针对自体饥饿激素的免疫的制作方法

专利名称：针对自体饥饿激素的免疫的制作方法
技术领域：
本发明涉及治疗性种痘(“活性治疗性免疫疗法”)。特别是涉及针对自体(“自身”)饥饿激素(ghrelin)蛋白的治疗性种痘和治疗肥胖与其它以身体脂肪沉积过量为特征的疾病，或者可以是关注的体重增加的情况。
因而，本发明不仅也涉及改善以脂肪沉积为特征的肥胖的治疗和预防，而且也涉及改善以体重减少为特征的情况的治疗和预防。更明确地，本发明提供一种下调(非期望的)脂肪沉积的方法，该方法是通过针对饥饿激素的抗体的生成、或通过针对试验材料的组分的抗体的生成实现的，该试验材料正在经受包括脂肪沉积过量的肥胖或处于上述危险中。本发明进一步提供一种上调期望的体内脂肪的沉积的方法，该方法通过针对饥饿激素的抗体的生成、或通过针对试验材料的组分的抗体的生成实现，该试验材料正在经受解放或处于解放的危险中。本发明也提供了生产有用的多肽的方法，以及修饰上述多肽的方法。本发明也包括解码修饰多肽的核酸片断，以及嵌入这些核酸片断的载体、宿主细胞(host cells)和由此转化的细胞株(cell lines)。本发明也提供了一种鉴别多肽沉积物的类似物的方法，该方法在本发明的组合物中也有用，该组合物包括修饰的多肽或包括解码修饰多肽的核酸。最后本发明也可以配对饥饿激素肽免疫原。
背景技术：
在过去的三十年里，肥胖的流行已经上升到流行病的比例；现在，不仅在美国和欧洲，而且在象中国、拉丁美洲、中东和北非等发展中国家正在报道人口中肥胖的发生在增加。尽管在努力改善公众的健康，更加健康的生活方式可能还要十年以上。根据最近的统计，结果表明预计61％的成人超重或肥胖，超重或肥胖是这样定义的身体重量指数(BMI＝体重的公斤数÷[身高的米数]2)为25或更大(National Health and NutritionExamination Survey(NHANES)1999))。在同样的人口中，肥胖(BMI大于或等于30.0)从1980年的15％到1999年预测的27％，几乎翻番。根据世界卫生组织(WHO)的估计，全球大约有3亿人口肥胖。
超重或个体肥胖(BMI为25和以上)增加了身体患病的风险，如高血压、过度紧张；高血液胆固醇、异常脂蛋白血症；2型(非胰岛素依赖性的)糖尿病；胰岛素抵抗，葡萄糖耐受不良；高胰岛素症；冠心病；心绞痛；充血性心力衰竭；中风；胆结石；膀胱炎和胆石病；痛风；关节炎；阻塞性睡眠息症和呼吸问题；某些类型的癌症(如子宫内膜、乳房、前列腺和大肠)；怀孕并发症；贫弱女性的生殖健康(如月经异常、不能生育、异常排卵)；膀胱控制障碍(如压力失禁)；尿素肾石病；心理失常(如抑郁、饮食失调、身体扭曲和自卑)。从未成年死亡风险的增加到严重的慢性症状的健康问题降低了整个生命的质量。而且，和瘦的个体相比，25～35岁之间的严重肥胖者的死亡率上升12倍。消极的对待肥胖能导致许多生活领域的歧视，包括卫生保健和就业。
目前，全民健康制度中，诊断、治疗和服用肥胖的直接成本仅在几个国家中有预算。尽管研究方法上的巨大差异导致很难比较不同国家的成本和由一个国家推断另一个国家的情况，在西方国家中，建议2～8％的疾病治疗费用应用于肥胖方面。例如，和全部的癌症治疗成本相比，这表示了全民医疗服务预算的主要部分。发展中国家不发达的医疗服务制度在医疗服务资源上的潜在影响可能更加严重(WHO)。
过量吸收卡路里和/或很少的体力活动会导致超重或肥胖。对于每个个体，体重是基因、代谢、行为、环境、文化和社会经济的影响的综合结果。对于超重和肥胖来说，行为和环境因素是有很大作用的，并且行为和环境因素提供了针对治疗和预防而进行的发明和创造的最大机会。因此，许多研究表明通过药物和锻炼的减肥降低了上述显著的风险因素。不幸的是，这些治疗很不成功，失败率达到95％。失败可能是因为人体机制的复杂性，在古代食物供应不足的情况下，这种复杂性有助于人类的生存。这个机制可以有助于增加食欲，特别是高卡路里的食物，有助于降低体力活动和增加，并根据饮食和活动的情况增加脂肪代谢。
1995年发现的瘦素(Leptin)是一种抑制食欲的激素。瘦素主要在脂肪组织中生成，通常根据脂肪存储的比例循环。当脂肪细胞丰富时，瘦素会暗示人们停止饮食。新发现的一种称之为饥饿激素的激素(1999)好像有相反的作用。该激素是一种胃激素，该激素被认为是生长激素(GH)赛可若嗒(secretagouge)受体亚型1a(GHS—Rla)的一种内源性配位体，该激素刺激了猫和人类生长激素的分泌(Kojima M et al.，Nature，1999，402656-60；Kojima M et al.，Trends in Endocrinology andMetabolism，2001，12118-22；Takaya K ET AL.，J CLIN ENDOCRINOLMetab，2000，854908-11)。以啮齿动物中发现的食欲基因(orexigenic)和脂肪基因(adipogenic)为基础(Tschp M et al.，Nature，2000，407908-913；Wren AM et al.，Endocrinology，2000，1414325-28；Nakazato M et al.，Nature，2001，409194-8；Shintani M et al.，Diabetes，2001，50227-232)，假设了饥饿激素在调节能量平衡中的附加作用(Inui A，Nature Reviews Neuroscience，2001，2551-60；HorvathTL et al.，Endocrinology，2001，142(10)4163-9)。研究已经表明，啮齿动物中饥饿激素的注入刺激了摄取食物并产生了肥胖(Tschp M etal.，Nature，2000，908-13)，并不依赖生长激素分泌的变化(Nakazato Met al.，Nature，2001，vol.409194-8)。在研究人类时，饥饿激素的注入增加了短期的饥饿(Wren AM et al.，J Clin Endocrinol，Metab，2001，865992)。卡明斯等人(N Eng J Med，2002，3461623-30)报道在饭前、限制饮食和饥饿时饥饿激素水平上升，而饭后饥饿激素迅速下降。作者假设观察到的饭前的增加激起饮食的欲望，而长期饮食限制的水平增加可能有助于饥饿和伴随的消极能量平衡可能的适应。该理论和饥饿激素作用于下丘脑的神经细胞的证据一致，众所周知，该下丘脑的神经细胞调节能量平衡(Nakazato M et al.，Nature，2001，vol.409194-8)。卡明斯等人(2002)报道一旦饮食导致体重减少，饭前血浆中的饥饿激素水平将增加。体重减得越多，饭后饥饿激素的水平增加的越大。这和饥饿激素在长期调节体重中所起的作用是一致的。而且，据报道，胃绕道外科手术显著抑制了饥饿激素水平，这可能有助于替代管病人的体重降低。绕道手术阻止了胃细胞接触食物，从而导致了饥饿激素的降低到几乎不可觉察的水平(＞75％的降低)。有趣的是，大部分替代管病人手术后完全失去了对食物的兴趣，这也可能是饥饿激素的生成大幅度降低的原因。因而，饥饿激素确实在肥胖中起到很大的作用，对于肥胖病人的饥饿激素的生成的减少必须1.减少体重，即减少过多的体内脂肪；2.随后保持能减少体重的饮食。
饥饿激素的结构和丝氨酸-3的残留物中的正辛酰基酯在一起的饥饿激素具有独特的结构。其表明，处理的第一少量残留物、成熟的饥饿激素、甘氨酸-Ser-Ser(正辛酰基)-苯基丙氨酸片段组成了这种肽的活性组分(Bednarek MA etal.，2000)。
饥饿激素和其它蛋白质的同族关系饥饿激素已经在人的胃内鉴别出来了。除了2个氨基酸外，该饥饿激素和鼠的饥饿激素类似。从cDNA库里分离出来的人类的前-正饥饿激素(pre-proghrelin)由117种氨基酸组成。鼠和人类的前-正饥饿激素有82.9％是一致的。饥饿激素和目前识别出的任何其它非-饥饿激素肽没有很高的同族关系。
饥饿激素的生物活性饥饿激素被认为是通过胃功能的中枢神经系统(CNS)控制的调制部分改变了进食(Date Y et al.，2001；Masuda Y et AL.，2000)。特别的，饥饿激素的ICV服用刺激了胃酸亿剂量依赖(dose-dependent)和阿托品敏感(atropine-sensitive)的方式分泌。免疫组织化学说明了鼠迷走神经(vagus nerve)中的孤束核(nucleus of the solitary tract)和多丝摩托和(dorsomotor nucleus)的fos表达(fos-expression)。阿瑟卡瓦·A等人在2001年认为饥饿激素具有胃肠道蠕动促进的活性，并与胃动素(motilin)的结构类似；同时通过作用于下丘脑的神经肽Y和Y(1)受体而具有有效的食欲基因(orexigenic)(进食)活性，这种作用在迷走神经切断术后消失。和增加该活性的其它降低食欲的肽(anorexigenic peptides)相比，饥饿激素减少了胃迷走神经传入的流量。上述作者和其他的一些人(Toshinai K et AL.，2001)报道通过禁食、胰岛素，增加了先天肥胖鼠(ob/ob mice)的胃中的饥饿激素的基因表达。
饥饿激素作用的体内展示在鼠中，外因的饥饿激素在增加生成激素(GH)释放的同时也增加了食物的摄取，从而引起体重的增加，脂肪利用的降低(Wren AM et al.，2000；Tschp M et al.2000)。同时，饥饿激素的侧脑室(Intracerebroventricular，ICV)内的服用在食物摄取和体重的增加中也产生了剂量依赖的增加。鼠血浆的饥饿激素通过禁食增加，通过再进食或口服葡萄糖而减少，而不是通过水摄取。除了饥饿激素在调节GH分泌的作用外，这些作者认为在必要的增加代谢效率时，饥饿激素改变了视丘下部。纳卡扎托(Nakazato)·M等人(2001)认为饥饿激素涉及能量平衡的下丘脑平衡。饥饿激素的侧脑室注射强烈刺激了鼠的进食和增加了体重。饥饿激素也增加了鼠的进食，这在生长激素中是遗传性缺乏的。抗-饥饿激素免疫球蛋白G强烈的抑制了进食。在发现ICV饥饿激素服用、fos蛋白质、神经元活性遗传标志在进食调节中的主要作用后，也包括神经肽Y神经元和相关的刺豚鼠的蛋白质神经元。抗体和神经肽Y神经元和相关的刺豚鼠的蛋白质的对抗剂和抗体废止了饥饿激素的诱导进食。增加神经肽Y基因表达和阻碍瘦素引起的进食减少的饥饿激素表明在进食服用中瘦素和饥饿激素之间存在竞争性的相互作用。因此可以得出饥饿激素是进食中的生理性调节。除了动物以外，饥饿激素也进行了许多医疗研究。在进食前1小时，饥饿激素的水平翻番，而在进食时饥饿激素的水平降低(如插页)，这表明饥饿激素在进食初期起了很大作用(Cummings DE et al.，2001)。上述结论被饥饿激素增加了食欲和进食的人类研究证实(Wren AM et al.，2001)。
目前和将来肥胖的治疗据预测，在美国有3千4百万至6千1百万的人肥胖，而且在发展中国家以每年1％的速度增长。下面取消了早期治疗，当FDA同意艾波特(Abbott)的西布曲明(sibutramine)(Reductil/Meridia)用于减肥，药物减肥的市场在1997年11月重新建立了；进一步在1999年4月，FDA也同意了]洛希(Roche)的罗氏鲜(Xenical)(orlistat)。世界肥胖市场预测到2008年将达到37亿，并以21.1％的年增长率增长。该市场潜力将刺激药物公司开发新的减肥产品，因此在过去的7年里，这些药物的数量翻了3倍，这也导致了在潜在的研究活动的增加。吸引最大注意力的药物种类包括5-HT调制的药物、β-3-肾上腺素受体兴奋剂、脂肪酶抑制剂、黑皮质素(melanocortin)-4-兴奋剂和瘦素兴奋剂。自从这种媒质可以降低进食，瘦素兴奋剂已经引起了极大的兴趣。然而，最近的研究表明肥胖个体很多，而且抵抗瘦素，这激起了替代物的研究。
饥饿激素是肥胖领域中最有希望达到目的的。尽管科学家仅仅在1999年才鉴别出饥饿激素，已经有200多篇的论文发表。饥饿激素刺肥胖病人激进食并降低血浆的浓度表明这种媒质是进食的关键调节因素。当前，本领域的权威认为饥饿激素活性的进一步降低可以达到治疗效果，因而饥饿激素受体结合的对抗剂在治疗肥胖的药物中是一个选择。相应的，许多工具可用于筛选饥饿激素受体兴奋剂。除了药物发现的潜力，尽管公开的许多专利建议这种分子还不成熟，饥饿激素受体兴奋剂也出现了。考虑到支持发展饥饿激素抗体的证据、肥胖市场潜在的规模和临床医生用于相对小量的治疗，现在是投资发展这种令人鼓舞的治疗种类的最佳时机。
体内有益脂肪增加的情况遭受许多疾病的病人可能从体内脂肪的增加受益，这和上述肥胖病人的情况正好相反。确实存在这样的情况即问题是由缺乏食欲和没有充足的食物供应。这些情况包括恶病体质和食欲减退。

发明内容
本发明的目的本发明的目的是提供一种治疗以体内脂肪过量为症状的新型方法，脂肪过量是由于吸收的能量超过了能量的消耗，这也是肥胖的特征。本发明的另一个目的是提供导致体内脂肪增加的治疗方法。进一步的发明目的是提供针对饥饿激素的自体菌苗。
本发明概述此处公开的是利用自体菌苗接种的技术产生强烈的免疫反应，以对抗其它的非免疫原的自体蛋白质、饥饿激素，包括体内沉积的过量脂肪。因此，产生的强烈的免疫反应对抗饥饿激素。本发明也公开了这种疫苗的制备，该疫苗不仅用于预防、一定的治疗或缓和与体内脂肪沉积过量症状相关的疾病，而且也用于诱导体内脂肪的增加。
后者表示的结果是令人惊异的发现本发明中许多免疫原饥饿激素的类似物好像影响了动物免疫变异体中的血清饥饿激素的上升。这种在血清饥饿激素中的上升伴随着免疫动物体重的重要的增加，即使该动物没有显示增加的进食。
而且，饥饿激素水平循环的增加致使活性免疫对抗自体饥饿激素，一个意外替代饥饿激素直接服用的材料为1)将从饥饿激素引起的生理效应受益；以及2)自身能够产生饥饿激素的能力。
因而，在最广和最普通的范围内，本发明涉及一种诱导对抗动物(包括人)自体饥饿激素的免疫反应的方法，该方法包括影响动物的免疫系统，以及从下述基团选择的免疫原的免疫有效量，该基团包括
-至少一种饥饿激素多肽或以及随后形成物，以使含有饥饿激素多肽或随后形成物的动物的免疫诱导对抗动物自体饥饿激素的抗体的生成，以及-至少一种结合在同一分子中的饥饿激素类似物，至少一种饥饿激素的B-细胞的表位，以及至少一种一半不是来自于饥饿激素的的化学物质，以使动物的免疫和类似物一起诱导对抗饥饿激素的抗体的生成。
正如下述对本发明讨论的一样，该方法用于用于体内的下调饥饿激素活性，或者体内的上调饥饿激素活性。
例如，与其中的饥饿激素的类似物具有键亲和力的、包括抗-饥饿激素或分子服用的治疗方法相比，本发明最具有吸引力的方面是肥胖可以通过定期的、而不是经常的免疫进行控制和/或转化。根据本发明，1～4年每次注射免疫原的化合物足够获得期望的效果，然而其中饥饿激素活性其它的抑制剂的服用要求每天，或至少每周服用。同样的优点存在于指示体内需要增加的的情况。
本发明也涉及饥饿激素的类似物和解码这些子集的核酸片段。同样，包括类似物或核酸片段的免疫原的化合物也是本发明的部分。
本发明也涉及鉴别饥饿激素类似物的方法，以及制备含有饥饿激素类似物的组合物的方法。
最后，本发明也提供了被动的免疫治疗，其中服用单克隆的抗一饥饿激素抗体是为了获得和活性接种疫苗类似的效果。
本发明的详细公开定义为了阐明本发明的范围，下面将对本说明书和权利要求书中用的许多术语进行详细描述。
本发明上下文中的术语“免疫原”指的是诱导一免疫反应的试剂(物质或组合物)。可以理解，某些分子(如自体宿主所承受的传统的小半抗原或自体蛋白)不能诱导免疫反应。然而，即使在免疫动物正常的承受范围内，当一些自体蛋白在很强的免疫启动子(immunologic adjuvants)下形成时，其也能够诱导免疫反应。因此，上下文中的“免疫原”是组合物(自体蛋白和启动子)，而不仅仅是单一分子。
术语“T-淋巴细胞”和“T-细胞”可以交替使用用于负责调制免疫反应的不同的细胞，即胸腺来源的淋巴细胞，以及作为肱骨处的免疫反应的活性促进者。同时，术语“B-淋巴细胞”和“B-细胞”在抗体生成淋巴细胞中交替使用。
此处的“饥饿激素多肽”用于表示这样的多肽，该多肽不仅具有上述来自于人和其它哺乳动物(或其中和为处理的饥饿激素缩短分享大量的表位)的饥饿激素蛋白的氨基酸序列，而且该多肽的氨基酸序列和这些蛋白质的外源的类似物一致，该些蛋白质从本术语包括的其它物种中分离。本术语包括成熟的饥饿激素肽、饥饿激素前蛋白胨和饥饿激素预-前蛋白胨。在原核体系中制备的饥饿激素的unglycosylate形态也包括在该术语的范围内，这是因为这些形态在使用酵母或其它的非哺乳动物真核状态表达体系时具有不同的糖基化模式。然而值得注意的是，当使用术语“饥饿激素多肽”时，出现的问题是多肽出现在处理的动物中通常是非-免疫原的。换句话说，饥饿激素多肽是一种自体蛋白或这种自体蛋白的外源类似物，该自体蛋白或这种自体蛋白的外源类似物通常不会在所讨论的动物中产生对抗饥饿激素的免疫反应。
“饥饿激素类似物”是一种饥饿激素多肽，该饥饿激素在一级结构经过了改变。例如，这种改变是饥饿激素多肽的融合状态到合适的熔体(fusion partner) (即除了涉及C-和/或N-氨基酸残基的最终添加物的一级结构的变化)和/或以插入的形式和/或饥饿激素多肽氨基酸序列中的取代物。该术语也包括饥饿激素分子的衍生物，比较下述讨论的饥饿激素的修饰。
需要注意的是，例如，犬的和人类饥饿激素的类似物在人体内作为疫苗的应用可以想象到能够产生对抗饥饿激素的期望的免疫性。作为免疫的外源类似物(xeno-analogue)的这种使用也在上述讨论的“饥饿激素类似物”中考虑到。
当使用此处“饥饿激素”缩写时，一般指的是野生饥饿激素的氨基酸序列(此处也表示“饥饿激素”和“饥饿激素-wt”)。这个术语包括前蛋白胨和成熟的肽，所以成熟的饥饿激素表示为饥饿激素-m。成人饥饿激素表示为h-饥饿激素、h-饥饿激素-m、或m-饥饿激素-wt，等等。如果其中DNA的结构包括解码主要序列或其它物质的信息，通常可以清晰从上下文的看出。
上下文中的术语“多肽”一般用来表示2～10个氨基酸残基的短肽、11～100个氨基酸残基的寡肽(oligopeptides)和超过个氨基酸残基的多肽。而且，该术语也包括蛋白质，即包括至少一种多肽的功能性生物分子；当包括至少两种多肽时，这些通过共价键或非共价键连接可以形成染色体组(complexes)。蛋白质中的多肽可以糖基化和/或脂化(lipidated)和/或包括非朊基基团。术语“聚氨基酸(polyamonia acid)”等同于术语“多肽”。
术语“亚序列(subsequence)”表示的是至少3个氨基酸的连续部分或相应的至少3个核苷，该核苷分别直接来源于天然产生的饥饿激素氨基酸序列或核酸序列。
通常，本发明上下文中的术语“动物”表示的是动物种群(优选为哺乳动物)，如智人(Homo sapiens)、犬类(Canis domesticus)等，并且不仅仅是单一的动物。然而，该术语也表示这些动物物种的数目，由于个体的免疫很重要，根据本发明的方法，充分的harbour允许用同一种免疫原对动物进行免疫。例如，如果饥饿激素的遗传性变型存在不同的人口中，为了能够打破针对每个个体中的饥饿激素的自体耐药性，对于这些不同的个体用不同的免疫原是必要的。本发明上下文中的动物是具有免疫系统的活的动物对于技术人员来说是清楚的。该动物优选为脊椎动物，如哺乳动物。
此处的术语“体内的饥饿激素活性的下调”表示的是饥饿激素和其受体(或者饥饿激素和这种分子的其它可能的重要的生物结合配体)之间的相互反应的数目的活体组织中的减少。下调可以通过几种机制实现其中通过抗体结合在饥饿激素的活性位点上的简单的冲突是最简单的。然而，抗体结合通过清除细胞导致饥饿激素消除也包括在本发明的范围内。另一种可能是抗-饥饿激素抗体的结合能够干扰导致成熟饥饿激素的正常的前饥饿激素的分裂。
