可以被用作佐剂。
"外束放射疗法(external beam radiotherapy)"可以通过输 送一束高能量x射线到患者的肿瘤部位而进行。所述射线束在患者体 外产生并靶向肿瘤部位，患者体内没有置入放射源。该方法可与根据 本发明的任何其它治疗步骤结合使用。
"治疗"用在此处是指给予患有疾病或有发生疾病风险的 受治疗者益处的治疗或预防手段，包括受治疗者状况的改善(如，一 种或多种症状)，延缓病情的进展，延缓症状的发生或减慢症状的发展 等。就这一点而言，术语"治疗"也包括对受治疗者预防疾病的处理 以防止症状的发生。
用在此处，"治疗"和"预防"不意欲表示症状的治愈或完 全去除。而是指给予患有疾病的患者益处的任何类型的治疗，包括患 者状况的改善(如， 一种或多种症状)，延缓疾病的发展等。
"治疗有效量"用在此处表示足以对患有癌症，如胶质母 细胞瘤的患者产生希望效果的抗体的量，所述希望的效果包括患者状 况的改善(如， 一种或多种症状)，延缓疾病的进展等。
需要以本文描述的方法治疗的受治疗者包括患有胶质母细 胞瘤或星形细胞瘤的受治疗者，以及患有其它实体肿瘤(solidtumor)或癌症，如肺癌、结肠癌、乳腺癌、脑瘤、肝癌、前列腺癌、脾脏肿 瘤、肌肉肿瘤、口腔癌、胰腺癌、头部和颈部肿瘤、皮肤癌(包括黑 色素瘤)等的受治疗者。需要治疗的受治疗者特别地包括患有表达 EGFRvIII的肿瘤，如脑瘤的患者。所述肿瘤可以是原发性肿瘤，转移 性肿瘤或再发性肿瘤。由本发明所述方法治疗的受治疗者特别地包括患有表达EGFRvIII的肿瘤，包括神经胶质瘤、纤维肉瘤、骨肉瘤、黑 色素瘤、维尔姆斯瘤(Wilms tumor)、结肠癌、乳腺和肺癌，以及鳞状 细胞癌的受治疗者。由本发明所述方法治疗的受治疗者最特别地包括 患有脑瘤或脑癌的受治疗者，如胶质母细胞瘤，特别是多形性胶质母 细胞瘤(glioblastoma multiforme )和囊性星形细胞瘤(cystic astrocytoma)。
本发明主要关于人类受治疗者的治疗，包括男性和女性受 治疗者，以及新生儿、婴幼儿、少年、青年、成人和老年人受治疗者， 但是本发明也可以出于兽医目的，以及药物筛选和药物开发的目的， 在动物受治疗者中进行，特别是哺乳动物受治疗者，如小鼠、大鼠、 狗、猫、，家畜和马。
本发明所述的药物组合物可以根据已知技术进行制备。通 常，活性试剂被包含在药物可接受载体中。各种水性载体可被使用， 如水、缓冲的水、0.9%的盐水、0.3%甘氨酸、透明质酸等。这些组合 物可以用常规，公知的灭菌技术灭菌或无菌过滤。生成的水性溶液可 以按原样或冻干包装以待使用，所述冻干制备物在给药前与无菌溶液 结合。所述组合物可按照接近生理条件的要求包含药物可接受辅助物 质，如缓冲剂、渗透压调节试剂、润湿剂等，例如醋酸钠、乳酸钠、 氯化钠、氯化钾、氯化钙、去水山梨糖醇月桂酸酯、油酸三乙醇胺等。
本发明所述的组合物及方法可包括给予一种或多种辅佐剂 (co-adjuvant)。合适的辅佐剂包括但不限于(1)铝盐(明矾)，如氢 氧化铝、磷酸铝、硫酸铝等；(2)水包油乳剂制剂(含有或不含特定的 免疫刺激剂(immunostimulating agent)，如胞壁肽(见下文)或细菌的 细胞壁组分)，例如，如(a)含有5%三十碳六烯、0.5%Tween 80和0.5% Span 85配制成亚微米颗粒的MF59(PCT公开号WO 90/14837)， (b)含 有10%三十碳六烯、0.4%Tween80、 5%聚丙二醇与环氧乙烷的加聚物阻断的(pluronic-blocked)聚合物L121以及微气化为亚微米乳剂或振 荡产生较大颗粒尺寸乳剂的thr-MDP (见下文)，禾Q(c) RibiTM佐剂系 统(RAS) (Ribilmmunochem， Hamilton, MT.)，含有2°/。