表述“影响出现…至免疫系统”想表示的是动物的免疫系统以可控制的方式受到免疫原的挑战。正如下述公开的一样，这种免疫系统的挑战能够受到许多方式的影响，其中最重要的是含有“药物疫苗(pharmaccines)”(即用于治疗或改进正在发生的疾病的核酸)的多肽的接种疫苗或核酸““药物疫苗”的接种疫苗。获得的最重要的结果是动物中的免疫活性细胞面临免疫有效方式的抗原，其中获得这种结果的准确方式对于本发明的发明构思是不重要的。
术语“免疫有效量”在免疫学中的常用意思即为能够诱导免疫反应的免疫原的有效量，该免疫反应包括共享免疫原的免疫技术特征的分子。
当此处使用表述饥饿激素被“修饰”时，其意思是组成饥饿激素支柱的多肽的化学修饰。例如，这种修饰可以是饥饿激素序列中某些氨基酸残基的衍生物(如烷化、酰化、酯化等)，但如下述公开，优选的修饰包括饥饿激素氨基酸序列一级结构的改变(或添加)。一个特异的修饰是饥饿激素中天然生成的辛酰基的删除。
当讨论“针对饥饿激素的自体耐药性”时，可以理解，由于饥饿激素是人群中需要进行免疫的自体蛋白质，正常的个体不需要对抗饥饿激素的免疫反应；虽然临时的动物个体可能生成对抗天然饥饿激素的抗体，如作为自动免疫失常的一部分，但是不能排除在外。无论如何，动物将仅能正常的针对自身的饥饿激素自体耐药性，但是它不可能排除来源于其它动物物种或具有不同饥饿激素显型的物种的饥饿激素类似物也对所述动物具有耐药性。
“外源T-细胞表位”(或“外源T-淋巴细胞表位”)是一种能够结合MHC分子和刺激动物物种中的T-细胞的肽。本发明中优选的外源T-细胞表位是“混杂的”表位，即结合动物物种或种群中MHC分子中特异种类的一大部分的表位。
仅有数量有限的这种混杂的T-细胞表位是公知的，并将在下面仔细讨论。值得注意的是，根据本发明，为了使免疫原在尽可能多的动物种群中有效，这是必要的1)在同样的饥饿激素类似物插入几种外源T-细胞表位或2)制备几种饥饿激素类似物，其中每种类似物具有一不同的插入的混杂表位。也需要注意的是，当讨论中没有成为自体蛋白存在分离的形式时，外源T-细胞表位也包括隐藏的T-细胞表位的应用，即来自自体蛋白的表位仅仅施加免疫原的性能。
“外源T辅助淋巴细胞表位”(外源TH表位)是一种外源T细胞表位，该表位结合MHC的II型分子，并能够出现在结合在MHC的II型分子上的抗原呈递细胞(APC)上。
本发明上下文中的(生物)分子“功能部分”表示的是负责由分子施加的至少一种生化或生理效应的分子部分。本领域公知的是，许多酶和其它效应器分子具有一个活性位点，该活性位点负责由讨论中的分子施加的效应。分子的其它部位可以作为有利于实现目的的稳定或溶解性；因此，如果这些目的和本发明中的某些实施方式不相关，分子的其它部位可以排除。例如，可以用某种细胞因子(cytokines)作为饥饿激素中的一修饰半(modifying moiety)(和下面详细的讨论比较)，在这种情况下，由于和饥饿激素的耦合提供了必要的稳定，稳定性的问题可以不相关。
术语“佐剂”为在疫苗技术领域的常用意思，即一种物质或一组合物，其中1)本质上不能修饰对抗疫苗免疫原的特定的免疫反应，但是其不过是2)能够提高对抗免疫原的免疫反应。或者，换句话说，和佐剂一起的接种疫苗不能提供一个对抗免疫原的免疫反应，和免疫原一起的接种疫苗可以或不可以产生对抗免疫原的免疫反应，但是接种疫苗、免疫原和佐剂的结合诱导了对抗免疫原的免疫反应，该免疫反应比免疫原单独诱导的强烈。
本发明上下文中的分子的“靶向”想要表示的是在某种组织中优先出现的状况(其中分子引入到动物中)，或者是优先和特定细胞或细胞类型的情况。效果可以以多种方式实现，这些方式包括组合物中有利于靶子的分子的形成，或在分子中引入基团以有利于靶子。这些问题将在下面详述。
“免疫系统的刺激”表达的是物质或组合物表示的是通常的、非特定的免疫能力的影响。许多佐剂和推定的佐药(如某种细胞因子)共有刺激免疫系统的能力。用免疫刺激试剂的结果是免疫系统增加的“警戒性”，和单独使用免疫原相比，其意味着和免疫原一起的同时或随后的免疫诱导了重要的更有效的免疫反应。
“生产性结合(productive binding)”表示的是针对MHC分子(I型或II型)的肽的结合，以便能够刺激T-细胞，该T-细胞体现的是连接到MHC分子的肽。例如，如果APC刺激一连接到上述肽-MHC的II型联合体的TH细胞，连接到APC表面的MHC的II型的分子的肽据说是有成果的结合，抗-饥饿激素免疫的优选实施例如上简单叙述，对抗饥饿激素的免疫可以是积极的和消极的。即使本发明的重点是药剂的服用是诱导一针对饥饿激素的积极的免疫反应，体内结合饥饿激素的药剂服用也包括在本发明的范围内。例如，在本发明中可以应用公知的单分子克隆的技术。在本发明中，优选使用人类的或人类全部克隆的抗体，如通过使用基因改造的鼠表示人类免疫球蛋白轻的或重的链。技术人员应知道如何注射和服用这种抗体组合物。可选择的，饥饿激素受体可溶的形式可以注射，从而导致针对饥饿激素血流的有效的结合。
然而，如上所述，优选的实施例包括对抗饥饿激素的活性免疫。
优选的是，本发明的方法用作免疫原的饥饿激素多肽是一种修饰的分子，其中至少在饥饿激素多肽氨基酸序列中有一个变化，由于获得所有重要的针对饥饿激素自体耐药性的机会大大方便了这种方法。值得注意的是，这并不排除用这种修饰的饥饿激素的形成的可能性，其进一步促进对抗饥饿激素的自体耐药性的突破，如含有特定佐剂的形成在下面详细讨论。
已经公开(Dalum I et al.，1996，.J.Immunol.1574796-4804)，潜在的自身反应B-淋巴细胞认识自身蛋白生理性的出现在正常的个体中。然而，为了这些B-淋巴细胞能够确实和相关的自体蛋白诱导产生抗体，从细胞因子产生T-辅助淋巴细胞需要协助(TH-细胞或TH-淋巴细胞)。通常不能提供这种协助，这是因为，当通过抗原提呈细胞(ACPs)时，T-淋巴细胞通常不认识来自于自体蛋白的T-细胞表位。然而，通过自体蛋白提供“外源”的元素时(即引入一重要的免疫修饰)，认识外源因素的T-细胞在认识APC(如，初始的，单核细胞)上的外源表位时被激活。能够认识修饰自体蛋白上的自体表位多细胞株的B-淋巴细胞(特异的ACPs)也使抗原内在化，并且随后出现外源T-细胞表位，随后激活的T-淋巴细胞向这些自体反应多细胞株的B-淋巴细胞提供细胞因子帮助。由于由多细胞株的B-淋巴细胞生成的抗体核修饰的多肽上的表位反应，包括那些出现在天然的多肽上的，可和非修饰的自体蛋白进行交叉反应的抗体也被诱导。
总之，T-淋巴细胞可以导致反应，如果多细胞株的B-淋巴细胞的种群认识全部的外源抗原，事实上，其中只有插入的表位对于宿主来说是外源的。按照这种方法，可和非修饰的自体蛋白进行交叉反应的抗体也被诱导。
为了得到自体耐药性的突破，本领域中几种修饰肽自体抗原的方法是公知的。因此，根据本发明，修饰能够包括-至少一种外源T-细胞肽被引入，和/或-至少一种第一部分被引入到一抗原提呈细胞(APC)上，并影响修饰分子的靶子，和/或-至少一种第二部分被引入，并刺激免疫系统，和/或
-至少一种第三部分被引入到免疫系统上，并优化修饰饥饿激素多肽的出现。
然而，在保持饥饿激素中原始的B-淋巴细胞表位的充分的比例时，所有这些修饰都应进行，这是由于天然分子的B-淋巴细胞认识得到了提高。
在一个优选的实施例中，支链(以外源T-细胞表位或上述的第一、第二和第三部分)以共价或非共价的引入。这表明来自饥饿激素的氨基酸残基的延伸在没有改变初始氨基酸序列时衍生，或至少在单独的链中的氨基酸之间的表位键没有引入变化。
可选择的和优选的实施例使用氨基酸取代物和/或缺失和/或插入物和/或加成化合物(可能受到重组细胞或肽合成方式的影响；涉及氨基酸较长的伸展的修饰产生融合多肽)。本实施例特异的优选方式是WO 95/05849中公开的技术，该文献公开了通过和自体蛋白类似物的免疫针对自体蛋白进行的免疫热处理(immunizing)，其中许多氨基酸序列被相应的许多氨基酸序列取代，而同时保持类似物中自体蛋白所有的3维结构。然而，为了本发明，如果修饰产生外源T-细胞表位的同时保持饥饿激素中足够数量的B-细胞表位，这就足够了。然而，为了获得诱导免疫反应的最大效率，饥饿激素的整体三级结构优选保持在修饰的分子中。
下述公式描述的是本发明包括的饥饿激素的通常的结构下述公式描述的是本发明包括的分子的通常的结构(MOD1)S1(ghre1)n1(MOD2)S2(ghre2)n2…(MODx)Sx(ghrex)nx(I)其中，ghre1～ghre2是含有饥饿激素多肽后续的x B-细胞，独立的相同或不相同，并可以含有或不含有外源支链，x是一≥3的整数，n1-nx是x整数≥0(至少一种个是≥1)，MOD1-MODx是引入保持的B-细胞之间的x修饰，S1-Sx是x整数≥0(如果在ghrex序列中没有支链引入，至少一种个是≥1)。因而，假定免疫原上通常的功能抑制剂，本发明允许饥饿激素多肽原始序列的各种蜕变(permutations)和其中的各种修饰。从而，包括在本发明中的修饰饥饿激素多肽通过饥饿激素多肽序列的部分省略得到，例如，修饰饥饿激素多肽体内的展示了反作用，因而产生了非期望的免疫反应。
本发明的一个优选的实施例利用饥饿激素多肽的B-淋巴细胞表位的多重出现(即公式I，其中至少一种B-细胞表位出现在两个位置)。这种效果抗原通过不同的方法实现，例如通过简单的制备包含结构(饥饿激素多肽)m的融合多肽(fusion polypeptides)，其中m是大于或等于2的整数，然后至少在一个饥饿激素序列中引入上述讨论的修饰。优选的是，引入的修饰包括至少一种个B-淋巴细胞表位的复制物和/或半抗原的引入。这些包括可选择的表位的多重出现的实施例特别适合这些情况即只要饥饿激素多肽的小部分用作疫苗试剂中的成分。
如上所述，外源T-细胞表位的引入通过至少一种个氨基酸的插入、增加、缺失或取代来完成。当然，正常的情况是在氨基酸序列中引入一个以上的变化(如通过完全的T-细胞表位插入或取代)，但是要达到的重要目的是，当通过抗原提呈细胞(APC)处理类似物时，类似物将产生这样的外源免疫显型T-细胞表位，即该决定基出现在APC表面的MCH的II型分子的上下文中。因而，如果在合适位置的饥饿激素多肽的氨基酸序列包括也可以在外源TH表位的许多氨基酸残基，然后外源TH表位能够以氨基酸插入、增加、缺失和取代的方式、通过提供剩余外源表位的氨基酸来完成。换句话说，为了实现本发明的目的，通过插入或取代引入完整的TH表位不是必要的。
优选的是，氨基酸插入、缺失、取代或增加的数目至少为2，如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21和25个插入、缺失、取代或增加。进一步优选的是，氨基酸的插入、缺失、取代或增加不超过150，例如最多在100、90、80和70。特别优选的是，插入、缺失、取代或增加的数目不超过60，特别的数目不应超过50甚至40。最优选的是数目不超过30。
关于氨基酸的增加，值得注意的是，当最终的结构是融合多肽的形式时，氨基酸的增加大大超过150。
本发明优选的实施例包括通过引入至少一种个外源免疫显型T-细胞表位的修饰。可以理解的是，T-细胞表位免疫的优势取决于讨论的动物的物种。正如此处应用的，术语“免疫显型(immunodominance)”简单的是指在预防接种的个体/群体的表位产生一重要的免疫反应，但是公知的事实是在个体/群体的显型免疫的T-细胞表位在同样物种中的另一个体中不是必要的显型免疫，即使其可以在后者的个体中粘合MCH-II型分子。因此，为了本发明的目的，当出现在抗原时，免疫显型T-细胞表位对提供T-细胞帮助是有效的。代表性地，免疫显型T-细胞表位具有内在的特征，无论多肽在哪里出现，该些免疫显型T-细胞表位将总是充分的出现在连接MHC的II型分子上。
另一个重要点是T-细胞表位的MHC限制的问题。通常，自然生成的T-细胞表位是MHC受限的，即含有一T-细胞表位的某种肽将仅仅有效的连接到MHC的II型分子的子集中。在大多数的情况下，依次具有这种效果即一种特定T-细胞表位的使用将产生一疫苗的成分，该成分只在一定种群中有效，并取决于比例的大小，很有必要在同一分子中包括根多的T-细胞表位，或者可选择的制备一多组分疫苗，其中组分是不同的饥饿激素多肽，并通过引入的T-细胞表位彼此间进行区分。
如果所用的T-细胞的MHC限制完全未知(例如，接种的动物具有很少的所述的MHC成分的情况)，由特定疫苗成分覆盖的种群的部分通过下述公式计算(II)---fpropedoton=1-Πi=10(1-pi)]]>-其中，pi是应答出现在疫苗组分中的外源T-细胞表位的种群中的频率，n是疫苗组分中的外源T-细胞表位的总数。因而，种群中的应答频率分别是0.8、0.7和0.6、含有3个外源T-细胞表位的疫苗组分将给出1-0.2×0.3×0.4＝0.976，-即97.6％的种群将统计地镶嵌调制的MHC-II应答疫苗。
上述的公式不应用于这些情况，即其中所用的或多或少的肽的准确的MHC限制模式是公知的情况。例如，如果某种肽仅仅连接由HLA-DR等位基因DR1、DR3、DR5和DR7解码的人类的MHC-II分子，于是这种肽的应用和另外连接由HLA-DR等位基因解码的剩余的MHC-II分子肽一起由讨论中的种群覆盖100％。同样地，如果第二肽仅仅连接DR3和DR5，这种肽的添加将根本不增加覆盖。如果种群应答的计算纯粹以疫苗中的T-细胞表位的MHC限制位基础，由特定的疫苗组分覆盖的种群的分数可以通过下述公式计算 -其中，φj是解码MHC分子的等位基因单模标本中种群频率的总和，其中MHC分子连接疫苗中任一T-细胞表位，并属于3个公知的HLA位点(locus)(DP、DR和DQ)的jth；实际上，在第一次计算中，MHC分子将认识每个疫苗中的T-细胞表位，因而按类型列出(DP、DR和DQ)-然后，列出的不同等位基因单模标本的个体频率按照每种类型总计，从而生成φ1、φ2和φ3。
公式II中的pi可能会发生超过相应的理论值ni(IV)---πi=1-Πj=13(1-vj)2]]>
-其中，Uj是解码MHC分子的等位基因单模标本中种群频率的总和；其中MHC分子连接疫苗中任一T-细胞表位并属于3个公知的HLA位点(locus) (DP、DR和DQ)的jth这表明种群的1-πi是fresidual_i=(pi-πi)/(1-πi)的应答者的频率。因此，公式III可以调整，从而生成公式V。
-其中，如果是消极的，术语1-fresidual_i设置为0。需要注意的是，公式V要求所有的表位对抗同套的单模标本已被单模标本的映射。
因此，当选择T-细胞表位引入到类似物里时，包括能够获得的表位的所有信息是重要的1)种群中针对每种表位的应答者的频率，2)MHC限制数据，和3)种群中相关单模标本的频率。
此处存在许多天然生成的“混杂的”T-细胞表位，该表位在很大比例的动物种群或动物种群中是活性的，并优选引入到疫苗中，从而降低了在同一疫苗中大量不同类似物的需求。
根据本发明，混杂的表位可以是天然生成的人类T-细胞表位，如从破伤风菌疫苗中的表位(如P2和P30表位)，以及白喉类毒素、流感病毒hemagluttinin(HA)和P.falciparum CS抗原中的表位。
过去许多年，许多其它的混杂T-细胞表位已经被确认。特别是能够连接大比例的HLA-DR分子的表位已经确认，其中HLA-DR分子由HLA-DR等位基因解码；根据本发明，在使用的类似物中引入了所有可能的T-细胞表位。比较下述文献讨论的表位，这些文献包括WO 98/23635(Frazer IH et al.，assigned to The University of Queensland)；Southwood S et al.，1998，J.Immunol.1603363-3373；Sinigaglia F et al.，1988，Nature 336778-780；Chicz RM et al.，1993，J.Exp.Med 17827-47；Hammer J etal.，1993，Cell 74197-203；和Falk K et al.，1994，Immunogenetics39230-242。近来的文献也涉及HLA-DQ和-DP配合基。此处5篇参考文献列出的所有表位和本发明中应用的天然表位相关，也和此处的表位共享相同的目的。
可选择的，表位可以是任何人工的T-细胞表位，该表位能够连接大比例的MHC的II型分子。根据本发明，在WO 95/07707和相应的论文AlexanderJ et AL.，1994，Immunity 1751-761(这两个公开在此处作为参考文献)公开的pan DR肽(“PADRE”)是本发明有兴趣使用的表位。需要注意的是，为了改善服用时的稳定性，这些文献中公开的最有效的PADRE肽附带C-和N-终点(termini)的D-氨基酸。然而，本发明主要是为了将相关的表位结合为修饰的饥饿激素多肽的一部分，然后在ACPs的溶菌小室(lysosomal compartment)进行酶分解，以便在随后的MHC-II分子中出现；因此，本发明中使用的表位中结合D-氨基酸不是有利的。
一个特别优选的PADRE肽是具有氨基酸序列AKFVAAWTLKAAA或一免疫有效的亚序列(subsequence)。这个和同样缺失MHC限制的其它表位在T-细胞表位中是优选的，应在本发明的方法中使用的类似物中出现。这些超-混杂的表位可以是本发明中最简单的实施例，其中仅有一个修饰的饥饿激素多肽出现在接种的动物免疫系统中。
如上所述，饥饿激素的修饰也可以包括第一部分的引入，该第一部分将修饰的饥饿激素多肽变为APC或B-淋巴细胞。例如，第一部分可以是B-淋巴细胞特定的表面抗原或APC特定表面抗原的特定结合配体。本领域中许多这种特定的表面抗原是公知的。例如，部分可以是糖类，该糖类是B-淋巴细胞或APC(如甘露聚糖或甘露糖)上的受体。可选择的，第二部分可以是半抗原。明确认识APCs或淋巴细胞上的表面分子的抗体片断可以用作第一部分(例如，表面分子可以是巨噬细胞和单核细胞的FCY受体，如FCγRI或，可选择任何其它特定表面标记如CD40或CTLA-4)。需要注意的是，所有举例的目标分子也可以作为佐剂的一部分，如下所述。
为了获得增强的免疫反应，作为将修饰的饥饿激素多肽变为某种细胞类型的替代物或补充，通过包括上述刺激免疫系统的第二部分，其可能增加免疫系统的应答水平。第二部分的代表性例子是细胞因子和热休克(heat-shock)蛋白或分子伴侣(molecular chaperones)，以及其中有效的部分。
根据本发明，使用的合适的细胞因子是那些通常在疫苗组分中作为佐药的，例如，干扰素γ(IFN-γ)、白介素1(IL-1)、白介素2(IL-2)、白介素4(IL-4)、白介素6(IL-6)、白介素12(IL-12)、白介素13(IL-13)、白介素15(IL-15)和刺激因素(GM-CSF)的粒细胞-巨噬细胞群；可选择的，细胞因子分子的功能部分可以作为第二部分。关于这种细胞因子作为佐药物质的应用将在下面叙述。
根据本发明，用作第二部分的合适的热休克蛋白质或分子伴侣可以是HSP70(热休克蛋白70、)、HSP90(热休克蛋白90)、HSC70(热休克同源蛋白70)、GRP94(和gp96一样公知，Wearsch PA et al.1998，Biochemistry 375709-19)和钙网蛋白(calreticulin，CRT)。
可选择的，第二部分可以是毒素、如李氏杆菌(listeriolycin，LLO)、油脂A和可加热的肠毒素。许多分支杆菌的衍生物也是可选择的，如MDP(胞壁酸酶)、CFA(完全的弗氏’s佐药)和海藻糖双脂基(diesters)TDM和TDE引入增强免疫系统中的修饰饥饿激素多肽出现的可能性是本发明一个重要的实施例。这个原则也通过几个实施例显示了。例如，公知的是，锚定在伯氏疏螺旋菌(Borrelia burgdorferi)蛋白质OspA的棕榈酰脂可以使用，以提供自体调整多肽(cf.如WO 96/40718)-油脂蛋白质(lipidatedproteins)和核形成胶束样的结构，该核包括多肽的油脂锚定部分和分子突出的剩余部分，从而导致抗原定子的多重出现。因此，这种使用和用不同油脂锚(如十四烷基、法呢基、香叶酯-香叶酯基、GPI-锚和N-酰甘油二酯基)的相关的方法在本发明中是优选的实施例，特别是由于在重组细胞中产生的蛋白质的油脂锚的规定是相当易懂的，并且对于修饰的饥饿激素多肽来说，仅仅要求将如天然生成信号序列作为融合部分。