三十碳六烯、 0.2%Tween 80和一种或多种细菌的细胞壁组分，所述细菌的细胞壁组 分选自包含单磷脂(mon叩hosphorylipid) A (MPL)、海藻糖二霉菌酸 酯(trehalose dimycolate) (TDM)和细胞壁骨架(CWS)的类别，优 选地为MPL+CWS (DetoxTM)(此处使用的合适的亚微米水包油乳剂 的进一步讨论参见1999年6月24日公开的PCT公开号WO 99/30739); (3)皇草武佐齐U，如StimulonTM(Cambridge Bioscience, Worcester, MA) 可被使用，或由此产生的颗粒，如ISCOMs (免疫激励复合物)；(4)完 全弗氏佐剂(CFA)和不完全弗氏佐剂(IF A); (5)细胞因子，如白 细胞介素(IL-1、 IL-2等)，巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)，肿瘤坏 死因子(TNF)等；(6)细菌ADP-核糖化毒素，如霍乱毒素(CT)、 百日咳毒素(PT)或大肠杆菌不耐热肠毒素(LT)的去毒突变体，特 别是LT-K63 (其中野生型第63位的氨基酸被赖氨酸取代)、LT-R72 (其 中野生型第72位的氨基酸被精氨酸取代)、CT-S109(其中野生型第109 位的氨基酸被丝氨酸取代)、由CpG家族分子衍生的佐剂、包含CpG 基序的CpG 二核苷酸和合成的寡核苷酸(见，如Krieg等，Nature, 374:546 (1995)禾口 Davis等，J. Immunol" 160:870-876 (1998))和 PT-K9/G129 (其中野生型第9位的氨基酸被赖氨酸取代且第129位被 甘氨酸取代)(参见，例如PCT公开号WO 93/13202和WO 92/19265); (7)可发挥免疫刺激剂功能以增强组合物效力的其它物质。参见，例如 美国专利号6，534，064;以及(8)除CpG和RIBI佐剂外，Toll样受体的 其它配位体，如细菌鞭毛蛋白(CD4+T细胞的有效佐剂；见IJ Immunol. 169: 3914-9 (2002年10月))。
活性试剂可通过任何医学上合适的程序给药，如常规静脉 注射或动脉内给药，注射进脑脊髓液。在某些情况下，皮内、腔内、 鞘内，或向肿瘤或向为肿瘤供养的动脉直接给药是有利地。在肿瘤或 其一部分先前被手术切除的地方，治疗试剂可通过直接注射或通过预 选植入的蓄积处向肿瘤部位(并且特别地向肿瘤部位的封闭腔或"切 除腔")给药。
其中，活性试剂的剂量将取决于受治疗者的状况，要治疗 的肿瘤的特定类别或类型，给药途径，使用的治疗试剂的性质，以及 该肿瘤对特定治疗试剂的敏感性。
—般来说，诸如EGFRvIII肿瘤抗原或疫苗的剂量，包括任 何载体蛋白或结合于其上的肽，为每剂每位受治疗者IO、 100或500pg 至U2-3mg。药剂可以一次给予，任选地包含追加或"促进"药剂(如， 一、二或三次追加或"促进"剂量以1到3周的间隔给予)。应该注意， 如果需要，药剂可以分开，如在不同的注射部位给药，以降低诸如局 部反应的副作用。在制剂包含连接(或"结合")有载体蛋白的肿瘤抗 原和没有载体蛋白的肿瘤抗原时，计算的剂量可以包括连接和自由的 肿瘤抗原以及载体蛋白。
—般来说，诸如GM-CSF的佐剂的剂量也为每位受治疗者 10或20昭到500吗，或l或2mg，以与肿瘤抗原的药剂相同或不同的 时间表给药。当以相同的时间表给药时，佐剂可以用与肿瘤抗原相同 的载体给药。当未在相同的载体中结合时，佐剂的剂量仅需要以与肿 瘤抗原的剂量足够接近的时间给药，以增强它的效力(如，在一或两 小时内；在同一天等)。
用于实现本发明的垸化剂包括(但不限于)1,3-双(2-氯乙 基)-l-亚硝基脲(BCNU)和四嗪衍生物，特别是[3H]咪唑并[5,l-d] 1，2，3,5-四嗪-4-酮衍生物，如替莫唑胺及其类似物(包括药物上可接受 盐及其前体药物(prodrug))。这样的化合物是公知的。参见，例如美 国专利号6,096,724; 6,844,434禾n 5,260,291。用于实现本发明的烷化剂 的例子包括[3H]咪唑并[5，l-d] 1，2，3,5-四嗪-4-酮烷化剂，特别是具有以 下通式的那些烷化剂
其中W代表氢原子，或含有多至6个碳原子的直链-或支链的烷基、烯基或炔基基团，每个这样的基团未被取代或被一个到三 个选自卤素(即，溴、碘，或优选地氯或氟)原子，含有多至4个碳 原子的直链或支链垸氧基(如，甲氧基)、烷基硫代、烷基亚硫酰基和 烷基磺酰基，以及任选地取代苯基的取代基取代；或R'代表环烷基，且RM戈表可能携带氮原子的氨基甲酰基团，选自直链或支链烷基和烯 基的含有多至4个碳原子的一个或两个基团，以及环烷基，如甲氨基 甲酰或二甲基氨基甲酰基团。当符号R'代表被两个或三个卤素原子取 代的垸基、烯基或炔基基团时，前述卤素原子可以相同或不同。当符 号R'代表被一个、两个或三个任选地取代苯基取代的烷基、烯基或炔 基基团时，苯环上任选的取代基可以选自例如，含有多至4个碳原子 的烷氧基和烷基基团(如，甲氧基和/或甲基)及硝基；符号W可代表 例如，苯甲基或对甲氧基苯甲基。符号R'和W定义的环烷基含有3 到8个，优选地6个碳原子。当R'为H时，所述化合物可能以盐或前 体药物，特别是碱金属盐的形式提供。见，例如美国专利号5，260，291。
替莫唑胺，以5mg、 20mg、 100mg和250mg胶囊的口服剂 量形式，可以从美国新泽西州Kenilworth， 07033，的Schering公司以 TEMOD ARtm的名称购买。
烷化剂可以在含有肿瘤疫苗，如EGFRvIII肽，的相同或不 同的制剂中，用上述相似的方式制备成药物上可接受制剂。
在优选的实施方式中，所述烷化剂可以每日剂量3、 4、 5、 6或7天连续的循环给药。适当的每日剂量可以从每剂50、 100或 150mg/m2直到每剂200、 250或300 mg/m2。该循环可以重复，如每两 周、每三周、每四周或五周，直到总数为6、 8或IO个循环。烷化剂 在第一循环中的第一剂可以在任何适当的时间点给药。在一些实施方 式中，第一剂烷化剂在给予治疗抗体2周或4周之前给药；在一些实 施方式中，第一剂烷化剂在给予治疗抗体2周、4周或6周后给药。在 额外治疗，如外束放射疗法，也应用于受治疗者时，也可包括额外的 给药时间表。
任选地，受治疗者可能也接受外束放射疗法。举例来说， 外束放射疗法可用于脑瘤，如胶质母细胞瘤。外束放射疗法已公知并 可按照已知技术进行。光束可通过合适的方式产生，包括医用直线加速器(medical linear accelerator)和钴60外束单元。放射源可被安装于 围绕患者旋转的桶架(gantry)中，以便从不同方向辐射患者体内的目 标区域。辐射前，治疗通常使用能模拟放射线束并允许医务人员设计 放射疗法的算法来在计算机上计划。可用于实现本发明的外束疗法的 多种变化对本领域普通技术人员是明显的。参见，例如美国专利号 6,882,702; 6,879,659; 6,865,253; 6,863,704; 6,826,254; 6,792,074; 6,714,620禾Q 5,528,650。
外束疗法优选地按照已知技术以一系列过程施用，所述过 程优选地在给予治疗抗体两周到四周后开始。例如，外束放射疗法可 以在4、 5、 6或7周的时间段内，以每日0.5或lGy到2或3Gy的剂 量， 一周施用3、 4、 5、 6或7天，直到施用总期望剂量(如30或40Gy 到50或60Gy)。
输送的剂量可以到达包括围绕肿瘤，或在肿瘤或其一部分 以前被手术切除的地方，环绕肿瘤部位的正常组织边缘的区域(如， 在每个方向上约l、 2或3cm边缘)。
在使用外束放射性疗法的地方，患者可以稍微低一点的剂 量，在放射性疗法的过程中，接受不同于上述的额外的化学治疗剂给 药的时间表。例如，患者可在外束疗法的过程中以每日每剂25或 50mg/n^到100或125mg/m2的量接受每日剂量的化学治疗剂，如烷化 剂。
可用作抗肿瘤疫苗的肿瘤抗原的例子包括但不限于细胞周 期蛋白依赖激酶4; |3-联蛋白(卩-catenin);胱天蛋白酶(Caspase-8); MAGE-I; MAGE-3;酪氨酸酶；表面Ig独特型(idiotype); Her-2/neu 受体；MUC-I; HPVE6禾卩E7; CD5独特型CAMPATH-1， CD20;细 胞表面糖蛋白CEA，粘蛋白-l(mucin- 1);细胞表面碳水化合物Lewis、 CA- 125;表皮生长因子受体；pl85HER2; IL-2R; FAP-a;生腱蛋白(Tenascin);以及金属蛋白酶。EGFRvIII是肿瘤特异性抗原的典型。 表达这些抗原的细胞也可用作疫苗。优选地，细胞在给药前被灭火。 所述细胞可以被分层以便富含该肿瘤抗原的部分被用作疫苗。这些抗 原只不过是典型的并非意欲囊括本领域公知或可用的多种有用抗原。