另一种可能就是使用补充因素C3或C3自身的C3d片段(cf.Dempsey ETAL.，1996，Science 271，348-350 and Lou & Kohler，1998，NatureBiotechnology 16，458-462)。
另一种提供表位区域的有吸引力的方法是WO 00/32227公开的技术，其中抗原以规则的重复图样出现，因而产生独立类似病毒衣壳的免疫原的T-细胞，在本发明的上下文中，WO 00/32227中的技术是专业辅助的应用。因而WO 00/32227的公开在此处作为参考。本发明可选择的实施例是共价结合的聚氨基酸，该实施例也使饥饿激素多肽的重要的表位区域的多重(如至少是2)复制优选的出现在免疫系统中，该聚氨基酸选自饥饿激素多肽、以及其后续、或某种分子的类似物、当有必要时和上述讨论的外源TH表位或其中的第一、第二或第三部分一起。例如，可以用高分子材料，如聚羟基聚合物，特别是糖类如右旋糖苷，cf.如Lees A et al.，1994，Vaccine 121160-1166；Lees A et AL.，1990，J Immunol.1453594-3600，但是甘露糖和甘露聚糖也是有用的替代物。例如，E.大肠杆菌和其它的细菌的整合膜蛋白也是有用的结合模式。传统的载体分子如钥孔血蓝蛋白(Keyholelimpet hemocyanin，KLH)、破伤风类毒素、白喉类毒素和牛血浆蛋白(BSA)也是优选和有用的结合模式。共价配位饥饿激素多肽至药学上可接受的聚羟基聚合物如糖类的优选的实施例包括至少一种个饥饿激素多肽和至少一种个外源T-辅助表位的应用，这些决定基分别配位到聚羟基聚合物(即外源T-辅助表位、彼此不熔的结合到作为载体主链的聚羟基聚合物的饥饿激素多肽)。当执行饥饿激素多肽区域的合适的B-细胞表位由短的肽伸展组成时，这种实施例是最优选的-这是因为这是一种非常方便的获得在最终的免疫原试剂中的选择表位的多重出现的方法。
特别优选的是，聚羟基聚合物的聚氨基酸的耦合是通过由肽酶分解的氨基键实现的。这种方法具有这样的效果APCs将能够继续这种结构，同时能够处理该结构和随后在MHC-II中出现的外源T-细胞表位。
获得肽(有益的饥饿激素多肽和外源的表位)的耦合的方法是激活合适的聚羟基聚合物和tresyl(三氟乙基-磺酰基)或其它合适的激活基团如马来酰亚胺、p-氮苯基卡乐甲酸盐(用于激活羟基和肽和聚羟基聚合物间的肽键的形成)和甲苯磺酰基(p-甲苯磺酰)。例如，可以制备WO 00/05316和US 5,874,469公开的活性多糖，并和通过传统固体或液相肽合成技术制备的T-细胞表位和饥饿激素肽耦合。最终的产品包括聚羟基聚合物主链(如一个右旋糖苷主链)，并通过他们的N-末端或其它可用的氮气部分、饥饿激素多肽和外源T-细胞表位连接。如果需要，合成饥饿激素多肽也是可以的，以便保护所有可得的氨基酸基团， 而不是在N-末端的一个、随后耦合最终被保护的肽至tresylated右旋糖苷部分和最终不保护的最终变化。这种方法的特定实例在下述的实施例中公开。
不使用WO 00/05316和US 5,874,469中公开的水溶性多糖分子，使用交叉耦合的多糖分子也是一样可能的，因而得到多肽和多聚糖之间的微粒配对被认为是导致多肽的免疫系统的改善的出现，当注入配对和获得对ACPs的靶子有吸引力的微粒时，两个目的都达到了，即获得了局部沉积效应。使用这种微粒系统的方法在实例中也进行了详述。
考虑到在下面饥饿激素多肽中引入修饰的选择区域是a)公知和预知的B-细胞表位的保存，b)3D结果的保存，c)避免B-细胞表位出现在“生产者细胞”上等等。如上所述，不管怎样，筛选一系列可以在不同位置引入T-细胞表位的修饰的饥饿激素分子是相当容易的。
以饥饿激素成熟的形式和前肽(propeptide)的形式为目标的接种疫苗可以正视，这两种形式被认为可以具有明显的优点。通过以前肽为靶子可以干扰导致成熟饥饿激素形成的酶的处理过程。如果所用的免疫原包括成熟饥饿激素和前饥饿激素的B-细胞表位，然后形成的抗体将具有最大的下调的成熟的饥饿激素不仅其有可能抑制成熟的饥饿激素，而且它的形成由于酶处理过程被初抑将降低，这是因为强的粘合抗体将“隐藏”分裂的位置和其它要发生的酶分裂的重要位置。
另一方面，如果要降低成熟饥饿激素的水平至较低的水平，优选针对没有包括足够数量的成熟饥饿激素的前肽部分进行接种免疫。
最后，如果仅有兴趣以成熟分子(和公知的非-饥饿激素具有很少一样的序列)为靶，免疫原应该包括成熟饥饿激素中的B-细胞表位。
由于本发明最优选的实施例包括对抗人类饥饿激素的免疫，因此优选的是上述讨论的饥饿激素多肽是人类的饥饿激素多肽。然而，下述关于人类饥饿激素的任何讨论能够用于其它物种的饥饿激素，特别是列在应用中的序列。可以理解，和人类序列变化相关的教导也调换到相关动物的相关序列从列举的序列来看，其出现在能够发现成熟饥饿激素肽序列的边界，可以理解，人类序列中的任何特定的序列数据将偏移吸收在不同哺乳动物饥饿激素序列中的相应序列。
在与人类饥饿激素相关的实施例中，特别优选的是人类饥饿激素多肽通过取代至少一种个在SEQ ID NO11的氨基酸序列进行修饰，至少一种个相同或不同长度的氨基酸序列和含有外源TH表位。可选择的，外源TH表位可以简单插入SEQ ID NO11。
进一步明确的，含有(完全的)引入到SEQ ID NO11的氨基酸序列的TH可以引入到任何氨基酸的SEQ ID NO11。即，任何氨基酸之后的引入是可能的SEQ ID NO11中的氨基酸1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、10O、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116和117；并且，如果是加入，则在氨基酸1的前面。这也伴随着下述氨基酸的缺失，即SEQ ID NO11中的氨基酸1和/或2和/或3和/或4和/或5和/或6和/或7和/或8和/或9和/或10和/或11和/或12和/或13和/或14和/或15和/或16和/或17和/或18和/或19和/或20和/或21和/或22和/或23和/或24和/或25和/或26和/或27和/或28和/或29和/或30和/或31和/或32和/或33和/或34和/或35和/或36和/或37和/或38和/或39和/或40和/或41和/或42和/或43和/或44和/或45和/或46和/或47和/或48和/或49和/或50和/或51和/或52和/或53和/或54和/或55和/或56和/或57和/或58和/或59和/或60和/或61和/或62和/或63和/或64和/或65和/或66和/或67和/或68和/或69和/或70和/或71和/或72和/或73和/或74和/或75和/或76和/或77和/或78和/或79和/或80和/或81和/或82和/或83和/或84和/或85和/或86和/或87和/或88和/或89和/或90和/或91和/或92和/或93和/或94和/或95和/或96和/或97和/或98和/或99和/或100和/或101和/或102和/或103和/或104和/或105和/或106和/或107和/或108和/或109和/或110和/或111和/或112和/或113和/或114和/或115和/或116和/或117。
然而，和针对前肽的免疫相比，对抗饥饿激素的前-前肽形式的免疫是相关的，这不是期望的，优选的是，引入在下述任何氨基酸之后，即SEQID NO11中的氨基酸23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、和117(由于氨基酸23在人类饥饿激素的信号序列中是最后的氨基酸，所以在饥饿激素分子的前肽区域进行引入)，并且信号序列中没有氨基酸是免疫原的部分。
在需要以完全的前肽为靶子的实施例中，和上所述比较，优选的是避免前饥饿激素(proghrelin)中的B-细胞表位的破坏-因此，在此实施例中，外源TH表位的引入没有或仅仅伴随非常有限的SEQ ID NO11中的其中之一的氨基酸的缺失，这些氨基酸为氨基酸24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116和117。
另一方面，如果需要提供不包括在成熟饥饿激素序列中的“免疫原的“饥饿激素，和上所述比较，这些引入优选包括SEQ ID NO11中的许多氨基酸的缺失，这些氨基酸的数目为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50和51。从而，优选的是非-破坏性(即B-细胞表位保存/缺失/取代)在SEQ ID NO11中的下述氨基酸中发生，这些氨基酸为52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116和117。在这个实施例中，特别优选的是所有的氨基酸1-51被消除。
最终，如果需要提供不包括前饥饿激素部分中的任何B-细胞表位的饥饿激素变型，该前饥饿激素没有形成成熟分子的部分，然后外源TH表位的引入应伴随SEQ ID NO11中许多氨基酸的缺失，这些氨基酸为氨基酸52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116和117。因而，优选的是，优选的是非-破坏性(即B-细胞表位保存/缺失/取代)在SEQ ID NO11中的下述氨基酸中发生，这些氨基酸为24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、 41、42、43、44、45、46、47、48、49、50和51。在这个实施例中，最优选的是所有的氨基酸52-117被消除。
本发明的另一实施例是饥饿激素类似物的出现，该类似物不包括这样的饥饿激素的任何序列，该饥饿激素是有成果的连接至开始T-细胞应答的MHC的II型分子。
利用免疫原使免疫系统诱导抗-饥饿激素免疫反应的机理如下值得注意的是，当自体蛋白是佐剂时，存在的危险时在一些接种的个体中，诱导的免疫反应不能仅仅通过停止免疫而停止，其中佐剂强有力的突破了个体针对自体蛋白的耐药性。这是因为，在这些个体中的诱导免疫反应很可能时通过自体蛋白的天然TH表位驱动的，由此产生的副作用时接种的个体自体蛋白能够以符合自己的方式而成为免疫试剂因而一个自动免疫情况产生了。
依作者所掌握的知识来看，包括使用外源TH表位的优选的方法从来没有产生这样的效果，因为抗-自体免疫反应由外源的TH表位驱动，而且在免疫终止后，发明人重复演示了由优选的技术刺激的诱导免疫反应实际上降低了。然而，理论上，免疫反应由相关自体蛋白的自体TH表位驱动也可以在一些个体上发生-特别是考虑到相关的自体蛋白非常丰富，而其它治疗性的相关的自体蛋白仅仅局部出现或在体内很少量的出现，所以“自体免疫效果”没有可能性；然而，对于饥饿激素，这种效果不能排除。
因此，一种非常简单的避免这种自体免疫的方法是避免肽序列免疫原的内含物作为TH表位(并且由于少于9个氨基酸的肽不能作为TH饥饿激素，使用短的片段是一种简单易行的方法)。因此，本发明的这个实施例也用于确保免疫原不包括可以作为“自体刺激TH表位”的靶子饥饿激素的肽序列，该表位包括的序列仅仅包括目标蛋白序列中的保守取代，该目标蛋白也可以作为TH表位。
饥饿激素类似物免疫系统出现的优选的实施例包括含有至少一种来源于肽的饥饿激素的嵌合肽的使用，该嵌合肽不有成效的和MHC的II型分子连接，并且至少一种外源的T-辅助表位。
而且，优选的是衍生于肽的饥饿激素具有一B-细胞表位。如果免疫原的类似物是一个是特别有利的，其中含有一个或多个B-细胞表位的氨基酸序列以连续的序列或包括插入的序列代替，其中插入包括外源T-辅助表位当在饥饿激素区域进行的合适的B-细胞表位由短的肽的伸展组成时，该实施例是最优选的，并且不能有成效的连接到MHC的II型分子。因此，选择的B-细胞表位或饥饿激素的表位包括最多9个相关动物的相关饥饿激素的连续氨基酸，即至少9个连续的氨基酸的序列号为9、10、11、12、13、14。
较短的肽是优选的，如那些在饥饿激素氨基酸序列中至多有8、7、6、5、4或3个的连续氨基酸。
优选的是，类似物包括至少序列号为9、10、11、12、13或14的序列，以上至少每个序列独立的由饥饿激素中的氨基酸伸展组成，该饥饿激素选自由9、8、7、6、5、4和3个连续氨基酸组成的基团。
特别优选的是，连续氨基酸从氨基酸残基开始，氨基酸残基选择由SEQID NO9、10、11、12、13或14的下述残基组成的基团残基1和/或2和/或3和/或4和/或5和/或6和/或7和/或8和/或9和/或10和/或11和/或12和/或13和/或14和/或15和/或16和/或17和/或18和/或19和/或20和/或21和/或22和/或23和/或24和/或25和/或26和/或27和/或28和/或29和/或30和/或31和/或32和/或33和/或34和/或35和/或36和/或37和/或38和/或39和/或40和/或41和/或42和/或43和/或44和/或45和/或46和/或47和/或48和/或49和/或50和/或51和/或52和/或53和/或54和/或55和/或56和/或57和/或58和/或59和/或60和/或61和/或62和/或63和/或64和/或65和/或66和/或67和/或68和/或69和/或70和/或71和/或72和/或73和/或74和/或75和/或76和/或77和/或78和/或79和/或80和/或81和/或82和/或83和/或84和/或85和/或86和/或87和/或88和/或89和/或90和/或91和/或92和/或93和/或94和/或95和/或96和/或97和/或98和/或99和/或100和/或101和/或102和/或103和/或104和/或105和/或106和/或107和/或108和/或109和/或110和/或111和/或112和/或113和/或114和/或115和/或116，其中，可以给出连续伸展的长度和相关的饥饿激素多肽。
在上述所有的变型中，出现了成熟饥饿激素的n-辛酰化(octanyolated)的丝氨酸，优选的是，以没有辛酰化的方式制备免疫原的构成物(或者以肽的合成或用不引入辛酰化的表达系统自备这种构成物)。这种方式确保了上述构成物在CNS中没有生理活性。
饥饿激素和修饰的饥饿激素多肽的制剂当以服用的方式影响到饥饿激素多肽或修饰的饥饿激素多肽出现在动物的免疫系统时，多肽的剂型通常按照现有技术的规则进行。
通常，含有肽序列作为活性成分的疫苗的制备在本领域是很容易理解，如US4,608,251；4,601,903；4,599,231；4,599,230；4,596,792和4,578,770公开的实例在此处作为参考。代表性的，这种疫苗可以注射的方式如液体溶液或悬浮液的方式制备；溶于液体溶液或悬浮液的固体在注射前也可以制备。制备也可以乳化。活性免疫原组分经常和药学上可接受的和活性组分相容的赋形剂混合。
例如，合适的赋形剂是水、盐水、葡萄糖、甘油、乙醇或类似物，以及上述的结合。除此之外，如果需要，疫苗可以含有少量的辅助物质如润湿剂或乳化剂，PH缓冲剂，或提高疫苗效果的佐剂；佐剂将在下面详细说明。
通常，疫苗通过注射服用而不经过肠道，例如，皮下的、皮内的、皮层内的、真皮的或肌肉。适合其它方式的服用的剂型包括栓剂，在某些情况下是口头的、口腔的、舌下的、腹膜内的、阴道内的、肛门的、硬脑膜外的、脊骨的和颅骨内的剂型。对于栓剂，传统的粘合剂和载体可以包括如聚亚烃基(polyalkalene)乙二醇或甘油三酸酯；这种栓剂可以从含有0.5％-10％的活性组分的混合物形成，优选为1-2％。例如，口头的剂型包括常用的赋形剂如药物级别的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁，及其类似物。这些组分的形式为溶液、悬浮液、片剂、药丸、胶囊、持续释放的剂型或粉末，并含有10-95％的活性组分，优选为25-75％。对于口服的剂型，霍乱毒素是有益的剂型助剂(也可能是结合配体)。
多肽可以中性或盐的形式形成疫苗。药学上可接受的盐包括酸式盐(和肽的自由氨基一起形成)，并和无机酸如盐酸或磷酸一起形成，或者是有机酸如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸和其类似物。和自由羧基一起形成的盐也来自于无机碱如钠、钾、铵、钙、或镁的氢氧化物，有机碱如异丁胺、三甲胺、2-乙胺乙醇、组织氨基酸、普鲁卡因及其类似物。
疫苗以合适的剂量服用，这种剂量是治疗上有效和免疫原的。服用的量取决于治疗的对象，包括个体免疫系统镶嵌免疫反应的能力和需要保护的程度。合适的剂量为每次接种疫苗的活性组分为几百毫克，范围为0.1-2000毫克(即使高1-10毫克的量也是可预期的)，如0.5-2000毫克或0.5-1000毫克，优选为1-500毫克，特别优选的范围为10-100毫克。合适的初始服用和追加注射(booster shot)的摄生法也是可变的，但是以随后的接种或其它服用的初始服用来表示。
应用的方式可以有很大不同。疫苗的任何传统的服用方法都是可用的。这些方法包括生理可接受的基体、固体方式服用或生理可接受的胶体，非肠道的注射或类似的方法。疫苗的剂量取决于服用的路线，根据需要接种形成抗原的不同年龄的人会有不同。
一些疫苗的多肽在疫苗中是充分免疫原的，但是，如果疫苗进一步包括佐药，一些免疫反应会增强。
疫苗获得辅助效果的各种方法是公知的。常用的原则和方法在THETheory and Practicai Application of Adjuvants″，1995，Duncan E.S.Stewart-Tull(ed.)，John Wiley & Sons Ltd，ISBN 0-471-95170-6，也在″VaccinesNew Generation Immunological″，1995，Gregorialdis G etal.(eds.)，Plenum Press，New York，ISBN 0-306-45283-9中详细公开了，这两篇文献在此处引用并作参考。
特别优选的是使用可以有利于突破自体抗原的自体耐药性的佐剂；事实上，这对于未修饰的饥饿激素用作自动免疫的活性组分是必要的。合适佐剂的非限制例子选自由免疫靶子组成的基团；免疫调制佐剂如毒素、细胞因子和分枝杆菌的衍生物；油的形式；高分子；形成佐剂的胶束；皂角苷；免疫刺激的复矩阵(ISCOM matrix)；微粒；DDA；铝佐剂；DNA佐剂；γ-菊粉；以及胶囊佐剂。通常要注意的是上述公开的化合物和试剂在类似物中可用作第一、第二和第三部分，也可用在本发明的疫苗的佐剂中。
佐剂的应用包括试剂的应用，如氢氧化铝或磷酸铝，通常在盐的缓冲液中的百分比为0.05-0.1％，和0.25％的糖的合成高分子(如Carbopol)混合，以加热的方式对疫苗中的蛋白质进行积聚，温度范围为70℃-110℃，加热时间为30秒-2分钟，采用交叉耦合的方式进行积聚也是可以的。下述积聚是可以采用的通过胃液素将抗体(Fab片段)处理成白蛋白的再生作用，和细菌细胞如孢子虫(C.parvum)或内毒素或革兰氏阴性细菌的脂多糖成分混合，在生理可接受的油赋形剂(oil vehicles)中的乳状液，如二缩甘露醇单油酸盐(Aracel A)，或用作代用品的有20％的碳氟化合物(Fluosol-DA)的乳状液。和油如鲨烯和IFA的混合也是优选的。
根据本发明，DDA(二甲基二十八烷基溴化铵)是作为佐剂的有益的备选物，不仅包括DNA和γ-菊粉，而且弗氏完全或非完全的佐剂和糖萜素(quillaja saponins)如QuilA和QS2作为RIBI也是有益的。进一步的可能性是磷酰基油脂A(MPL)，上述的C3和C3d，以及胞壁酰二肽(MDP)。