多个临床前模型系统己经显示免疫细胞子集的耗尽会抵消若干类型的免疫治疗方法的效力(Hdmberger等，2003)，这表明在免 疫疗法的效应期施用的化学疗法可能对其效力有害。但是，这并不排 除在恰当安排时间时一起使用这些试剂以将前述效果减到最小。而且， 尽管申请人不希望被任何涉及作用机理的理论所限，诸如Tregs的某些 效应细胞的耗尽可能是产生较好免疫疗法效力的化学疗法的最希望结 果，或可能促进足以控制肿瘤的所期望细胞因子的分布。
上面的公开一般地描述了本发明。在此公开的所有参考文 献均明确引入作为参考。通过参考以下特定的实施例可以获得更完整 的理解，以下的实施例在此仅以示例的目的提供，并非意欲限制本发 明的范围。实施例1
为了测试化学疗法和免疫疗法可以同时给予的这一假设， 我们使用护理标准，替莫唑胺，同时也给予靶向表皮生长因子变体III (EGFRvIII)的肽疫苗(Heimberger等，2006)治疗新诊断出患有GBM 的患者。导致一种跨膜酪氨酸激酶受体(Ekstrand等，1991) EGFR过 量表达的表皮生长因子受体(EGFR)基因的扩增与突变的EGFR基因， EGFRvIII相关(Wikstrand等，1997)。先前的工作已经显示出EGFR 的扩增在所有表达EGFRvIII的GBM患者中是明显的(Heimberger等， 2005)，并且缺乏扩增EGFR的GBM患者在EGFRvIII蛋白上不呈阳 性(Aldape等，2004)。
2005年5月， 一位51周岁高加索男性在抱怨三周持续早间 头痛而没有相关恶心症状后被检査。磁共振(MR)影像显示在右颞叶 的前面观中有一处多小叶(multi-lobular)，不规则增强的病变，大小为 6.6X5.3X4.3。大脑外侧裂向上拱起并且有6mm的中线移位。该患者 进行了肿瘤全切除，其组织学显示二相胶质母细胞瘤(hiphasic glioblastoma)和恶性肿瘤。这些组分由胶质母细胞瘤组分中胶质纤维 星形细胞蛋白(glial-fibrillary astrocytic protein) (GFAP)和恶性肿瘤中 足量网状菌素产物的阳性免疫组化确认。三色染色确认肿瘤的二相性 质。EGFR-528和EGFRvIII抗体免疫组化染色呈阳性(Heimberger等， 2005)， EGFRvIII染色显示强烈的扩散反应性，而EGFR-528染色更集中。PTEN呈强烈阳性并且p53反应性在多于30。/。的肿瘤细胞核中存在。 甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(MGMT) DNA修复基因被甲基化(Hegi 等，2005)。
手术后，该患者以30个部分进行常规的6000cGy外束放射 性疗法。在放疗过程中以75mg/n^的量同时给予替莫唑胺(Stupp等， 2005)。在放疗结束时采集的MR影像没有变化并且显示没有明显的发 展。出于免疫监测的目的，该患者随后接受白细胞除去法以获得足够 的细胞。在6周的间隔中(引导期)，该患者每两周接受三次与匙孔血 蓝蛋白(KLH ) 以 1:1 比例 (w/w ) 结合的 PEPvIII-3 (LEEKKGNYWTDHC) (PEPvIII-KLH)(每次免疫500昭)及粒细胞 -巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)(每次免疫142pg)的皮内(i.d.) 注射。之后，出于免疫监测的目的，他接受第二次白细胞除去法。这 时，该患者在l-5天开始了 150mg/n^替莫唑胺的维持周期。从每个周 期的第19天开始，每隔一天监测全部血球数，直到有白细胞数最低点 恢复的证明。在最低点恢复时，该患者接受皮内注射疫苗，通常在他 28天周期中的第23天(范围是19-25天)。实施例2
在开始使用疫苗前，第三次疫苗后及每月在他的维持周期 的第26天，对常见回忆抗原(recall antigen)和该疫苗的组分进行迟 发型超敏性测试(DTH)的评估。开始使用疫苗前及完成辐射和同时使用替莫唑胺后，该患者仅对念珠菌(a^&v^)有反应并且对该疫苗 的组分，PEPvIII或KLH，没有DTH反应。但是，在第三次接种疫苗 后，该患者对该疫苗的KLH组分有反应。第十次接种疫苗后以及接受 同时的替莫唑胺时，他对该疫苗的PEPvIII组分有反应。为了比较，接 受该疫苗但没有循环使用替莫唑胺的患者(n=22)中，小于15%的曾 对PEPvIII组分有反应。在最近的跟踪及给予第14次疫苗接种后，该 患者在PEPvIII DTH部位明显硬化(16X15mm)。这表明替莫唑胺在 该特定患者中没有不良地影响DTH反应的发展。实施例3
为了确定是否引发了 PEPvIII特异的体液反应，每月从该 患者取得血浆并在PEPvIII-Dynabead 实验分析前储存在-20°C 。 PEPvIII或EGFRvIII的细胞外域(EGFRvIII-ECD)被根据制造商的说 明共价连接到用于捕获患者血清中特异抗体的磁性微球体(Irwitrogen， Carlsbad, CA)上。所有的血清样品最初用磷酸盐缓冲液(PBS) +0.5% 牛血清白蛋白(BSA)以1:10稀释并一式三份分析。为了确定特异性， 额外的样品组用500ng的PEPvIII肽预先温育15分钟，以包被会被 PEPvIII结合的Dynabeads捕获的任何抗PEPvIII抗体。人-小鼠嵌合抗 PEPvIII抗体标准(81-0.11ng/ml)与每个测试以及阳性(患者样品ACT4) 和阴性(正常捐献者血清)对照一同分析。流式血细胞计数器用 PE-FACS微珠和未反应的PEPvIII Dynabeads标准化。给予疫苗前，没 有可检测到的对EGFRvIII的体液应答。接种疫苗后，IgG对EGFRvIII 的应答有显著上升，到平均荧光密度(MFI) 13，并且尽管给予替莫唑 胺，体液应答被维持。
实施例4为了确定CD8+细胞毒反应是否引发PEPv111，来自每次白 细胞除去法和每月PBMCs的该患者的外周血单核细胞(PBMCs)用破 伤风毒素(QYIKANSKFIGITE) (SEQIDNO:5) (10|ag/ml)(阳性对 照)、PEP-1 (HDTVYCVKGNKELE) (SEQIDNO:4) (10吗/ml)(阴 性对照)、PEPvIII (10昭/ml)(疫苗组分)或KLH (10pg/ml)(疫苗组 分)刺激。阴性对照包括未刺激的细胞。对于每种条件，包括Y-干扰 素(INF)的分泌，使用了相应的同型对照(isotype control)。所有的 培养孔与Golgiplug (Pharmingen, SanDiego， CA) —起在37。C温育6 小时，GolgiplugTM是一种阻断细胞间运输过程的蛋白运输抑制剂。温 育后，该细胞被润洗并用纯化的抗CD16抗体(Pharmingen)和兔血清 (Pharmingen)包被非特异结合。该细胞通过与适当的荧光素-异硫氰 酸盐和别藻蓝蛋白(all叩hycocyanin)标记的荧光标记的一抗或同型对 照(Pharmingen) —同温育将表面标记(CD3、 CD4、 CD8)染色。细 胞随后用Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences, San Jose, CA)固定并随后 与藻红蛋白标记的抗Y-INF抗体或同型对照一同温育。染色后，细胞被润洗并且最少1X105存活，门控事件(gated event)用Cellquest软 件(BD Biosciences, San Jose， CA)在FACSCalibur流式血细胞计数器 上通过流式细胞计测定。接受所述疫苗前，该患者在未刺激的对照中 对PEP-1阴性对照有最低的应答。接受疫苗后，以及给予替莫唑胺的 过程中，有PEPvIII特异的，Y-INF产生的CD8+T细胞的增加。
实施例5为了定性各种T细胞群在替莫唑胺周期(5/21时间表)及 同时给予疫苗(在本实施例中第19天)过程中的应答，我们在第0、 3、 5、 12、 19、 23、 25和26天取得了外周血。通过流式分析血细胞技术， 我们研究了免疫化学疗法周期中CD8+T细胞和CD4+CD25+FoxP3+调 控T细胞子集的百分比。所有荧光结合的单克隆抗体(mAB) (PerCP-Cy5.5-CD3、 FITC-CD8、 APC-CD4及PE-CD25)购自BD Biosciences,除了用于FoxP3的FITC标记的mAB由eBioscience制备。 外周血细胞的表面及细胞内染色按照制造商提供的标准过程进行。结 果用Cellquest Pro软件(BD Biosciences)通过FACSCalibur流式血细 胞计数器分析。与008+ T细胞子集的下降相反，Treg群体在给予替 莫唑胺3天后开始上升，并在第12天达到其峰值(总CD4+ T细胞的 0.9%)。所述Tregs随后开始下降，直到第23天，同时CD8+T细胞数 开始恢复。在该过程结束时，CD8+T细胞和Treg群恢复到治疗前的水 平。所述免疫接种在相对降低Tregs的过程中，导致008+细胞毒的T 细胞的上升。