和佐剂的效果相比，油脂的形成是公知的，因此，根据本发明，油脂佐剂是优选的。
根据本发明，免疫刺激复矩阵类型(ISCOM矩阵)佐剂也是优选的选择，特别是由于这种佐剂的类型通过ACPs能够上调MHC的II型表达。ISCOM矩阵由皂角苷(三萜系化合物)组成(比例可选择的)，该皂角苷来自糖萜素、胆固醇和磷脂。当和免疫原蛋白混合时，最终微粒的形成公知的是ISCOM微粒，其中皂角苷的比例为60-70％w/w。有关组合物和免疫刺激混合物的详细情况可以在如上述的处理佐剂的文献中找到，而且，Morein B etal.，1995，Clin.Immunother.3461-475和Barr IG and Mitchell GF，1996，Immunol.and Cell Biol.748-25(都作为此处的参考文献)提供了制备完全的免疫刺激化合物的有用的方法。
获得佐剂效果的另一高度有益的可能性(并且是优选的)是采用Gosselin ET AL.，1992(此处用作参考)中公开的技术。简单的说，相关免疫原如本发明的抗原的出现可以将抗原变为针对单核细胞/巨噬细胞上的FCY受体的抗体(或抗原结合抗体片段)。特别是抗原和抗-FcγRI之间的变化已用来提高接种疫苗的免疫性。
其它的可能性包括上述靶子和免疫调制物质(i.a.细胞因子)的使用，这些物质在修饰的饥饿激素中用作第一和第二部分。在这种关系上，象poly IC的细胞因子的合成诱导剂也是可能的。
合适的分枝杆菌的衍生物选自下述物质组成的基团胞壁酰二肽、完全的弗氏佐剂RIBI和海藻糖二酯如TDM和TDE。
合适的免疫靶子佐剂选自下述物质组成的基团CD40配合体、抗体或特定的粘合片段(和上述讨论比较)、甘露糖、Fab片段和CTLA-4。
合适的高分子佐剂选自下述物质组成的基团糖类如右旋糖苷、PEG、淀粉、甘露聚糖和甘露糖；塑料高分子和橡胶如乳珠。
当然，另一种调制免疫反应的有益方法包括“实质的淋巴腺”(VLN)(所有由Immunotherary，Inc.，360 lexington avenue，New York，NY10017-6501设计的医疗设备)中的饥饿激素免疫原(可选择的和佐剂与药学上可接受载体和赋形剂一起)。VLN(一纤细的管状设备)模拟淋巴腺的功能和结构。皮下VLN的插入和细胞因子和化学运动性的高潮一起产生了无菌炎症的位置。T-、B-细胞和APCs很快应答危险信号，跟踪到发炎的位置并在VLN的多孔矩阵内积聚。很明显，当使用VLN时，需要镶嵌免疫反应至抗原的必要的抗原剂量降低，免疫保护和使用胜过传统的以Ribi作为佐剂的接种疫苗的VLN接种疫苗比较。该技术在Gelber C et al.，1998，″Elicitation of Robust Cellular and Humoral Immune Responsesto Small Amounts of Immunogens Using a Novel Medical DeviceDesignated the Virtual Lymph Node″和″From the Laboratory to theClinic，Book of Abstracts，October 12th-15th 1998，Seascape Resort，Aptos，California″进行简要的叙述。
许多事例已经显示，疫苗的微粒形成增加了蛋白质免疫原的免疫性，因而是本发明另一优选的实施例。
微粒制备成抗原和高分子、油脂、糖类制成共同制剂或适合制备微粒的其它分子，或者微粒可以是仅有抗原自身组成的均质粒子。
以微粒为基体的高分子的实例有以微粒为基础的PLGA和PVP(Gupta RKet AL.，1998)，其中高分子和抗原浓缩成固体粒子。以粒子为基础的油脂可以制成在胶束里包裹抗原的油脂胶囊(称为脂质粒)(Pietrobon PJ，1995)。以粒子为基础的糖类通常由合适的可降解的糖类乳淀粉或壳聚糖制成。降糖类和抗原进行混合并以一种工艺进行浓缩，该工艺和用于高分子粒子的类似(Kas HS et AL.，1997)。
仅由抗原组成的粒子可以通过各种喷雾和冷冻干燥的技术进行制备。特别适合本发明目的的是用于制备均一和可控尺寸的高临界流体技术(York P，1999 & Shekunov B et al.，1999)。
期望疫苗至少每年服用一次，例如至少每年是1、2、3、4、5、6和12次。进一步明确期望每年1-12次，如对于需要的个体是每年1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12次。前面已经显示，根据本发明，通过使用优选的自动免疫诱导的记忆免疫性不是永久的，因而免疫系统需要定期的由类似物挑战。
由于基因变异，不同个体可以和改变同一多肽的力量的免疫反应进行反应。因此，根据本发明，为了增加免疫反应，疫苗可以包括几种不同的多肽，也和上述讨论的关于外源T-细胞表位的引入进行比较。免疫可以包括两种或多种多肽，其中所有的多肽是上面描述的。
免疫因而抗原包括3-20种不同的修饰的或非修饰的多肽，如3-10种不同的多肽。然而，通常多肽的数目可以保持最少，如1-2种多肽。
至于本发明饥饿激素类似物的替代物，也可以用抗-同型抗体或普通的模拟簇(mimotopes)进行免疫。模仿饥饿激素表位制备抗-独特型抗体的技术在本领域是公知的，一个特别有益的方法包括自体抗-独特型抗体的使用，并和抗-独特型抗体反应，通过引入外源T辅助表位进行修饰，如本发明所述。模拟簇可以从自由肽的库中分离出来，该自由肽的库从噬菌体显示对抗抗体中分离，并和饥饿激素结合。
核酸接种疫苗作为以肽基体的疫苗服用的替代物，核酸接种疫苗的技术(也称之为“核酸免疫”、“遗传免疫”和“基因免疫”)具有许多有益的特征。
首先，和传统疫苗方法对比，核酸接种疫苗不要求消耗大量免疫原试剂产品(如以产生修饰饥饿激素的微生物的工业规模的发酵的方式)。而且，不需要提纯设备和免疫原的再打折计划。最终，为了生成引入的核酸产品，由于核酸接种疫苗依赖于免疫个体的生化设备，所以希望产生表达产品的最佳的转译后的工艺；如果是自体菌苗接种，这就很重要，如上所述，由于原始的饥饿激素B-细胞表位的重要部分需要保存在修饰分子内，也由于理论上B-细胞表位可以由任何(生物的)分子(如糖类，油脂和蛋白质等)的部分组成；因此，免疫原的天然糖基化和脂化的模式对于所有的免疫性很重要，并期望确保具有产生免疫原的宿主。
因此，本发明的优选的实施例包括通过引入核酸影响修饰饥饿激素出现于免疫系统，该核酸降修饰的饥饿激素解码为动物细胞，从而从引入的核酸细胞获得体内的表达。
在这个实施例中，引入的核酸优选为DNA，其中DNA的形式为裸露的DNA、由负荷或非负荷的油脂形成的DNA、脂质粒中形成的DNA、包括在病毒型载体内的DNA、和转染-便利蛋白质或多肽形成的DNA、和靶向蛋白质或多肽形成的DNA、和钙沉淀剂形成的DNA、配位到惰性载体分子的DNA、在高分子中形成胶囊的DNA(如在PLGA(WO 98/31398中公开的胶囊技术)或几丁质或壳聚糖)、以及和佐剂形成的DNA。本文中需要注意的是，实际上，所有和传统疫苗形成的佐剂应用有关的需要考虑的事情都应用到DNA疫苗的形成。因此，此处以疫苗为基础的多肽的佐剂的应用相关的所有公开的内容作必要的修正后应用到核酸接种疫苗技术中。
至于上述详细讨论的以疫苗为基体的多肽的服用和服用计划的路线，对于本发明的核酸疫苗和上述与多肽的服用和服用计划的路线相关的讨论修正后应用到核酸中。需要增加的是，核酸疫苗可以是静脉和动脉服用。
而且，在本领域公知的是，核酸疫苗可以用所谓的的基因枪进行服用，因此这种方式和其它等同的服用方式都包括在本发明中。最后，据报道，服用中核酸的VLN的使用产生了很好的结果，因此这种特异的服用方式是特别优选的。
进一步，用作免疫试剂的核酸可以包括解码1st、2nd和3rd部分的区域，如上述免疫物质的形式，例如已讨论的作为有益佐剂的细胞因子。本实施例优选的方法包括在不同的阅读框架或至少在不同助剂的控制下具有密码区域的类似物和免疫调节剂(Immunomodulator)。因而，要避免类似物或表位成为免疫调节剂的辅助(partner)。可选择的，两个不同的核苷片段可以使用，但是，当同一分子中都包括密码区域时，由于确定的共同表达，所以不是优选的。
相应的，本发明也涉及诱导对抗饥饿激素抗体产品的成分，该成分包括-本发明中的核酸片段或载体(和下述讨论的载体比较)，以及-上述的药学或生理上可接受的赋形剂和/或载体和/或佐剂在正常情况下，饥饿激素变异-解码核酸以载体的形式引入，其中表达在病毒启动子(viral promoter)的控制下。根据本发明，并和下述讨论比较，将对载体和DNA片段有更多详细的讨论。
参照Donnelly JJ et al，1997，Annu.Rev.Immunol.15617-648与Donnelly JJ et AL.，1997，Life Sciences 60163-172，可以得到剂型相关以及核酸疫苗的详细公开。这两篇文献在此处作为参考。
活疫苗第三个实现修饰饥饿激素出现在免疫系统的替代物是采用活的疫苗的接技术。在活的疫苗中，对于动物，出现在免疫系统中是通过服用非病源微生物实现的，该非病源微生物和核酸片段一起转化、或与结合有这种核酸片段的载体一起转化。非病源微生物可以是任何合适的削弱的细菌链(通过通道削弱或通过由重组细胞DNA技术消除致病表达产品进行削弱)，如牛型分枝杆菌(Mycobacterium bovis)BCG..、非病源链球菌spp.、E.大肠菌、沙门氏菌spp.、弧菌霍乱、志贺氏痢疾杆菌等。例如，回顾处理本领域活疫苗的制备方法可以在Saliou P，1995，Rev.Prat.451492-1496和Walker PD，1992，Vaccine 10977-990中发现，这两篇文献在此作为参考。关于核酸片段和在活疫苗中用的载体将在下面详细论述。
作为细菌活疫苗的替代物，本发明下面讨论的核酸片段可以在非致命的病毒疫苗载体中结合，如牛痘和任何其它合适的痘病毒。
通常，非病源微生物活病毒对于动物只能服用一次，但在某些情况下，微粒获得保护性免疫，一生不止服用一次。甚至在使用活的或病毒疫苗时，上述针对多肽免疫的计划是非常有用的。
可选择的，活的或病毒疫苗和先前的或随后的多肽和/或核酸接种疫苗结合。例如，可以和活的或病毒疫苗一起影响初次免疫，该活的或病毒疫苗接着用多肽或核酸方法进行随后的免疫。
微生物或病毒可以和含有解码1st、2nd和3rd部分区域的核酸一起转化，如上述免疫物质的形式，例如已讨论的作为有益佐剂的细胞因子。本实施例优选的方法包括在不同的阅读框或至少在不同助剂的控制下具有密码区域的类似物和免疫调节剂。因而，要避免类似物或表位成为免疫调节剂的辅助。可选择的，两个不同的核苷片段可以使用。当然，在同一阅读框架中具有1st、2nd和3rd部分可以作为本发明的一表达产品和类似物，根据本发明，该实施例是特别优选的。
本发明的方法在疾病治疗和其它场合的应用由上可知，对抗饥饿激素的接种疫苗可以提供一有效的对需要降低超重脂肪的方式。而且，已经显示，饥饿激素受体(GSH-R)和饥饿激素的共同表达确实在前列腺癌细胞中发生(Jeffry PL et al.，2002，JEndocrinol，172(3)R7-11)。据报道，GSG-R的表达也在内分泌肿块中表达(Volante M et al.，2002 J Clin En-docrinol Metab，87(3)1300-8)；Papotti M et al(2001，J Clin Endocrinol Metab，86(10)5052-9)等也已经报道了胃的良性肿瘤的多数(75％)和肠内分泌肿块的25％对饥饿激素是免疫反应性的。换句话说，本发明的方法可以作为治疗肥胖、与饥饿激素和饥饿激素受体相关的癌症。
必须注意的是，很少量的饥饿激素的循环可以导致食品中营养成分的损失。一具有这种低饥饿激素浓度的个体在必要时没有饮食的动力。因而，为了确保治疗的个体摄取必要的营养，当前推荐的对人类的免疫治疗方法应和控制饮食一起进行。同时，为了避免一段时间后体重的锐减，减重的比例应仔细的监测；而且，应确保在治疗的个体进行锻炼，以保证肌肉的重量等。
据报道的例子的试验中，鼠饥饿激素的几种免疫原的变型作为诱导对抗鼠自体饥饿激素的免疫反应的免疫原。正如期望的一样，免疫导致了鼠和自体鼠饥饿激素反应的高浓度抗体诱导。然而，令人惊奇的，这些高抗体浓度伴随着这些鼠中循环饥饿激素水平的增加，并且这也增加了所测试的鼠的体重。体重的增加是由于肌肉重量、体内脂肪或两者的增加，还不得而知。
不希望这些效果组成普遍的现象；有几种解释这种相应免疫的免疫血清水平的增加-反馈环的存在，天然的调节饥饿激素产品应答由饥饿激素上调的分子的浓度，-一些在受体上诱导抗-饥饿激素抗体的直接效果，并和连接到调节分子的饥饿激素竞争，-一效应器分子的一些诱导抗-饥饿激素抗体的激活，其中通常由饥饿激素结合蛋白激活，因而刺激饥饿激素的产品，
-血流中全部免疫血清饥饿激素的上限浓度，由于饥饿激素结合的抗体的出现(即饥饿激素的分室作用(compartmentalization))，产生了大量的饥饿激素，并延长了饥饿激素的免疫血清半衰期；-饥饿激素和涉及控制饥饿激素表达等的“传感受体(sensorreceptor)”或“诱惑受体(decoy receptor)”间的交互作用上一些抗体的阻碍效应等。
根据本发明的试验，没有一种可能的解释能够被排除。特别的，在实例中测试的所有结构包括成熟鼠饥饿激素的完整的序列，这意味着对抗所有可能的饥饿激素B-细胞表位的抗体必须在免疫鼠的免疫血清中出现。并且，例如，如果饥饿激素中表面的上调是抗体结合与饥饿激素结婚分子或受体的位点的结果，此处公开的许多饥饿激素结构将不会诱导对饥饿激素产品具有刺激作用的抗体，因而这些结构将初步导致期望的饥饿激素的下调。
可选择的，如果效果仅仅是全部免疫血清中饥饿激素的可用量和免疫血清半衰期的延长的结果，当使用对抗自体蛋白和其它分子的接种疫苗时，开创了崭新的治疗方法。例如，在激素可以在靶向组织施加它们的影响时，象饥饿激素等激素需要穿过抗体不能穿过的障碍。当免疫活性的对抗这些分子时，分子内(抗体-受限或自由的)的免疫血清的水平和它们的半衰期将增加，从而导致大量可得到的分子。由于将分子绑定在靶向器官的受体和所有免疫血清间的平衡状态，该效果将荒谬的成为增加由分子施加的刺激的网，这是因为大量的分子能够穿越抗体不能透过的障碍。
因此，抗体结合分子的出现导致了分子施加的影响的增加。这种观念是新的，并且也能用于使用其它技术，其中特异分子的免疫血清的量可以增加(结合分子的可溶受体的服用，结合分子的单克隆抗体的服用)。
无论如何，这些特异的结果已经鉴别了对抗饥饿激素的免疫的不确定使用，即其中有益饥饿激素水平增加的情况。极瘦弱和厌食等情况前面已经建议用饥饿激素治疗，以及治疗管疾病如心力衰竭。这些疾病和症状在本发明的实施例中都是有用的，其中抗-饥饿激素免疫反应的诱导将导致循环饥饿激素水平的增加。
而且，在农业中使用这些意外的效果也是有益的。这有助于增加母牛和其它动物的奶中脂肪的产量，其中脂肪沉积和脂肪的产率是和口感极讨论的农产品的质量相关的。
饥饿激素也可以是生长激素释放的刺激剂，在某些情况下，增加生长激素的产量也是有益的，本发明的方法提供了替代物，所以可以避免重复服用生长激素。一些应用包括试管肥料的使用(其中生长激素治疗建议作为治疗的佐剂)，在伤口包扎中应用(如严重烧伤)和严重外伤的治疗，如上所述的诱导农业中动物的生长，延长心力衰竭病人的生命和作为“抗衰老”的药物。
肽、多肽和本发明的组合物从上面可以明显的看出，本发明是基于对抗饥饿激素抗原的个体免疫的概念。获得这种免疫的优选的方法是使用修饰的饥饿激素，进而提供现有技术中没有公开的分子。
可以确信，此处讨论的修饰的饥饿激素分子是有创造性的，因此本发明中的重要部分和饥饿激素类似物相关，该饥饿激素类似物来自动物饥饿激素，其中引入了修饰，修饰的结果是动物中类似物的免疫诱导了和未修饰的饥饿激素多肽交叉反应的抗体的生成。优选的是，当讨论使用修饰饥饿激素的本发明不同实施例的方法时，修饰的本质和上述修饰的类型一致。因此，为了叙述本发明中的饥饿激素类似物，此处出现的和修饰饥饿激素分子相关的任何公开是相关的，任何公开经过修正后，豆科应用到这些类似物的描述中。
需要注意的是，优选的修饰饥饿激素分子包括导致至少70％和饥饿激素一致的序列的多肽的生成，或者随后在长度上至少有10个氨基酸。高度一致的序列是优选的，如至少75％和至少为80％或85％。蛋白质和氨基酸序列的一致性可以这样计算(Nref-Ndif)·100/Nre；其中，当两个序列排列时，Ndif是非一致残基的总数，Nref是其中之一的残基的数目。因此，DNA序列AGTCAGTC和序列AATCAATC(Ndif＝2和Nref＝8)有75％的一致。
本发明也和实施本发明方法有益的成分相关。
因此，本发明也涉及含有免疫有效量的饥饿激素多肽的免疫原的成分，该多肽是动物的自体蛋白或如饥饿激素多肽的亚序列，所述的饥饿激素多肽或与免疫原可接受的佐剂一起形成的后续，以突破动物针对饥饿激素多肽的自体耐药性，该成分进一步包括药学上或生理上可接受额赋形剂和/或载体。换句话说，本发明的本部分和天然生成的饥饿激素多肽/后续的形成有关，并将在本发明方法实施例中公开。
本发明也涉及含有上述免疫有效量的饥饿激素类似物的免疫成分，所说的成分进一步含有药学上和免疫上可接受的稀释剂和/或赋形剂和/或载体和/或赋形剂和优选的佐剂。换句话说，本发明的本部分包括修饰饥饿激素的形成，特别是上述的。当修饰的和非修饰的饥饿激素的形成用作本发明的方法中对抗饥饿激素类似物的免疫时，佐剂、载体和赋形剂的选择相应的和所讨论的一致。
根据本领域中公知的方法制备多肽。较长的多肽通常重组细胞基因技术进行准备，该技术包括引入将饥饿激素类似物解码成合适的载体的核酸序列、与载体一起的合适的宿主细胞的转化、核酸序列的表达、从宿主细胞或它们的培养的上清液中再生表达产品、以及后续的提纯和可选择的进一步修饰，如卷叠(refolding)或衍生。
较短的肽优选通过公知的技术准备，即固体-或液相肽的合成。然而，该技术最近的进步已经能够生成完整长度的多肽和蛋白质，因而通过合成的方法进行制备长结构(long constructs)也包括在本发明的范围内。
本发明中的核酸片段和载体从上述公开的内容可以得知，修饰饥饿激素多肽可以通过重组细胞基因技术进行制备，也可以通过化学合成或半合成进行制备；当修饰存在配对的蛋白质载体(如KLH、白喉毒素、破伤风毒素和BSA)和非蛋白质的分子如糖类高分子时，当然也在修饰包括侧链或侧基添加至饥饿激素多肽衍生的肽链，后者的两个选择通常是很相关的。
对于重组细胞基因技术和核酸免疫，解码修饰饥饿激素的核酸片段时重要的化学产品。因此，本发明的重要部分和和解码饥饿激素类似物的核酸片段相关，即饥饿激素衍生的多肽，该多肽包括添加或插入融合伴侣的天然饥饿激素序列，或优选为饥饿激素衍生的多肽，其中该多肽通过插入和/或添加引入到外源T-细胞表位。本发明的核酸片段时DNA或RNA的片段。
本发明的核酸片段通常插入合适的载体，以形成克隆或负载有本发明核酸片段的表达载体；这种新颖的载体也时本发明的一部分。关于上述本发明的载体的详细结构将在下面变型细胞和微生物的部分进行讨论。根据应用的类型和目的，载体的形式不仅可以为质粒、噬菌体、粘粒、微型-染色体或病毒，而且，仅在某种细胞短暂表述的裸露的DNA是重要的载体。优选的克隆和载体表达载体可以是自己复制，因而能够高水平表达载体的高复制数目或随后克隆的高水平复制。
本发明的载体一般的要点包括下述5’→3’中的特征和可操作的连接中的特征本发明中的针对核酸片段驱动表达的启动子，可选择的解码前导肽的核酸片段序列使分泌物(细胞外的相或应用在外周胞质)或整合成多肽片段的膜，本发明的核酸片段和解码终止子的可选择的核酸序列。当使用生产菌株或细胞系中的表达载体载体时，是为了转化细胞的稳定性，优选为引入宿主细胞的载体在宿主细胞基因组中是完整的。与之相比较，当和用于动物中体内表达载体的载体一起有效时(即使用DNA接种疫苗中的载体时)，为了安全起见，载体不能结合到宿主细胞的基因组；通常，裸露的DNA或非结合的病毒载体使用时，对于本领域的技术人员来说，这些选择是公知的。