实施例6在最后的15个月中，该患者以两个月的间隔进行了全身检 查和脑部MR影像。他的检查保持稳定，并且MR影像未显示复发的 任何迹象。他全职工作没有恶化，并且具有100n/o的Kamofsky行为状 态(KPS)和30/30的细微精神状态检查(mini-mental status exam)得
分。他的神经检査完全正常。本报告说明如果治疗的时间被仔细监控，化学疗法与免疫 疗法的同时给予是可能的。在本病例报告中，若干发现表明替莫唑胺的共同给予没有影响PEPvIII-KLH疫苗的效力。首先，该患者在15个 月的跟踪中没有发展。这是仅接受疫苗接种疗法患者(n=22)的中位 TTP。因此，与没有接受替莫唑胺同时给药的患者相比，临床效力未显 示出被影响。即使同时接受替莫唑胺，该患者发展出对疫苗的PEPvIII 组分的DTH反应，而单独接受疫苗的患者中仅有15%发展这些类型的 反应。而且，PEPvIIIDTH反应性的区域随后续的疫苗接种持续增长。 第三，在第三次疫苗接种后，引起了对PEPvIII的IgG特异反应，并且 在同时接受替莫唑胺时保持该反应。第四，诱导的PEP-3特异的CD3+ CD8+ Y-IFN产生T细胞在同时给予替莫唑胺的周期中未显示出降低， 而在同时给予替莫唑胺过程中显示出增强。最后，我们在单个治疗周 期内跟踪了 CD8+ T细胞和Treg群并发现随着Tregs的相对减少，好像 有T效应物(CD8+T细胞)反应性的窗口。因此，替莫唑胺和疫苗的 同时给予在我们描述的方式中未显示出降低引发的免疫反应。淋巴耗尽的使用以提升免疫反应在鼠类模型系统
(Berenson等，1975; Cheever等，1980; North, 1982)和人类癌症 患者(Dudley等，2002; Dudley等，2005)中已经描述。已经提出多 种机理负责这些增强的抗肿瘤反应。淋巴耗尽可能在存在抗原的细胞 表面去除竞争(Kedl等，2000)，增强诸如IL-7和IL-15的细胞因子的 可用性，这提升了T细胞活性(Gattinoni等，2005)并且用尽了免疫 抑制的Tregs (Anthony等，2005)。化学疗法也通过增强免疫引导
(immune priming)禾口存在(presentation) (Nowak等，2002)， 增强
抗原表达(Aquino等，1998)，及增强免疫根除(immune eradication) 的目标(Ciusani等，2002)，潜在地提升免疫反应。当疫苗接种在替莫 唑胺的最低点给予时，我们假设可能有增强的效应物反应。这些效应 物反应可能从属于Treg恢复中的延迟，因此允许比没有替莫唑胺更高 的克隆型扩展(clonotypic expansion)。在监测该特定患者的化学免疫 疗法周期时当然能观察到这些。考虑到免疫细胞反应的正常生理作用， Tregs恢复相对于效应T细胞的延迟是不令人吃惊的。为了提升免疫反 应，T效应细胞需要被激活，增殖并调控其反应。如果这通过诸如Tregs 的内平衡激励保持不加抑制，那么T细胞增殖将提升不减弱。因此， Treg反应的延迟将允许有效的免疫反应，但是最终是该反应的下调。
总之，本病例报告说明化学疗法和免疫疗法的同时给予可 能不是有害的。参考文献
所引用每份参考文献的公开内容在此明确引入。
Hatano, M.， J. Eguchi等，(2005)."《EphA2作为神经胶质瘤关联的抗体 神经胶质瘤疫苗的新靶点(EphA2 as a glioma-associated antigen: a novel target for glioma vaccines )》"Neoplasia 7(8): 717-22.
Liu, G., J. S. Yu等，(2004)."《AIM-2:通过人类神经胶质瘤细胞表达并 存在的新月中瘤抗原(AIM-2: a novel tumor antigen is expressed and presented by human glioma cells)》"J Immunother 27(3): 220-6.
Liu，M.,B.Dai等，(2006)."《FoxMlB在人类胶质母细胞瘤中超量表达 并严格调控神经胶质瘤细胞的致肿瘤性(FoxM旧is overexpressed in human gliobastomas and critically regulates the tumorigenicity of glioma cells)》"Can Res 66(7): 3593-3602.
Xie，D.,Y.X.Zeng等，(2006)."《在主要和次要人类胶质母细胞瘤中表 达细胞质和细胞核的存活蛋白(Expression of cytoplasmic and nuclear survivin in primary and secondary human glioblastoma )》"Br J Cancer 94(1): 108-114.
权利要求
1.一种治疗受治疗者肿瘤的方法，包括步骤给予该受治疗者治疗有效量的EGFRvIII肽和治疗有效量的，引起淋巴细胞减少症的化学治疗剂。
2. 权利要求l所述的方法，其中所述化学治疗剂是烷化剂。
3. 权利要求1所述的方法，其中所述EGFRvIII肽是与匙孔血蓝蛋 白(KLH)结合的。
4. 权利要求1所述的方法，进一步包括步骤与所述EGFRvIII肽同时给予该受治疗者有效量的GM-CSF作为佐剂。
5. 权利要求1所述的方法，其中所述EGFRvIII肽具有序列H-LEEKKGNYWTDHS-OH (SEQ ID NO: 1)。
6. 权利要求1所述的方法，其中所述EGFRvIII肽具有序列 LEU-GLU-GLU-LYS-LYS-GLY-ASN-TYR-VAL-VAL-THR-ASP-HIS(SEQ ID NO: 2)。
7. 权利要求1所述的方法，其中所述EGFRvIII肽具有序列 LEU-GLU-GLU-LYS-LYS-GLY-ASN-TYR-VAL-VAL-THR-ASP-HIS-C YS (SEQ ID NO: 3)并且其中KLH与所述半胱氨酸残基结合。
8. 权利要求7所述的方法，其中所述EGFRvIII肽通过异源双功能 交联剂与所述KLH结合。
9. 权利要求8所述的方法，其中所述异源双功能交联剂是6-[3'(2-二硫代吡啶)-丙酰胺基]己酸磺基琥珀酰亚胺基酯(sulfosucdnimidyl 6-[3'(2-pyridyldithio)-propionamido] hexanoate)。
10. 权利要求2所述的方法，其中所述烷化剂是替莫唑胺或其药物 上可接受的盐。
11. 权利要求l所述的方法，其中所述肿瘤是恶性神经胶质瘤。
12. 权利要求l所述的方法，其中所述肿瘤是星状细胞瘤。
13. 权利要求l所述的方法，其中所述化学治疗剂是嘌呤类似物。
14. 权利要求1所述的方法，其中所述化学治疗剂是氟达拉滨 (fludarabine)和/或2-氯代脱氧腺嘌呤。
15.权利要求l所述的方法，其中所述肿瘤是肺部肿瘤。
16. 权利要求1所述的方法，其中所述肿瘤是乳腺肿瘤。
17. 权利要求l所述的方法，其中所述肿瘤是头部和颈部癌症。
18. —种治疗受治疗者肿瘤的方法，包括步骤给予该受治疗者治疗有效量的EGFRvIII肽，所述EGFRvIII 肽与KLH结合；与EGFRvIII肽同时给予该受治疗者治疗有效量的GM-CSF 作为佐剂；以及给予该受治疗者治疗有效量的烷化剂。
19. 权利要求18所述的方法，其中所述肿瘤是恶性神经胶质瘤。