本发明的载体用于将宿主细胞转化为生产本发明的修饰饥饿激素多肽。这种转化的细胞，也是本发明的一部分，可以是培养细胞或细胞系，并被用于本发明的核酸片段的繁殖和载体。可选择的，转化细胞可以是合适的或的疫苗同族，其中核酸片段(一个或多个复制的)被插入，以影响分泌或同化成病菌膜或修饰饥饿激素细胞壁。
本发明优选的转化细胞例如是细菌(如埃希氏菌种(如大肠杆菌)、杆状菌(如枯草杆菌)、沙门氏菌或分支杆菌(优选为非病原的，如M.bovisBGG)、酵母(如酵母蜡))和原体内物。可选择的，转化细胞来自于多细胞有机体，如菌类、昆虫细胞、植物细胞或哺乳动物细胞。和下述的细胞系和载体的讨论比较，大部分优选的细胞来自人类。最近的结果表明在使用商业可得到的黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)细胞系(绒鸭2(S2)细胞系和载体可以从Invitrogen得到)进行本发明饥饿激素类似物的重组细胞的生产时，效果很有吸引力，因此表达载体体系是特别优选的。夜蛾(spodoptera)细胞(SF细胞)SF9和SF21是优选的。
为了克隆和/或优化表达载体，优选的是，转化细胞可以复制本发明的核酸片段。细胞表达核酸是本发明优选和有用的实施例；它们可以是小规模或大规模的修饰饥饿激素的制备，或者在某些情况下，非病原性细菌和疫苗组成和的疫苗。
当通过转化细胞生产本发明修饰的饥饿激素时，尽管远不是必要的，表达载体的产品暴露在培养基或在转化细胞表面进行是很方便的。
当有效的生产细胞被鉴别时，在此基础上，建立稳定的细胞系是优选的，该细胞系负载本发明的载体和表达解码修饰饥饿激素的核酸片段。优选的这种稳定的细胞系隐藏或负载了本发明的饥饿激素类似物，因而有利于上述的提纯。
通常，衍生于和宿主细胞相容的含有复制和控制序列的质粒载体在相关的宿主细胞中使用。载体通常负载有复制的位置，以及能够在转化细胞中提供表型选择的标记序列。例如，E.大肠杆菌通常用pBR322转化，衍生于E.大肠杆菌物种(参照如Bolivar et al.，1977)的质粒。pBR322质粒基因含有氨比西林和四环素抗性的基因，因而提供鉴别转化细胞的简单方式。pBR322质粒或其它微生物质粒或噬菌体必须也含有或修饰还有启动子，该启动子可以通过原核微生物进行表达。
大部分通常用在原核重组细胞DNA结构的启动子包括B-内酰胺酶(青霉素酶)、乳糖启动子体系(Chang et al.，1978；Itakura et AL.，1977；Goeddel et al.，1979)和色氨酸(trp)启动子体系(Goeddel et AL.，1979；EP-A-0 036 776)。当这些被普遍使用时，其它的微生物启动子已经发现并被利用，有关这些核酸序列的详细情况已经公开，并能使技术人员将它们功能性的结合到质粒载体(Siebwenlist et al.，1980)。来自原核生物的某些基因已经通过自身的启动子序列在E.大肠杆菌中充分表达，排除了通过人工方式加入另一启动子的需求。
除了原核生物、真核生物，例如，酵母培养也可以使用，此处的启动子应该能够驱动表达载体。食用酵母(Saccharomyces cerevisiae)，或一般的面包酵母在真核生物中是最常用的，尽管大量的其它的同族也可以得到。例如，对于酵母中的表达载体，质粒YRp7是常用的(Stinchcomb et AL.，1979；Kingsman et AL.，1979；Tschemper et AL.，1980)。这种质粒已经包含了trpl基因，该基因提供一针对缺乏在色氨酸如ATCC No.44076或PEP4-1(Jones，1977)中生长的能力的酵母突变株的选择标记。然后，作为酵母宿主细胞基因组的trpl损害的出现在色氨酸的缺乏时对通过生长探测转化提供有效的氛围。
酵母载体中合适的促进序列包括3-磷酸甘油酸盐致活酶(Hitzman etAL.，1980)或其它的糖分解酶(Hess et AL.，1968；Holland et AL.，1978)，如烯醇酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸盐脱羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、磷酸葡萄糖异构酶和葡萄糖激酶。在构建合适的表达载体质粒时，和这些基因相连的终止序列也绑定在序列的表达载体载体3’内，该序列适合用来提供mRNA和终止的腺嘌呤。
具有由生长条件控制的转录的额外优点的其它的启动子是这些启动子种类酒精、脱氢酶2、异细胞色素C、磷酸酶、和氮素代谢相关的降解酶、前述的甘油醛-3-磷酸脱氢酶、以及负责半乳糖和麦芽糖应用的酶。含有酵母相容启动子的任何质粒载体、复制的来源和终止序列是合适的。
除了微生物，衍生于多细胞机体的细胞培养也可以用作宿主细胞。理论上，无论是来自脊椎动物或无脊椎动物培养，任何这种细胞培养也是有效的。然而，对于脊椎动物来说是最好的，并且，培养中的脊椎动物的繁殖(组织培养)在近几年已经变成常用的工艺(Tissue Culture，1973)。这些有用宿主细胞系的例子包括VERO和海拉细胞，中国鼠的卵巢(CHO)的细胞系，W138、BHK、COS-7293、草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)(SF)细胞(作为全表达体系可以从i.a.Protein Sciences，1000 ResearchParkway，Meriden，CT 06450，U.S.A.and from Invitrogen得到)，以及MDCK细胞系。在本发明中，特别优选的细胞系是从Invitrogen，PO Box2312，9704 CH Groningen，The Netherlands得到的S2。
这种普通的细胞系的表达载体载体(如果需要)包括复制的来源，位于要表达的基因的前面的启动子，沿着必要的核糖体结合位置、RNA结合位置、多聚腺苷酸化位置和转录终止者序列。
在哺乳细胞中的应用，在表达载体载体上控制的功能经常由病毒物质提供。例如，通常用的启动子衍生于多瘤病毒、腺病毒2和大部分的猿病毒40(SV40)。初期和后期的SV40启动子特别有用，这是因为它们可容易的从作为片段的病毒上取得，该病毒也包括SV40病毒复制来源(Fiers etal.，1978)。如果包括从位于病毒复制来源对着BgII位置的HindIII位置延伸的约250bp序列，较小的或较大的SV40片段也可以使用。而且，如果这些控制序列和宿主细胞体系是相容的，利用启动子或控制和所需基因序列相关的序列是可能和期望的。
复制来源可可以通过载体的构建包括外生源，如可以是衍生于SV40或其它病毒(如多瘤病毒、Adeno、VSV、BPV)，也可以是由宿主细胞染色体复制机理提供的。如果载体和宿主细胞染色体结合，后者经常是充分的。
用于饥饿激素类似物的识别很明显，对于技术人员来说，不是天然的饥饿激素所有的变异或修饰可以在动物体内产生和天然形态交叉反应的抗体。
然而，为修饰饥饿激素分子建立有效的标准的监测是不困难的，该饥饿激素完成此处讨论的免疫活性的最少需求。
因此，本发明的另一部分是关于修饰饥饿激素多肽的识别方法，该饥饿激素多肽可以诱导对抗动物种群中未修饰饥饿激素的抗体，其中未修饰饥饿激素多肽是自体蛋白，该方法包括通过多肽合成或分子生物方法进行制备；一组相互之间不同的修饰饥饿激素多肽，其中氨基酸增加、插入、缺失或取代动物种群中的饥饿激素多肽中的氨基酸序列，因而成套的产生含有T-细胞表位、并和动物种群无关的氨基酸序列；或者制备解码成套相互区别的修饰饥饿激素多肽的、成套的核酸片段；测试由成套成员的能力，通过动物种群诱导对抗未修饰饥饿激素的抗体的生成；识别和可选择的分离成套中的成员，并诱导对抗动物种群中未修饰饥饿激素的抗体的生成，或者；识别和可选择的分离由成套核酸片段中的成员解码的多肽表达载体产品，该成套的核酸片段诱导了对抗动物种群中未修饰饥饿激素多肽的抗体的生成。
在本文中，“成套的相互区别的修饰饥饿激素多肽”是不一致的修饰饥饿激素多肽的集合体，例如，该多肽在上述讨论的基础上进行选择(如和圆形二色性结合、NMR光谱，和/或饥饿激素射线衍射模式)。该成套可以包括仅有的几个成员，但是可以预期的是，该成套可以含有几百中成员。同时，成套的核酸片段是非一致核酸片段的集合体，每个解码以同样方式选择的修饰的饥饿激素多肽。
成套成员的测试可以最终体内的演示，而许多体外测试可以应用，其中窄向下降的修饰饥饿激素数目可以实现本发明的目的。
由于引入外源T-细胞表位的目的是支持T-细胞帮助的B-细胞应答，首要的是T-细胞增殖由修饰的饥饿激素诱导。T-细胞增殖可以由标准的增殖化验体内的测试。简而言之，强化T-细胞的样品从保存在培养基的标本中得到。培养的T-细胞和标本的APCs相接触，该标本已经吸收了修饰分子，并使其以T-细胞表位出现。监测T-细胞的增殖，并和合适的控制(如T-细胞在培养基中和完整的APCs、天然饥饿激素接触)相对比。可选择的，增殖通过测试由T-细胞释放的相关细胞因子浓度进行检测，其中T-细胞是应答外源T-细胞的识别。
已经说明，至少有一种成套的修饰饥饿激素能够诱导对抗饥饿激素的抗体的生成，可以制备至少含有一种修饰饥饿激素多肽的免疫原组分，该饥饿激素多肽能够诱导对抗动物体内未修饰饥饿激素的抗体的生成，起总未修饰饥饿激素多肽是自体蛋白，该方法包括成套成员的混合，并诱导动物种群的抗体的生成，该抗体和具有药学上和生理上可接受的载体和/或赋形剂和/或稀释剂和/或赋形剂的饥饿激素反应，选择性的至少和一种药学上和生理上可接受的佐剂进行结合。
同时，也可以制备免疫原组分，该组分作为免疫原，并含有解码免疫原的饥饿激素类似物的核酸片段，和上述讨论的核酸接种疫苗进行比较。
本发明的上述各个方面通常通过初始制备本发明许多相互区别的核酸序列和载体插入这些合适的表达载体，和载体一起转化合适的宿主细胞，以及表达本发明的核酸序列来实现。这些步骤可以后续表达载体产品的分离。优选的是，核酸序列和/和载体通过包括分子放大技术的方法的制备，如PCR和通过核酸合成的方法。
将饥饿激素耦合到聚羟基聚合物上含有T辅助表位和肽的分子将作为可得到的仅含有免疫的相关部分的疫苗分子，该T辅助表位和肽代表或包括共价连接到作为赋形剂的非免疫原聚合物分子的B-细胞表位，如多重激活的聚羟基聚合物。例如，如果疫苗的靶子是自体抗原，混杂的或所谓的通用的T-辅助表位可以使用。而且，增强免疫反应的元素也可以耦合到赋形剂中，因而可以作为佐剂。这种元素可以是甘露糖、促噬菌肽(Tuftsin)、胞壁酰二肽、CpG基序等等，如免疫刺激或靶向肽。在这种情况下，随后的疫苗产品佐剂的形成可以是不必要的，产品可以用纯水或生理盐水服用。
通过耦合细胞毒素T细胞(CTL)表位和T-辅助表位，可以产生特别适用于衍生于CTL表位的抗原的CTL。
促进吸收APC(如巨噬细胞)细胞因子(如甘露糖)的元素可以和CTL和T辅助表位一起耦合到赋形剂中，并提高CTL的应答。
最终产品中B-细胞表位和T-辅助表位(P2和P30)的比率可以根据合成步骤中这些肽的浓度的不同而不同。如上所述，免疫原分子可以和如甘露糖、促噬菌肽、CpG基序或其它的免疫刺激物质(此处描述的)一起标签，如果有必要，通过将如这些物质的胺化衍生物应用到合成步骤中的碳酸盐缓冲液中。
如果不溶的活性聚羟基聚合物用于结合含有B-细胞表位和T-辅助表位的肽，如上所述，该聚羟基聚合物可以是固相合成，并且，最终的产品可以通过清洗和过虑提纯获得。
耦合到三重激活聚羟基聚合物(肽，标签等)的元素可以在低PH如4-5的情况下加到聚羟基聚合物中，并允许通过惰性分散在“胶体”中平衡分布。随后，PH值可以升到9-10，使肽上的初级氨基和聚羟基聚合物上的tresyl基上的标签开始反应。肽如免疫刺激元素耦合后，该胶体粉碎形成适合免疫的尺寸。
因此，本发明的特异部分通常涉及含有至少一种衍生于有益蛋白的第一氨基酸序列的免疫原，其中至少以第一氨基酸序列含有至少已B-细胞和/或至少一种CTL表位，并且含有一外源T-辅助细胞表位的至少一种第二氨基酸序列，其中每个至少第一和至少第二氨基酸序列后和到药学上可接受的活性聚羟基聚合物的载体上。
对于氨基酸序列，为了耦合到聚羟基聚合物上，通常需要用一合适的反应基团“激活”聚羟基聚合物，从而形成至氨基酸序列的必要连接。
术语“聚羟基聚合物”和WO 00/05316公开的意思一致，即聚羟基聚合物和该申请中的特征一致。因此，该聚羟基聚合物使水溶的或不溶的(因而在制备免疫原时需要不同的合成步骤)。聚羟基聚合物可以从天然生成聚羟基化合物和合成聚羟基化合物中选择。
特效药和优选的聚羟基聚合物是选自乙酰(acetan)、amypectin、琼脂、琼脂糖、藻酸盐、阿拉伯树胶、carregeenan、纤维素、环式糊精、右旋糖苷、帚叉藻聚糖(Furcellaran)、半乳甘露聚糖、白明胶、ghatti、葡聚糖、糖原、瓜尔豆、刺梧桐树胶、魔芋/A(konjac/A)、刺槐豆胶(LOCUST BEAN GUM)、甘露聚糖、胶质、亚麻、淀粉、tamarine、黄芪胶、黄原胶、木聚糖和利多卡因。右旋糖苷是特别优选的。
然而，聚羟基聚合物也可以选择高度分支聚合(乙烯亚胺)(PEI)、tetrathienylene vinylene、芳纶(poly-paraphenyl terephtalamide的长链)、聚(聚氨酯橡胶)、聚(硅氧烷)、聚二甲基硅氧烷、硅树脂、聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)、聚(乙烯醇)、聚(乙烯吡咯酮)、聚(2-羟基异丁烯酸)、聚(N-乙烯吡咯酮)、聚(乙烯醇)、聚(丙烯酸)、聚四氟乙烯(PTFE)、聚丙烯酰胺、聚(乙烯-co-乙烯醋酸盐)、聚(乙烯乙二醇)和衍生物，聚(甲基丙烯酸)、聚交酯(PLA)、聚乙醇酸交酯(PGA)、聚(丙交酯-共-乙醇酸交酯)(PLGA)、聚酐和聚原磷酯(Polyorthoesters)。
讨论中的聚羟基聚合物平均(重量)分子量(即激活前)通常至少为500，乳至少为1000，优选的范围为2500-2000000，特别优选的是3000-1000000，更加优选的范围为5000-500000。在实例中已经表明聚羟基聚合物的平均分子量范围为10000-200000是特别优选的。
聚羟基聚合物优选为水溶性的，至少为10mg/ml，优选至少为25mg/ml，如至少为50mg/ml，特别至少为100mg/ml，如在室温时至少为150mg/ml。公知的是，即使如上述激活，右旋糖苷能够满足相关的水溶性的要求。
对于一些重要有用的聚羟基聚合物，未激活的聚羟基聚合物(即激活前的天然聚合物高分子)的C(碳原子)和OH基(羟基)间的比例范围为1.3-2.5，优选为1.6-2.1，特别优选为1.85-2.05。不受限于任何特定的理论，可以相信的是，如未激活的聚羟基聚合物的C/OH比例表示了亲水性的高低。聚乙烯乙醇和聚糖是符合这种要求的聚羟基聚合物的例子。可以相信的是，上述比例对于激活聚羟基聚合物，基本上和激活需要的相当低的比例一致。
术语“聚羟基聚合物载体”表示的是负载氨基酸序列的免疫原的一部分。一般来说，聚羟基聚合物载体具有自己的外限，即氨基酸序列可以通过肽酶分解，如在处理免疫原的抗原表达细胞中。因此，聚羟基聚合物载体可以是具有活性基团的聚羟基聚合物，其中活性基团和氨基酸序列之间的键通过APC中的肽酶分解，或者，聚羟基聚合物载体可以是具有活性基团的聚羟基聚合物，如单L-氨基酸或许多D-氨基酸的连接子，其中衔接物的最后部分能够连接到氨基酸序列，丙通过APC中的肽酶分解。
如上述，聚羟基聚合物负载有官能团(活性基团)，并使肽锚定到载体上。可应用的官能团的范围在现有技术中是公知的，如tresyl(三氟乙烯磺酸)、马来酰亚胺(maleimido)、对-硝基苯氯甲酸盐、氰溴化物、甲苯磺酰基、triflyl(三氟甲基磺酸)、pentafluorobenzenesulfonyl、以及乙烯砜基。在本发明的范围内，官能团优选的例子是tresyl、马来酰亚胺、甲苯磺酰基、triflyl、pentafluorobenzenesulfonyl、对-硝基苯氯甲酸盐和乙烯砜基，其中tresyl、马来酰亚胺、甲苯磺酰基基团是特别相关的。
激活聚羟基聚合物的tresyl能够用所述的tresyl氯化物进行激活右旋糖苷进行制备，即WO 00/05316中的例子，或者用Gregorius et al.，J.Immunol.Meth.181(1995)65-73所述的方法。
激活聚羟基聚合物的马来酰亚胺能够用所述的对-马来酰亚胺苯(maleimidophenyl)异氰酸盐激活WO 00/05316中的例子3中的右旋糖苷。可选择的，马来酰亚胺基团可以过量的引入到聚羟基聚合物中，随后在TAD中引入的氨基和试剂(如琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺甲烷)环己烷-1-羧酸盐(SMCC)、硫-琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺甲烷)环己烷-1-羧酸盐(SULFO-SMCC)、琥珀酰亚胺基4-(P-马来酰亚胺甲烷)丁酸盐(SMPB)、硫-琥珀酰亚胺基4-(P-马来酰亚胺甲烷)丁酸盐(sulfo-SMPB)、N-γ-马来酰亚胺丁酰氧-琥珀酰亚胺酯(GMBS)或N-γ-马来酰亚胺丁酰氧-硫琥珀酰亚胺酯)反应，如右旋糖苷，通过tresyl的衍生和二胺化合物(通常是H2n-CnH2n-NH2，其中n是1-20，优选为1-8)一起激活聚羟基聚合物(如tresyl激活右旋糖苷(TAD))，如1，3-二胺丙烷。尽管激活的不同试剂和路线通常导致微有不同的马来酰亚胺激活产品关于在马来酰亚胺功能和激活发生的母羟基残基之间的连接，每个和所有的都被认为是“马来酰亚胺激活聚羟基聚合物”。
激活聚羟基聚合物的甲苯磺酰基可以通过使用所述的甲苯磺酰基氯化物激活激活WO 00/05316中的例子2的右旋糖苷制备。Triflyl和激活聚羟基聚合物的pentafluorobenzenesulfonyl可以通过相应的酸的氯化物制成甲苯磺酰基或tresyl激活类似物。
激活聚羟基聚合物的氰溴化物可以通过用常规的方法将聚羟基聚合物和氰溴化物反应进行制备。得到的官能团通常是具有聚羟基聚合物的两个羟基的氰酸酯。
激活的程度可以通过自由羟基和激活基团(功能羟基基团)之间的比例表示。可以相信，为了获得聚羟基聚合物亲水性和反应性之间的优选的平衡，聚羟基聚合物的自由羟基和激活基团之间的比例应在250∶1至4∶1之间。优选的比例在100∶1到6∶1之间，特别优选在60∶1到8∶1之间，更加优选的是40∶1到10∶1之间。
特别的，根据本发明，用于本方法中生成通用免疫原的有益的激活聚羟基聚合物是tresyl、甲苯磺酰基、激活多糖的马来酰亚胺，特别是激活右旋糖苷(TAD)的tresyl、激活右旋糖苷(TosAD)的甲苯磺酰基、以及激活右旋糖苷(MAD)的马来酰亚胺。
优选的是，聚羟基聚合物载体和连接的氨基酸序列之间的键通过肽酶分解，如在APC中的处理抗原的肽酶活性剂。因此，至少第一和至少第二氨基酸序列通过氨基键或肽键耦合到激活的聚羟基聚合物载体上是优选的。特别优选的是，每个至少第一和至少第二氨基酸序列提供它们独自氨基键的氮气部分。
聚羟基聚合物载体可以是充分自由的氨基酸残基，迫使活性基团为部分肽酶分解键提供，但是如上所述，载体可以是仅仅包括含有至少一种L-氨基酸的隔离物。
不过，至少第一和至少第二氨基酸序列通常通过在氨基酸序列的N-末端的氮气结合到聚羟基聚合物的激活类型。


图1鼠体内是抗-饥饿激素浓度对抗自体饥饿激素的免疫。