20. 权利要求18所述的方法，其中所述肿瘤是星状细胞瘤。
21. 权利要求18所述的方法，其中所述肿瘤是肺部肿瘤。
22. 权利要求18所述的方法，其中所述肿瘤是乳腺肿瘤。
23. 权利要求18所述的方法，其中所述烷化剂是替莫唑胺或其药物上可接受的盐。
24. 权利要求18所述的方法，其中所述肿瘤是头部和颈部癌症。
25. —种治疗受治疗者肿瘤的方法，包括步骤给予该受治疗者治疗有效量的抗肿瘤疫苗和治疗有效量的 替莫唑胺或其药物上可接受的盐。
26. 权利要求25所述的方法，其中所述抗肿瘤疫苗包括分离的抗 原。
27. 权利要求25所述的方法，其中所述抗肿瘤疫苗包括灭活的肿 瘤细胞。
28. 权利要求25所述的方法，其中所述抗肿瘤疫苗包括肿瘤细胞 的一部分。
29. 权利要求25所述的方法，其中所述抗肿瘤疫苗包括选自细胞 周期蛋白依赖性激酶4; p-联蛋白；胱天蛋白酶-8; MAGE-1; MAGE-3; 酪氨酸酶；表面Ig独特型；Her-2/neu受体；MUC-1; HPVE6禾PE7; CD5独特型CAMPATH-1， CD20;细胞表面糖蛋白CEA，粘蛋白-l; 细胞表面碳水化合物LewisX; CA- 125;表皮生长因子受体；pl85HER2; IL-2R; FAP-a;生腱蛋白；EphA2; FoxMlB， AIM-2，存活蛋白以及 金属蛋白酶的抗原。
30. 权利要求25所述的方法，其中GM-CSF作为佐剂以治疗有效 量与EGFRvIII肽同时给予。
31. 权利要求25所述的方法，其中所述肿瘤是恶性神经胶质瘤。
32. 权利要求25所述的方法，其中所述肿瘤是星状细胞瘤。
33. 权利要求25所述的方法，其中所述肿瘤是肺部肿瘤。
34. 权利要求25所述的方法，其中所述肿瘤是乳腺肿瘤。
35. 权利要求25所述的方法，其中所述肿瘤是头部和颈部癌症。
36. —种治疗受治疗者肿瘤的方法，包括步骤给予该受治疗者治疗有效量的抗肿瘤疫苗和治疗有效量的、 引起淋巴细胞减少症的化学治疗剂。
37. 权利要求36所述的方法，其中所述化学治疗剂是烷化剂。
38. '权利要求37所述的方法，其中所述烷化剂是替莫唑胺或其药 物上可接受的盐。
39. 权利要求36所述的方法，其中所述肿瘤是恶性神经胶质瘤。
40. 权利要求36所述的方法，其中所述肿瘤是星状细胞瘤。
41. 权利要求36所述的方法，其中所述肿瘤是肺部肿瘤。
42. 权利要求36所述的方法，其中所述肿瘤是乳腺肿瘤。
43. 权利要求36所述的方法，其中所述抗肿瘤疫苗包括选自细胞 周期蛋白依赖激酶4; (3-联蛋白；胱天蛋白酶；MAGE-1; MAGE-3; 酪氨酸酶；表面Ig独特型；Her-2/neu受体；MUC-1; HPVE6禾卩E7; CD5独特型CAMPATH-1， CD20;细胞表面糖蛋白CEA，粘蛋白-l; 细胞表面碳水化合物Lewisx; CA- 125;表皮生长因子受体；pl85HER2; IL-2R; FAP-ot;生腱蛋白；EphA2; FoxMlB, AIM-2，存活蛋白以及金属蛋白酶的抗原<
全文摘要
由于担心诱发的淋巴细胞减少会抵消免疫疗法的治疗效力，化学疗法和免疫疗法的同时给予被认为是不当的。替莫唑胺已经显示出是一种对患有恶性神经胶质瘤的患者有效的化学疗法，并且为了用免疫疗法治疗，对患有胶质母细胞瘤(GBM)的患者不使用该试剂是有争议的。尽管有常规的教条，我们显示了化学疗法和免疫疗法可以同时输送而不抵消免疫疗法的效果。事实上，替莫唑胺诱发的淋巴细胞减少可能实际上与肽疫苗协同作用。
文档编号A61K38/18GK101594877SQ200680044649
公开日2009年12月2日 申请日期2006年11月2日 优先权日2005年11月2日
发明者A·亨伯格, D·D·比格纳, D·米切尔, J·H·桑普森 申请人:杜克大学;德克萨斯大学系统董事会