鼠组(n＝10)用不同的饥饿激素自动免疫肽(肽3、4、5，分别对应的SEQ ID NO15、16和17)进行免疫，以及用野生(wildtype)鼠饥饿激素(肽2)或来源于IgE(肽1)的阴性对照(negative control)肽。5个基团中的每一个成堆的sera(Pools of sera)(第三免疫后)用应答酶免疫分析法(ELISA)的抗-饥饿激素抗体检测，其中基板(plate)涂有一层饥饿激素(Bachem，2ug/ml)。Sera以起始稀释1∶10的三倍进行浓度测试。作为sera与ELISA基板的非确定结合的阴极对照，用肽5进行免疫的、来自鼠的sera加入到非涂层的井(非涂层的)。抗-饥饿激素抗体的结合用设有HRP的抗-鼠Ig第二抗体检测(1∶1000稀释，Dako)。
图2免疫鼠的体重时间＝0时，初始研究的所有组的体重每周检测一次。所有研究组在10周内体重都增加了，但是与wt和控制相比(肽2和1，分别的)，动物体内的饥饿激素(肽3-5)的水平越高，体重增加的越高。
图3免疫鼠的进食从Time＝0.0时，对初始研究的所有组的免疫鼠的进食每周测一次。曲线显示的是研究持续10周累积进食。显然，体重显示的差异没有在累积进食中直接显示。
图4免疫动物中的血浆饥饿激素的水平为了规范饥饿激素，18小时的进食后抽取血的样品。根据生产者的指令，用Phoenix的商用RIA成套工具(饥饿激素(鼠)-RIA成套工具)对鼠-饥饿激素中成堆的sera进行分析。来自11/4的第一数据是来自预抽取，而剩下的垫是注射后1周的抽取。
具体实施例方式
实例1通过免疫原的鼠饥饿激素对鼠进行免疫5肽通过标准的方法在肽合成设备上进行生产。肽是肽1，衍生于IgE的不相干控制的肽，也包括P2和P30表位(SEQ ID NO7和8，分别的)，肽2，成熟鼠的饥饿激素，SEQ ID NO9，残基24-53，以及肽3-5，即SEQ ID NO15-17，分别的。
5肽注射到雄性Sprague-Dawley鼠的5个基团(n＝10)。四个是皮下注射，间隔3周，在400微升(包括佐剂；完整的弗氏佐剂，CFA，在第一次免疫中，不完全的弗氏佐剂，IFA，在强化免疫作用)中含有100微克的肽。
血样在研究开始时禁食18个小时后抽取，接着每次注射后禁食一周。
根据生产者的指令，对于血浆鼠-饥饿激素，血样通过使用商业的来自于凤凰的RIA(饥饿激素(鼠)-RIA kit)进行分析，如图4所示。抗-饥饿激素的滴定用ELISA，其中从wt鼠饥饿激素(贝克曼)到抗-饥饿激素抗体的结合用HRP-共轭抗-鼠免疫球蛋白第二抗体(Dako)探测，如图1所示。
体重、吸收的食物和水每周测一次，分别如图2和图3所示。
结果显示，肽3-5可以诱导抗体和鼠饥饿激素反应，其中相关的控制(肽)和野生的饥饿激素(肽2)不是。然而，令人惊奇的是，抗体的引入和免疫鼠的sera中饥饿激素水平的增加和体重的增加相联系，其中在5组鼠的进食相差很大。
因此，体重的增加不能归功于进食的增加，而是对抗饥饿激素的抗体在动物代谢中的变化。
实例2用进一步的变体进行疫苗导向研究理论上，实例1的研究可以用几种其它候选的疫苗分子制成。根据上述的概念(WO 95/05849详细叙述)，饥饿激素自体免疫的例子例如可以通过取代、或插入公知混杂T细胞表位至饥饿激素野生类型的蛋白质(或插入自己的多肽变型中)进行构建。取代是肽取代，和野生类型的序列的缺失的肽比较，其中插入的肽可以是相同或不同长度的。
对于通过体内测试和监测观念的初始证据，发生在SEQ ID NO1-5的构建可以用在鼠中。相应的变型可以由P2和P30表位取代PADRE序列制成。
这些构建将通过固相肽的合成进行合成制备。这将确保上述构建缺少成熟的饥饿激素的生物活性，由于丝氨酸-3(成熟的饥饿激素中)的n-辛酰化对于饥饿激素的生物活性好像是必不可少的。当然，这种效果也可以通过利用重组细胞表达载体体系获得，该体系不允许这种特异的后-转译后的修饰。
根据标准的协议(预先和在完全的弗氏佐剂中形成的结构中制备，由在不完全的弗氏佐剂中形成的结构中提升)，试验动物的种群可以进行免疫，根据标准工艺，如在实例1中和形成的这些5种结构的优化的量一起使用，动物和一段时间后体重的增加/减少的控制的基团进行比较。导致体重减少(饥饿激素水平也减少)的变型将适合作为有益体重减少的的候选物，其中，例子1种模仿结果的变量将具有所述申请描述的其它结果。
序列表序列表<110>法麦克萨有限公司<120>针对自体饥饿激素的免疫<130>15451PCT00<160>17<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>41<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>融合到PADRE序列的成熟饥饿激素<400>1Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Ala Gln Gln Arg Lys15 10 15Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gln Pro Arg Ala Lys Phe Val20 25 30Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala3540<210>2<211>41<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>用插入的PADRE序列的成熟饥饿激素<400>2Gly Ser Ser Ala Lys Phe Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala1 5 10 15Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Ala Gln Gln Arg Lys Glu Ser Lys20 25 30Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gln Pro Arg35 40<210>3<211>41<212>PRT
<213>人工序列<220>
<223>具有插入的PADRE序列的成熟饥饿激素<400>3Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Ala Lys Phe Val Ala1 5 1015Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala Ala Gln Gln Arg Lys Glu Ser Lys20 2530Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gln Pro Arg35 40<210>4<211>41<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>具有插入的PADRE序列的成熟饥饿激素<400>4Gly Ser Ser Phe Leu Ser Ala Lys Phe Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys1 5 10 15Ala Ala Ala Pro Glu His Gln Lys Ala Gln Gln Arg Lys Glu Ser Lys20 25 30Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gln Pro Arg35 40<210>5<211>40<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>具有替换的PADRE序列的成熟饥饿激素<400>5Gly Ser Ser Phe Leu Ser Ala Lys Phe Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys1 5 1015Ala Ala Ala Glu His Gln Lys Ala Gln Gln Arg Lys Glu Ser Lys Lys20 25 30
Pro Pro Ala Lys Leu Gln Pro Arg3540<2l0>6<211>13<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>Pan DR结合肽，PADRE<400>6Ala Lys Phe Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala1 5 10<210>7<211>15<212>PRT<213>Clostridium tetani<400>7Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu1 5 10 15<210>8<211>21<212>PRT<213>Clostridium tetani<400>8Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser1 5 1015Ala Ser His Leu Glu20<210>9<211>501<212>DNA<2l3>Rattus rattus<220>
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<220>
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<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(366)<223>饥饿激素pre-propeptide<220>
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<221>misc_feature<222>(85)..(168)<223>成熟的饥饿激素<220>
<221>sig_peptide<222>(16)..(84)<223>
<400>10ctcaccacca agacc atg ctg tct tca ggc acc atc tgc agt ttg ctg cta 51Met Leu Ser Ser Gly Thr Ile Cys Ser Leu Leu Leu1 5 10ctc agc atg ctc tgg atg gac atg gcc atg gca ggc tcc agc ttc ctg99Leu Ser Met Leu Trp Met Asp Met Ala Met Ala Gly Ser Ser Phe Leu1520 25agc cca gag cac cag aaa gcc cag cag aga aag gaa tcc aag aag cca147Ser Pro Glu His Gln Lys Ala Gln Gln Arg Lys Glu Ser Lys Lys Pro30 3540cca gct aaa ctg cag cca cga gct ctg gaa ggc tgg ctc cac cca gag195Pro Ala Lys Leu Gln pro Arg Ala Leu Glu Gly Trp Leu His Pro Glu45 50 55 60gac aga gga caa gca gaa gag aca gag gag gag ctg gag atc agg ttc243Asp Arg Gly Gln Ala Glu Glu Thr Glu Glu Glu Leu Glu Ile Arg Phe65 70 75aat gct ccc ttc gat gtt ggc atc aag ctg tca gga gct cag tat cag291Asn Ala Pro Phe Asp Val Gly Ile Lys Leu Ser Gly Ala Gln Tyr Gln80 85 90cag cat ggc cgg gcc ctg ggg aag ttt ctt cag gat atc ctc tgg gaa339Gln His Gly Arg Ala Leu Gly Lys Phe Leu Gln Asp Ile Leu Trp Glu95 100 105gag gtc aaa gag gcg cca gct gac aag taa ccacggacag gcctgacccc 389
Glu Val Lys Glu Ala Pro Ala Asp Lys110 115cgtgctttcc ttctcctgag caagaactca catccgcctc agcctcctcg gcaactccca 449gcactctcct accactttaa gaataaatgt tcacctgt487<210>11<211>511<212>DNA<213>类人<220>
<221>外显子<222>(34)..(387)<223>
<220>
<221>misc_feature<222>(34)..(384)<223>饥饿激素pre-propeptide<220>
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Trp Leu Arg Pro Glu Asp Gly Gly Gln Ala Glu Gly Ala Glu Asp Glu6065 70ctg gaa gtc cgg ttc aac gcc ccc ttt gat gtt gga atc aag ctg tca294Leu Glu Val Arg Phe Asn Ala Pro Phe Asp Val Gly Ile Lys Leu Ser75 80 85ggg gtt cag tac cag cag cac agc cag gcc ctg ggg aag ttt ctt cag342Gly Val Gln Tyr Gln Gln His Ser Gln Ala Leu Gly Lys Phe Leu Gln90 95 100gac atc ctc tgg gaa gag gcc aaa gag gcc cca gcc gac aag tga387Asp Ile Leu Trp Glu Glu Ala Lys Glu Ala Pro Ala Asp Lys105 110 115tcgcccacaa gccttactca cctctctcta agtttagaag cgctcatctg gcttttcgct 447tgcttctgca gcaactccca cgactgttgt acaagctcag gaggcgaata aatgttcaaa 507ctgt 511<210>12<211>547<212>DNA<213>Canis familiaris<220>
<221>外显子<222>(40)..(393)<223>
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<221>misc_feature<222>(109)..(192)<223>成熟的饥饿激素<400>12gaattcggca cgaggggaat cccaggcgca tctgacacc atg ccc tcc ctg ggg 54Met Pro Ser Leu Gly1 5
acc atg tgc agc ctg ctg ctc ttc agt gtg ctc tgg gtg gac ctg gcc 102Thr Met Cys Ser Leu Leu Leu Phe Ser Val Leu Trp Val Asp Leu Ala10 1520atg gcg ggc tcc agc ttc cta agt ccc gaa cac cag aaa cta cag cag 150Met Ala Gly Ser Ser Phe Leu Set Pro Glu His Gln Lys Leu Gln Gln25 30 35aga aag gag tcc aag aag ccg ccg gcc aaa ctg cag ccc cga gcc cta 198Arg Lys Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gln Pro Arg Ala Leu4045 50gaa ggc tcc ctt ggc cca gaa gac aca agt caa gtg gaa gag gca gag 246Glu Gly Ser Leu Gly Pro Glu Asp Thr Ser Gln Val Glu Glu Ala Glu55 6065gat gag ctg gaa atc cgg ttc aat gcc ccc ttt gat gtt gga atc aag 294Asp Glu Leu Glu Ile Arg Phe Asn Ala Pro Phe Asp Val Gly Ile Lys70 75 80 85ctg tca ggg cct cag tac cac cag cat ggc cag gca ctc ggg aag ttt 342Leu Ser Gly Pro Gln Tyr His Gln His Gly Gln Ala Leu Gly Lys Phe90 95100ctt caa gag gtt ctt tgg gaa gac acc aac gag gcc ctg gca gac gag 390Leu Gln Glu Val Leu Trp Glu Asp Thr Ash Glu Ala Leu Ala Asp Glu105 110 115tga tcatccacaa gatgggcctg cctgttctcc ccccacccta gaagcactca443cctgactttt acactgtttc tgcagctact cccagttctg agtggtacta gttgaagagg 503tgaataaaca ttcaaaccat aaaaaaaaaa aaaaaaaact cgag547<210>13<211>494<212>DNA<213>Sus scrofa<220>
<221>外显子<222>(9)..(365)<223>
<220>
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<220>
<221>misc_feature<222>(9)..(362)<223>饥饿激素pre-propeptide<220>
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<221>misc_feature<222>(80)..(164)<223>成熟的饥饿激素<400>13ctgaggcc atg ccc tcc acg ggg acc att tgc agc ctg ctg ctc ctc agc 50Met Pro Ser Thr Gly Thr Ile Cys Ser Leu Leu Leu Leu Ser1 510gtg ctc ctc atg gca gac ttg gcc atg gcg ggc tcc agc ttc ttg agc98Val Leu Leu Met Ala Asp Leu Ala Met Ala Gly Ser Ser Phe Leu Ser15 20 25 30ccc gaa cac cag aaa gtg cag cag aga aag gag tcc aag aag cca gca 146Pro Glu His Gln Lys Val Gln Gln Arg Lys Glu Ser Lys Lys Pro Ala35 4045gcc aaa ctg aag ccc cgg gcc ctg gaa ggc tgg ctc ggc cca gaa gac 194Ala Lys Leu Lys Pro Arg Ala Leu Glu Gly Trp Leu Gly Pro Glu Asp50 55 60agt ggt gag gtg gaa ggc acg gag gac aag ctg gaa atc cgg ttc aac 242Ser Gly Glu Val Glu Gly Thr Glu Asp Lys Leu Glu Ile Arg Phe Asn6570 75gcc ccc tgt gat gtt ggg atc aag ttg tca ggg gct cag tcc gac cag 290Ala Pro Cys Asp Val Gly Ile Lys Leu Ser Gly Ala Gln Ser Asp Gln8085 90cac ggc cag ccc ctg ggg aaa ttt ctc cag gac atc ctc tgg gaa gag 338His Gly Gln Pro Leu Gly Lys Phe Leu Gln Asp Ile Leu Trp Glu Glu95 100 105 110gtc act gag gcc ccg gcc gac aag tga ttgtccctga gaccagccac 385Val Thr Glu Ala Pro Ala Asp Lys115ctctgttctc ccagcctcct aagggctcac ctggcttcca ggacgcttcc actatcacac 445ccagctctga gggatgctag cctgggaggt gaataaacat tcagactgg 494<210>14<211>488<212>DNA<213>Bos taurus<220>
<221>外显子<222>(4)..(354)<223>
<220>
<221>sig_peptide<222>(4)..(72)
<223>
<220>
<221>misc_feature<222>(4)..(351)<223>饥饿激素pre-propeptide<220>
<221>misc_feature<222>(73)..(351)<223>饥饿激素propeptide<220>
<221>misc_feature<222>(73)..(153)<223>成熟的饥饿激素<400>14gcc atg ccc gcc ccg tgg acc atc tgc agc ctg ctg ctg ctc agc gtg48Met Pro Ala Pro Trp Thr Ile Cys Ser Leu Leu Leu Leu Ser Val1 510 15ctc tgc atg gac ttg gcc atg gcg ggc tcc agc ttt ctg agc ccc gaa96Leu Cys Met Asp Leu Ala Met Ala Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu20 2530cat cag aaa ctg cag aga aag gaa gct aag aag cca tca ggc aga ctg 144His Gln Lys Leu Gln Arg Lys Glu Ala Lys Lys Pro Ser Gly Arg Leu35 4045aag ccc cgg acc ctg gaa ggc cag ttt gac ccg gag gtg gga agt cag 192Lys Pro Arg Thr Leu Glu Gly Gln Phe Asp Pro Glu Val Gly Ser Gln50 55 60gcg gaa ggt gca gag gac gag ctg gaa atc cgg ttc aac gcc ccc ttt 240Ala Glu Gly Ala Glu Asp Glu Leu Glu Ile Arg Phe Asn Ala Pro Phe65 7075aac att ggg atc aag cta gca ggg gct cag tcc ctc cag cat ggc cag 288Ash Ile Gly Ile Lys Leu Ala Gly Ala Gln Ser Leu Gln His Gly Gln80 85 9095acg ttg ggg aag ttt ctt cag gac atc ctt tgg gaa gaa gct gaa gaa 336Thr Leu Gly Lys Phe Leu Gln Asp Ile Leu Trp Glu Glu Ala Glu Glu100 105 110acc ctg gct aac gag tga gtggccctgg gaccaaccac ctgtccgttc 384Thr Leu Ala Asn Glu115tcccaccctc agaagctctc acctggcttc cgggacactt ccgagaccac gtggggctct 444gaggggtact agagtaggca gtgaataaat gctcagatgg atgc 488<210>15<211>64<212>PRT
<213>人工序列<220>
<223>成熟的rat饥饿激素with added epitopes<400>15Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Gly1510 15Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Ala Gln Gln Arg Lys Glu2025 30Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gln Pro Arg Phe Asn Asn Phe Thr35 40 45Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu50 55 60<210>16<211>68<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>具有添加的表位的成熟的饥饿激素<400>17Glu Glu Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys1 510 15Val Ser Ala Ser His Leu Glu Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His2025 30Gln Lys Ala Gln Gln Arg Lys Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu3540 45Gln Pro Arg Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr50 5560Glu Leu Glu Glu65<210>17<211>68<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>具有添加的表位的成熟的饥饿激素<400>17Glu Glu Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu1 510 15Leu Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Ala Gln Gln Arg20 25 30Lys Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gln Pro Arg Phe Asn Asn3540 45Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His50 55 60Leu Glu Glu Glu65
权利要求书(按照条约第19条的修改)1、一种治疗和/或预防和/或改善肥胖或其它疾病和体内脂肪沉积过量的症状的方法，该方法包括通过对抗动物中、包括人类中的饥饿激素的免疫向下调节饥饿激素，该方法包括将免疫有效量的免疫原有效提呈给动物免疫系统，该免疫原选自至少一种饥饿激素多肽或其亚序列，其配方使含有饥饿激素多肽或其亚序列的动物的免疫诱导对抗动物自体饥饿激素的抗体的产生，以及至少一种掺入在同一分子中的饥饿激素类似物，至少一种饥饿激素的B-细胞的表位，以及至少一种不是来自饥饿激素的化学部分，以使用类似物免疫动物诱导对抗饥饿激素的抗体的生成。
2、一种增加动物体重的方法，该方法包括通过对抗动物中的饥饿激素的免疫向上调节饥饿激素，该方法包括将免疫有效量的免疫原有效提呈给动物免疫系统，该免疫原选自至少一种饥饿激素多肽或其亚序列，其配方使含有饥饿激素多肽或其亚序列的动物的免疫诱导对抗动物自体饥饿激素的抗体的产生，以及至少一种掺入在同一分子中的饥饿激素类似物，至少一种饥饿激素的B-细胞的表位，以及至少一种不是来自饥饿激素的化学部分，以使用类似物免疫动物诱导对抗饥饿激素的抗体的生成。
3、根据权利要求1或2所述的方法，其中免疫原是饥饿激素类似物。
4、根据权利要求3所述的方法，其中类似物已经保存了饥饿激素B-细胞表位的重要部分，其中类似物也包括至少一种外源T-细胞辅助淋巴细胞表位(TH表位)，和/或至少一种影响类似物靶向一抗原提呈细胞(APC)的或B-淋巴细胞的第一部分，和/或至少一种刺激免疫系统的第二部分，和/或至少一种优化类似物出现在免疫系统中的第三部分。
5、根据权利要求4所述的方法，其中外源TH表位和/或第一和/或第二和/或第三部分通过连接到合适的侧链饥饿激素或其亚序列出现在类似物中。
6、根据权利要求4或5所述的方法，其中类似物是饥饿激素多肽，该饥饿激素多肽通过至少一种氨基酸取代和/或缺失和/或插入和/或添加进行修饰。
7、根据权利要求6所述的方法，其中类似物是融合多肽。
8、根据权利要求6或7所述的方法，其中氨基酸取代和/或缺失和/或插入和/或添加允许在类似物中基本保留饥饿激素的所有的三级结构。
9、根据权利要求4和5-8中任一权利要求所述的方法，从属于于权利要求4，其中类似物包括至少一种饥饿激素B-细胞表位的复制和/或半抗原的引入。
10、根据权利要求4和5-9中任一权利要求所述的方法，从属于于权利要求4，其中外源T-细胞表位在动物中是免疫显型的。
11、根据权利要求4和5-10中任一权利要求所述的方法，从属于于权利要求4，其中外源T-细胞表位是混杂的。
12、根据权利要求11所述的方法，其中至少一种外源T-细胞表位选自天然混杂的T-细胞表位和肽人工肽MHC-II结合序列。
13、根据权利要求12所述的方法，其中天然的T-细胞表位选自破伤风类毒素表位，如P2或P30，白喉类毒素表位，流感病毒hemagluttinin表位，和P.恶性疟原虫CS表位。
14、根据权利要求4和5-13中任一权利要求所述的方法，从属于权利要求4，其中第一部分是B-淋巴细胞特异表面抗原或APC特异表面抗原的实质的特异结合配体，如在B-淋巴细胞或APC上具有一受体的半抗原或醣类。
15、根据权利要求4和5-14中任一权利要求所述的方法，从属于权利要求4，其中第二部分选自细胞因子和热休克蛋白。
16、根据权利要求15所述的方法，其中细胞因子选自干扰素γ(IFN-γ)、Flt3L、白介素1(IL-1)、白介素2(IL-2)、白介素4(IL-4)、白介素6(IL-6)、白介素12(IL-12)、白介素13(IL-13)、白介素15(IL-15)和的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，或是其有效部分；其中的热休克蛋白选自HSP70、HSP90、HSC70、GRP94和钙网蛋白(CRT)，或是其有效部分。
17、根据权利要求4和5-16中任一权利要求所述的方法，从属于权利要求4，其中第三部分是脂类属性，如棕榈酰基、十四烷基、法呢基、香叶酯-香叶酯基、GPI-锚和N-乙酰甘油二酯。
18、根据前述的任一权利要求所述的方法，其中免疫原含有用相同或不同长度的氨基酸序列取代至少一种饥饿激素多肽内的氨基酸序列，所述的长度可以在类似物中产生外源TH表位。
19、根据前述的任一权利要求所述的方法，其中饥饿激素多肽包括对应于SEQ ID NO11中氨基酸24-51或其亚序列的氨基酸序列，其中在类似物中插入氨基酸序列产生外源TH表位，或者至少一种氨基酸序列被在类似物中产生外源TH表位的相同或不同长度的氨基酸序列取代，其中的引入在任何一种下述氨基酸后进行，SEQ ID NO11中的氨基酸1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116和117；其中可以缺失的氨基酸是SEQ ID NO11中的氨基酸1和/或2和/或3和/或4和/或5和/或6和/或7和/或8和/或9和/或10和/或11和/或12和/或13和/或14和/或15和/或16和/或17和/或18和/或19和/或20和/或21和/或22和/或23和/或24和/或25和/或26和/或27和/或28和/或29和/或30和/或31和/或32和/或33和/或34和/或35和/或36和/或37和/或38和/或39和/或40和/或41和/或42和/或43和/或44和/或45和/或46和/或47和/或48和/或49和/或50和/或51和/或52和/或53和/或54和/或55和/或56和/或57和/或58和/或59和/或60和/或61和/或62和/或63和/或64和/或65和/或66和/或67和/或68和/或69和/或70和/或71和/或72和/或73和/或74和/或75和/或76和/或77和/或78和/或79和/或80和/或81和/或82和/或83和/或84和/或85和/或86和/或87和/或88和/或89和/或90和/或91和/或92和/或93和/或94和/或95和/或96和/或97和/或98和/或99和/或100和/或101和/或102和/或103和/或104和/或105和/或106和/或107和/或108和/或109和/或110和/或111和/或112和/或113和/或114和/或115和/或116和/或117。
20、根据权利要求19所述的方法，其中类似物选自具有选自SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4和SEQ ID NO5的氨基酸序列的多肽。
21、根据权利要求20所述的方法，其中免疫原的聚氨基酸共价或非共价连接到能够影响抗原决定簇的多重复制的提呈的载体分子上，其中聚氨基酸选自饥饿激素多肽、饥饿激素亚序列和饥饿激素类似物。
22、根据权利要求21所述的方法，其中载体分子含有或由药学上可接受的激活的聚羟基聚合物组成。
23、根据从属权利要求3的权利要求22所述的方法，其中聚羟基聚合物作为载体主链分别连接到1)饥饿激素多肽或其亚序列和2)外源TH表位。
24、根据权利要求22或23所述的方法，其中聚氨基酸通过被肽酶裂解的键结合到聚羟基聚合物上，如酰胺键或肽键。
25、根据权利要求24所述的方法，其中所述的聚氨基酸提供相应酰胺键的氮部分。
26、根据权利要求22-25中任一权利要求所述的方法，其中聚羟基聚合物载体基本没有氨基酸残基。
27、根据权利要求22-26中任一权利要求所述的方法，其中聚氨基酸通过在氨基酸序列的N-末端的氮结合到激活的聚羟基聚合物上。
28、根据权利要求22-27中任一权利要求所述的方法，其中聚羟基聚合物是水溶性的。
29、根据权利要求22-26中任一权利要求所述的方法，其中聚羟基聚合物是水不溶性的。
30、根据权利要求22-29中任一权利要求所述的方法，其中聚羟基聚合物选自天然生成的聚羟基化合物和合成的聚羟基化合物。
31、根据权利要求22-30中任一权利要求所述的方法，其中聚羟基聚合物是多醣。
32根据权利要求31所述的方法，其中多醣选自乙酰、支链淀粉、琼脂树胶、琼脂糖、藻酸盐、阿拉伯树胶、carregeenan、纤维素、环式糊精、右旋糖苷、帚叉藻聚糖(Furcellaran)、半乳甘露聚糖、白明胶、茄替胶、葡聚糖、糖原、瓜耳胶、刺梧桐树胶、魔芋/A(konjac/A)、刺槐豆胶(LOCUSTBEAN GUM)、甘露聚糖、果胶、胶质、亚麻、淀粉、tamarine、黄芪胶、黄原胶、木聚糖和木葡聚糖。
33、根据权利要求32所述的方法，其中聚羟基聚合物是右旋糖苷。
34、根据权利要求22-30中任一权利要求所述的方法，其中聚羟基聚合物选自高分支聚(乙烯亚胺)(PEI)、tetrathienylene vinylene、芳纶(poly-paraphenyl terephtalamide的长链)、聚(聚氨酯橡胶)、聚(硅氧烷)、聚二甲基硅氧烷、硅树脂、聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)、聚(乙烯醇)、聚(乙烯吡咯酮)、聚(2-羟基异丁烯酸)、聚(N-乙烯吡咯酮)、聚(乙烯醇)、聚(丙烯酸)、聚四氟乙烯(PTFE)、聚丙烯酰胺、聚(乙烯-co-乙烯醋酸盐)、聚(乙烯乙二醇)和衍生物，聚(甲基丙烯酸)、聚交酯(PLA)、聚乙醇酸交酯(PGA)、聚(丙交酯-共-乙醇酸交酯)(PLGA)、聚酐和聚原磷酯。
35、根据权利要求22-34中任一权利要求所述的方法，其中激活前的聚羟基聚合物的平均分子量至少为500。
36、根据权利要求22-35中任一权利要求所述的方法，其中聚羟基聚合物由选自下述的官能团激活tresyl(三氟乙基磺酰基)、马来酰亚胺、p-氮苯基卡乐甲酸盐和甲苯磺酰基(p-甲苯磺酰)。
37、根据权利要求22-36中任一权利要求所述的方法，进一步包括至少一种与聚羟基聚合物偶联的进一步聚氨基酸，所述的至少一种进一步的聚氨基酸选自下述基团免疫刺激肽或靶向肽。
38、根据前述的任一权利要求所述的方法，其中有效量的免疫原通过选自非肠道的方式服用到动物体内如皮下的、真皮的、皮层内的、皮内的和肌肉的方式；腹膜的方式；口服的方式；口腔的方式；舌下的方式；硬脑膜外的方式；脊髓的方式；肛门的方式和颅内的方式。
39、根据权利要求38所述的方法，其中的有效量为0.5微克～2000微克之间的饥饿激素多肽、其亚序列及其类似物。
40、根据权利要求27或38所述的方法，其中饥饿激素多肽或类似物包含在虚拟淋巴结(VLN)装置内。
41、根据权利要求38-40中任一权利要求所述的方法，其中饥饿激素多肽及其亚序列，或者饥饿激素类似物和佐剂一起配制，该佐剂有利于打破对自身抗原的自身耐受。
42、根据权利要求1-20中任一权利要求所述的方法，其中通过将编码免疫原的核酸引入到动物细胞影响免疫原向免疫系统的提呈，因而通过引入的核酸的细胞获得体内表达。
43、根据权利要求42所述的方法，其中引入的核酸(s)选自裸露的DNA、与带电或不带电的脂质配制的DNA、配制进脂质粒的DNA、包含在病毒载体内的DNA、和转染-便利蛋白质或多肽配制的DNA、和靶向蛋白质或多肽配制的DNA、和钙沉淀剂配制的DNA、与惰性载体分子偶联的DNA、在几丁质或壳聚糖中包裹的DNA、以及与佐剂配制的DNA。
44、根据权利要求43所述的方法，其中核酸(s)包含在VLN装置内。
45、根据权利要求38-44中任一权利要求所述的方法，其中包括每年至少服用/引入一次，如服用/引入至少2次、至少3次、至少4次、至少6次和至少12次。
46、来源于动物饥饿激素多肽的饥饿激素多肽的类似物，其中该类似物引入了修饰，因而用类似物免疫动物诱导了对抗动物自体饥饿激素多肽的抗体的生成。
47、一种免疫原的成分，其含有权利要求46所述的免疫原有效量的类似物，该成分进一步含有药学上和免疫学上抗原接受的载体和/或赋形剂，以及可选择的佐剂。
48、一种如权利要求4-20中任一权利要求所述的编码类似物的核酸片段。
49、一种如权利要求48所述的负载有核酸片段的载体，如能够自体复制的载体。
50、根据权利要求49所述的载体，选自下述基团质粒、抗菌素、粘粒、微型-染色体和病毒。
51、根据权利要求49或50所述的载体，包括在5’→3’的方向和可操作的联结中，根据权利要求48所述的针对核酸片段驱动表达的启动子(promoter)，可选择的编码能够将多肽片段分泌或整合进膜的前导肽的核酸序列，根据权利要求51的核酸片段，和可选择的终止子。
52、根据权利要求49-51中任一权利要求所述的载体，当引入到宿主细胞时，能够或不能整合进宿主细胞。
53、根据权利要求51或52所述的载体，其中所述的启动子驱动真核细胞和/或原核细胞内的表达。
54、负载权利要求49-53中任一权利要求所述的载体的转化细胞，如能够复制权利要求52所述的核酸片段的转化细胞。
55、根据权利要求54所述的转化细胞，该细胞是选自下述的微生物细菌、酵母、原生动物或来源于选自下述多细胞机体的细胞真菌、昆虫细胞如S2或SF细胞、植物细胞和哺乳动物细胞。
56、根据权利要求58或59所述的转化细胞，该细胞表达权利要求48所述的核酸片段，如在其表面分泌或携带根据权利要求46所述的类似物的转化细胞。
57、根据权利要求1-20中任一权利要求所述的方法，其中通过应用非病源体的微生物或病毒影响向免疫系统的提呈，其中非病源体的微生物携带编码和表达饥饿激素多肽、亚序列或类似物的的核酸片段。
58、在自体宿主细胞中诱导对抗饥饿激素多肽抗体生成的成分，该成分包括-权利要求52所述的核酸片段或根据权利要求53-57中任一项所述的载体，和-药学上和免疫学上可接受的载体和/或赋形剂和/或佐剂。
59、一稳定的细胞系，该细胞系携带有权利要求49-53任一项所述的载体，并表达权利要求48所述的核酸片段，且在其表面上可选择的分泌或携带权利要求46所述的类似物。
60、一种制备权利要求54-56中任一权利要求所述的细胞的方法，该方法包括用权利要求48所述的核酸片段或权利要求53-57中任一项所述的载体转化宿主细胞。
权利要求
1.针对包括人类的动物中自体饥饿激素免疫的方法，该方法包括将免疫有效量的免疫原有效提呈给动物免疫系统，该免疫原选自至少一种饥饿激素多肽或其亚序列，其配方使含有饥饿激素多肽或其亚序列的动物的免疫诱导对抗动物自体饥饿激素的抗体的产生，以及至少一种掺入在同一分子中的饥饿激素类似物，至少一种饥饿激素的B-细胞的表位，以及至少一种不是来自饥饿激素的化学部分，以使用类似物免疫动物诱导对抗饥饿激素的抗体的生成。
2.根据权利要求1所述的方法，其中免疫原是饥饿激素类似物。
3.根据权利要求2所述的方法，其中类似物已经保存了饥饿激素B-细胞表位的实质部分，其中类似物也包括至少一种外源T-细胞辅助淋巴细胞表位(TH表位)，和/或至少一种影响类似物靶向一抗原提呈细胞(APC)的或B-淋巴细胞的第一部分，和/或至少一种刺激免疫系统的第二部分，和/或至少一种优化类似物出现在免疫系统中的第三部分。
4.根据权利要求3所述的方法，其中外源TH表位和/或第一和/或第二和/或第三部分通过连接到合适的侧链饥饿激素或其亚序列出现在类似物中。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其中类似物是饥饿激素多肽，该饥饿激素多肽通过至少一种氨基酸取代和/或缺失和/或插入和/或添加进行修饰。
6.根据权利要求5所述的方法，其中类似物是融合多肽。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其中氨基酸取代和/或缺失和/或插入和/或添加进行修饰在类似物中基本保留饥饿激素的所有的三级结构。
8.根据权利要求2-7中任一项所述的方法，其中类似物包括至少一种饥饿激素B-细胞表位的复制和/或半抗原的引入。
9.根据权利要求3-8中任一项所述的方法，其中外源T-细胞表位在动物中是免疫显型的。
10.根据权利要求3-9中任一项所述的方法，其中外源T-细胞表位是混杂的。
11.根据权利要求10所述的方法，其中至少一种外源T-细胞表位选自天然混杂的T-细胞表位和肽人工肽MHC-II结合序列。
12.根据权利要求11所述的方法，其中天然的T-细胞表位选自破伤风类毒素表位，如P2或P30，白喉类毒素表位，流感病毒hemagluttinin表位，和P.恶性疟原虫CS表位。
13.根据权利要求3-12中任一项所述的方法，其中第一部分是B-淋巴细胞特异表面抗原或APC特异表面抗原的实质的特异结合配体，如在B-淋巴细胞或APC上具有一受体的半抗原或糖类。
14.根据权利要求3-13中任一项所述的方法，其中第二部分选自细胞因子和热休克蛋白。
15.根据权利要求6所述的方法，其中细胞因子选自干扰素γ(IFN-γ)、Flt3L、白介素1(IL-1)、白介素2(IL-2)、白介素4(IL-4)、白介素6(IL-6)、白介素12(IL-12)、白介素13(IL-13)、白介素15(IL-15)和的粒细胞—巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，或是其有效部分其中的热休克蛋白选自HSP70、HSP90、HSC70、GRP94和钙网蛋白(CRT)，或是其有效部分。
16.根据权利要求3-15中任一项所述的方法，其中第三部分是脂类属性，如棕榈酰基、十四烷基、法呢基、香叶酯-香叶酯基、GPI-锚和N-乙酰甘油二酯。
17.根据前述的任一项所述的方法，其中免疫原含有用相同或不同长度的氨基酸序列取代至少一种饥饿激素多肽内的氨基酸序列，所述的长度可以在类似物中产生外源TH表位。
18.根据前述的任一项所述的方法，其中饥饿激素多肽包括对应于SEQID NO11中氨基酸24-51或其亚序列的氨基酸序列，其中在类似物中插入氨基酸序列产生外源TH表位，或者至少一种氨基酸序列被在类似物中产生外源TH表位的相同或不同长度的氨基酸序列取代，其中的引入在任何一种下述氨基酸后进行，SEQ ID NO11中的氨基酸1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116和117；其中可以缺失的氨基酸是SEQ ID NO11中的氨基酸1和/或2和/或3和/或4和/或5和/或6和/或7和/或8和/或9和/或10和/或11和/或12和/或13和/或14和/或15和/或16和/或17和/或18和/或19和/或20和/或21和/或22和/或23和/或24和/或25和/或26和/或27和/或28和/或29和/或30和/或31和/或32和/或33和/或34和/或35和/或36和/或37和/或38和/或39和/或40和/或41和/或42和/或43和/或44和/或45和/或46和/或47和/或48和/或49和/或50和/或51和/或52和/或53和/或54和/或55和/或56和/或57和/或58和/或59和/或60和/或61和/或62和/或63和/或64和/或65和/或66和/或67和/或68和/或69和/或70和/或71和/或72和/或73和/或74和/或75和/或76和/或77和/或78和/或79和/或80和/或81和/或82和/或83和/或84和/或85和/或86和/或87和/或88和/或89和/或90和/或91和/或92和/或93和/或94和/或95和/或96和/或97和/或98和/或99和/或100和/或101和/或102和/或103和/或104和/或105和/或106和/或107和/或108和/或109和/或110和/或111和/或112和/或113和/或114和/或115和/或116和/或117。
19.根据权利要求23所述的方法其中类似物选自具有选自SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4和SEQ ID NO5的氨基酸序列的多肽。
20.根据权利要求20所述的方法，其中免疫原的聚氨基酸共价或非共价连接到能够影响抗原决定簇的多重复制的提呈的载体分子上，其中聚氨基酸选自饥饿激素多肽、饥饿激素亚序列和饥饿激素类似物。
21.根据权利要求20所述的方法，其中载体分子含有或由药学上可接受的激活的聚羟基聚合物组成。
22.根据从属于权利要求3的权利要求21所述的方法，其中聚羟基聚合物作为载体主链分别连接到1)饥饿激素多肽或其亚序列和2)外源TH表位。
23.根据权利要求21或22所述的方法，其中聚氨基酸通过被肽酶裂解的键结合到聚羟基聚合物上，如酰胺键或肽键。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述的聚氨基酸提供相应酰胺键的氮部分。
25.根据权利要求21-24中任一项所述的方法，其中聚羟基聚合物载体基本没有氨基酸残基。
26.根据权利要求21-25中任一项所述的方法，其中聚氨基酸通过在氨基酸序列的N-末端的氮结合到激活的聚羟基聚合物上。
27.根据权利要求21-26中任一项所述的方法，其中聚羟基聚合物是水溶性的。
28.根据权利要求21-26中任一项所述的方法，其中聚羟基聚合物是水不溶性的。
29.根据权利要求21-28中任一项所述的方法，其中聚羟基聚合物选自天然生成的聚羟基化合物和合成的聚羟基化合物。
30.根据权利要求21-29中任一项所述的方法，其中聚羟基聚合物是多糖。
31.根据权利要求30所述的方法，其中多糖选自乙酰、支链淀粉、琼脂树胶、琼脂糖、藻酸盐、阿拉伯树胶、carregeenan、纤维素、环式糊精、右旋糖苷、帚叉藻聚糖(Furcellaran)、半乳甘露聚糖、白明胶、茄替胶、葡聚糖、糖原、瓜耳胶、刺梧桐树胶、魔芋/A(konjac/A)、刺槐豆胶(LOCUST BEAN GUM)、甘露聚糖、果胶、胶质、亚麻、淀粉、tamarine、黄芪胶、黄原胶、木聚糖和木葡聚糖。
32.根据权利要求31所述的方法，其中聚羟基聚合物是右旋糖苷。
33.根据权利要求21-29中任一项所述的方法，其中聚羟基聚合物选自高分支聚(乙烯亚胺)(PEI)、tetrathienylene vinylene、芳纶(poly-paraphenyl terephtalamide的长链)、聚(聚氨酯橡胶)、聚(硅氧烷)、聚二甲基硅氧烷、硅树脂、聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)、聚(乙烯醇)、聚(乙烯吡咯酮)、聚(2-羟基异丁烯酸)、聚(N-乙烯吡咯酮)、聚(乙烯醇)、聚(丙烯酸)、聚四氟乙烯(PTFE)、聚丙烯酰胺、聚(乙烯-co-乙烯醋酸盐)、聚(乙烯乙二醇)和衍生物，聚(甲基丙烯酸)、聚交酯(PLA)、聚乙醇酸交酯(PGA)、聚(丙交酯-共-乙醇酸交酯)(PLGA)、聚酐(Polyanhydrides)和聚原磷酯(Polyorthoesters)。
34.根据权利要求21-33中任一项所述的方法，其中激活前的聚羟基聚合物的平均分子量为至少500。
35.根据权利要求21-34中任一项所述的方法，其中聚羟基聚合物由选自下述的官能团激活tresyl(三氟乙基磺酰基)、马来酰亚胺、p-氮苯基卡乐甲酸盐和甲苯磺酰基(p-甲苯磺酰)。
36.根据权利要求21-35中任一项所述的方法，进一步包括至少一种与聚羟基聚合物偶联的进一步聚氨基酸，所述的至少一种进一步的聚氨基酸选自下述基团免疫刺激肽或靶向肽。
37.根据前述的任一项所述的方法，其中有效量的免疫原通过选自非肠道的方式服用到动物体内如皮下的、真皮的、皮层内的、皮内的和肌肉的方式；腹膜的方式；口服的方式；口腔的方式；舌下的方式；硬脑膜外的方式；脊髓的方式；肛门的方式和颅内的方式。
38.根据权利要求28所述的方法，其中的有效量为0.5微克～2000微克之间的饥饿激素多肽、其亚序列及其类似物。
39.根据权利要求28或29所述的方法，其中饥饿激素多肽或类似物包含在虚拟淋巴结(VLN)装置内。
40.根据权利要求20-39中任一项所述的方法，其中饥饿激素多肽及其亚序列，或者饥饿激素类似物和佐剂一起配制，该佐剂有利于打破对自身抗原的自身耐受。
41.根据权利要求1-19中任一项所述的方法，其中通过将编码免疫原的核酸引入到动物细胞影响免疫原向免疫系统的提呈，因而通过引入的核酸的细胞获得体内表达。
42.根据权利要求41所述的方法，其中引入的核酸选自裸露的DNA、与带电或不带电的脂质配制的DNA、配制进脂质粒的DNA、包含在病毒载体内的DNA、和转染-便利蛋白质或多肽配制的DNA、和靶向蛋白质或多肽配制的DNA、和钙沉淀剂配制的DNA、与惰性载体分子偶联的DNA、在几丁质或壳聚糖中包裹的DNA、以及与佐剂配制的DNA。
43.根据权利要求42所述的方法，其中核酸包含在VLN装置内。
44.根据权利要求37-43中任一项所述的方法，其中包括每年至少服用/引入一次，如服用/引入至少2次、至少3次、至少4次、至少6次和至少12次。
45.根据前述任一项所述的方法，其中免疫的结果是自体饥饿激素下调。
46.根据权利要求1-44中任一项所述的方法，其中免疫的结果是自体饥饿激素上调。
47.一种治疗和/或预防和/或改善肥胖或特征为体内脂肪沉积过量为特征的其它疾病和状态的方法，该方法包括根据权利要求45所述的方法下调饥饿激素至体内脂肪的总量明显下降的程度。
48.一种增加动物体重的方法，例如人类，该方法包括根据权利要求46所述的方法上调动物体内的自体饥饿激素。
49.来源于动物饥饿激素多肽的饥饿激素多肽的类似物，其中该类似物引入了修饰，因而用类似物免疫动物诱导了对抗动物自体饥饿激素多肽的抗体的生成。
50.根据权利要求49所述的类似物，由权利要求3-36中任一权利要求所定义。
51.一种致免疫的组合物，其含有—动物体内固有的免疫原有效量的饥饿激素多肽或所述饥饿激素多肽的亚序列，所述的饥饿激素多肽或其亚序列与免疫学上可接受的佐剂一起配制以打破动物针对饥饿激素多肽的自体耐受性，该组合物进一步含有药学上和免疫学上可接受的载体和/或赋形剂，或—免疫原有效量的根据权利要求49或50所述的类似物，该组合物进一步含有药学上和免疫学上可接受的载体和/或赋形剂，以及可选择的佐剂。
52.一种编码如权利要求3-19中任一项所述的类似物的核酸片段。
53.一种携带根据权利要求52所述的核酸片段的载体，如能够自体复制的载体。
54.根据权利要求53所述的载体，选自质粒、噬菌体、粘粒、微型—染色体和病毒。
55.根据权利要求53或54所述的载体，在5’→3’的方向和可操作的连接的包括启动根据权利要求52所述的核酸片段表达的启动子，可选择的编码能够将多肽片段分泌或整合进膜的前导肽的核酸序列，根据权利要求51的核酸片段，和可选择的终止子。
56.根据权利要求53-55中任一项所述的载体，当引入到宿主细胞时，能够或不能整合进宿主细胞。
57.根据权利要求55或56所述的载体，其中所述的启动子驱动真核细胞和/或原核细胞内的表达。
58.携带权利要求53-57中任一项所述的载体的转化细胞，如能够复制权利要求52所述的核酸片段的转化细胞。
59.根据权利要求60所述的转化细胞，该细胞是选自下述的微生物细菌、酵母、原体内物或来源于选自下述多细胞机体的细胞真菌、昆虫细胞如S2或SF细胞、植物细胞和哺乳动物细胞。
60.根据权利要求58或59所述的转化细胞，该细胞表达权利要求52所述的核酸片段，如在其表面分泌或携带根据权利要求49或50所述的类似物的转化细胞。
61.根据权利要求1-19中任一项所述的方法，其中通过应用非病源体的微生物或病毒影响向免疫系统的提呈，其中非病源体的微生物携带编码和表达饥饿激素多肽、亚序列或类似物的的核酸片段。
62.在自体宿主中诱导针对饥饿激素多肽的抗体生成的组合物，该组合物包括—权利要求52所述的核酸片段或根据权利要求53-57中任一项所述的载体，和—药学上和免疫学上可接受的载体和/或赋形剂和/或佐剂。
63.一种稳定的细胞系，该细胞系携带有权利要求53-57任一项所述的载体，并表达权利要求52所述的核酸片段，且在其表面上可选择的分泌或携带权利要求49或50所述的类似物。
64.一种制备权利要求58-60中任一项所述的细胞的方法，该方法包括用权利要求52所述的核酸片段或权利要求53-57中任一项所述的载体转化宿主细胞。
65.一种识别修饰的饥饿激素多肽的方法，该饥饿激素多肽能够诱导对抗动物种群中未修饰的饥饿激素多肽的抗体，其中该未修饰饥饿激素多肽是自体蛋白质，该方法包括—通过肽合成或遗传工程技术制备一组相互之间不同之间不同的修饰饥饿激素多肽，其中氨基酸被添加、插入、缺失或取代动物种群中的饥饿激素多肽中的氨基酸序列，因而成组的产生含有对动物种群是外源的T-细胞表位的氨基酸序列；或者制备编码一组相互之间不同的修饰的饥饿激素多肽的核酸片段；—测试成组修饰的饥饿激素多肽或核酸片段成员通过动物种群对抗未修饰饥饿激素多肽诱导抗体产生的能力；以及—识别和可选择的分离成组修饰的饥饿激素多肽成员，该多肽明显诱导对抗动物种群中未修饰的饥饿激素多肽的抗体的产生，或者识别和可选择的分离由成组核酸片段成员编码的多肽表达产物，该成组的核酸片段明显诱导对抗动物种群中未修饰饥饿激素多肽的抗体的产生。
66.一种制备致免疫的组合物的方法，包括至少一种修饰的饥饿激素多肽，该饥饿激素多肽能够诱导动物种群中对抗未修饰饥饿激素多肽的抗体，其中该未修饰饥饿激素多肽是自体蛋白，该方法包括—通过肽合成或遗传工程技术制备一组相互之间不同的修饰饥饿激素多肽，其中氨基酸增加、插入、缺失或取代动物种群中的饥饿激素多肽的氨基酸序列，因而成组的产生含有T-细胞表位、并对动物种群来说是外源的氨基酸序列；—测试组修饰员通过动物种群诱导对抗未修饰饥饿激素多肽的抗体的产生的能力；以及—混和组员，该组员明显诱导动物种群中抗体的生成，该抗体和具有药学上和免疫学上可接受的载体和/或赋形剂的饥饿激素多肽反应，可选择的和至少一种药学上和免疫学上可接受的佐剂结合。
67.根据权利要求65或66所述的方法，其中组员的制备包括制备相互之间不同的氨基酸序列，每个序列是权利要求62所述的氨基酸序列，将核酸序列插入到合适的表达载体中，用载体转化合适的宿主细胞或宿主动物，影响核酸序列的表达，可选择的接着分离表达载体产物。
68.根据权利要求67所述的方法，其中核酸序列和/或载体的制备通过分子扩增技术如PCR的辅助或核酸合成的辅助实现。
69.饥饿激素多肽或其亚序列用于制备含有用于下调动物体内饥饿激素的佐剂的致免疫组合物的用途。
70.饥饿激素多肽或其亚序列用于制备含有用于下调动物体内饥饿激素的佐剂的致免疫组合物的用途。
71.饥饿激素多肽或其亚序列用于制备含有用于治疗、预防或改善以体内脂肪沉积过量为特征的肥胖的佐剂的致免疫组合物的用途。
72.饥饿激素多肽其亚序列用于制备含有用于治疗、预防或改善厌食、萎靡不振、外伤或烧伤、或辅助体外受精治疗的佐剂的致免疫组合物的用途。
73.饥饿激素多肽类似物用于制备致免疫组合物的用途，所述的致免疫组合物可选择的包括用于动物体内下调饥饿激素的佐剂。
74.饥饿激素多肽类似物用于制备致免疫组合物的用途，所述的致免疫组合物可选择的包括用于治疗、预防或改善以体内脂肪沉积过量为特征的肥胖的佐剂。
75.饥饿激素多肽类似物用于制备致免疫组合物的用途，所述的致免疫组合物可选择的包括用于动物体内上调饥饿激素的佐剂。
76.饥饿激素多肽类似物用于制备致免疫组合物的用途，所述的致免疫组合物可选择的包括治疗、预防或改善厌食、萎靡不振、外伤或烧伤、或辅助体外受精治疗的佐剂。
全文摘要
本发明公开的新颖的方法主要是对抗自体饥饿激素的免疫。免疫通过服用自体饥饿激素的类似物的而实现，所述的类似物能够诱导对抗自体饥饿激素多肽的抗体的生成。特别优选的免疫原是自体饥饿激素，其中通过引入单个或几个外源的免疫显型和混杂的T－细胞表位进行修饰。本发明也公开了对抗饥饿激素的核酸接种疫苗，该接种疫苗利用活的疫苗，以及有利于接种疫苗的方法和手段。这些方法和手段包括类似物和药学上的剂型的制备，以及核酸片段、载体、转化细胞、多肽和药学剂型的制备。
文档编号A61K39/39GK1694724SQ03825086
公开日2005年11月9日 申请日期2003年9月12日 优先权日2002年9月12日
发明者T·E·G·鲍文, S·克里斯勒 申请人:法麦克萨有限公司