指示癌症疗法的srm测定的制作方法
【专利说明】指示癌症疗法的SRM测定
[0001] 引言
[0002] 肺癌是最普遍的癌症（美国每年>200, 000个新增病例）且具有五年低存活率（约 15% )。肺癌的疗法从使用由放射、叶酸代谢、基于销的药物和/或基于紫杉醇的药物组 成的疗法的有限选择过渡到需要组织学表征肿瘤和/或关键生物标志物或治疗祀标蛋白 质的存在与否的更大程度祀向的治疗。所有肺癌中有整整80%的肺癌属于非小细胞肺癌 (NS化C)类型且该一般类型可基于组织学分析分成4种不同的亚型：腺癌、鱗状细胞癌、细 支气管肺泡癌和大细胞未分化癌。剩余20%的肺癌被称为小细胞肺癌（S化C)。近来利用 的祀向癌症疗法已经在治疗NSCLC患者和SCLC患者两方面显示出激动人屯、的成功。癌症 疗法的祀向方法在癌症的生长是由一种或多种特异性祀标蛋白质驱动时最有利，其中该一 种或多种祀标癌症的蛋白质被设计并制造成抑制该一种或多种祀标蛋白质的治疗剂特异 性攻击，因此抑制癌症的生长。提供肤和肤序列W便在SRM/MRM测定中使用，该SRM/MRM测 定可用W定量地确定在来源于肺癌患者的肿瘤组织中直接表达或过度表达的蛋白质祀标。 运容许改进对于祀向肺癌疗法的治疗判断。还提供一种SRM/MRM测定，其可用W定量地确 定在来源于具有除肺癌外的癌症的患者的肿瘤组织中直接表达或过度表达的蛋白质祀标， 从而改进对于不是肺癌的任何其它癌症的祀向治疗判断。
[0003] 概述
[0004] 提供来源于W下蛋白质的子序列的特异性肤：ALK、Ros、Ron、Ret、TS和FGFRl。ALK 也称作ALK酪氨酸激酶受体和CD246且在本文中称为ALK。Ros也称作C-Ros受体酪胺酸 激酶且在本文中称为Ros。Ron也称作巨隧细胞-刺激蛋白质受体CD136和pl85-Ron且在 本文中称为Ron。Ret也称作原致癌基因酪氨酸-蛋白激酶受体Ret和原致癌基因C-Ret 且在本文中称为Ret。TS也称作胸巧酸合酶且在本文中称为TS。FGFRl也称作成纤维细胞 生长因子受体1和CD331且在本文中称为FGFRl。
[0005] 来源于蛋白质的各种肤的肤序列和碎裂/过渡离子可潜在地用于基于质谱的选 择性反应监测（SRM)测定中，其在本文中也称为多反应监测（MRM)测定，在下文中简称为 SRM/MRM测定。描述了用于ALK、Ros、Ron、Ret、TS和FGFRl蛋白质和那些蛋白质的同种型 的SRM/MRM分析的肤的用途。
[0006] 可使用一种或多种、两种或更多种、=种或更多种、四种或更多种或五种或六种 SRM/MRM测定来检测来自ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFRl蛋白质的特异性肤中的一种 或多种的存在并测量其相对或绝对定量水平，且由此提供通过质谱法测量在从生物样品中 获得的给定蛋白质制剂中那些蛋白质中的每一种的总量的方法。可自那些蛋白质得到的肤 中的全部或全部的一部分也可在单一SRM/MRM测定中同时分析或可在单个SRM/MRM测定的 任何组合中分析。所述肤各自提供通过质谱法测量在从生物样品中获得的给定蛋白质制剂 中相应蛋白质中的每一种的总量的潜在方法。
[0007] 本文描述的SRM/MRM测定可直接测量在由从例如福尔马林固定的癌症患者组织 (例如，活检）的患者组织样品取得的细胞制备的复杂蛋白质溶胞样品中的运些肤。由福 尔马林固定的组织制备蛋白质样品的方法描述在美国专利7, 473, 532号中，其内容W引用 的方式整体并入本文中。在该专利中描述的方法可使用自ExpressionPathologyInc. (Rockville,MD)得到的LiquidTissue试剂和方案方便地进行。
[0008] 甲醒/福尔马林固定从癌症患者中手术移出的组织是在病理学实践中已经接受 的惯例。因此，甲醒/福尔马林固定的石蜡包埋组织是来自那些患者的组织的最广泛可用 的形式。甲醒/福尔马林固定通常采用称为福尔马林的甲醒水溶液。"100%"福尔马林由 甲醒在水中的饱和溶液（约40体积％甲醒或37质量％ )组成，其具有少量用W限制氧化 和聚合程度的通常为甲醇的稳定剂。保藏组织的最常用方式是将整体组织在通常称为10% 中性缓冲的福尔马林的水性甲醒中持续时间（8小时-48小时）浸泡，接着在室溫下将固定 的整体组织包埋在石蜡中W便长期储存。因此，分析福尔马林固定的癌症组织的分子分析 方法将是用于分析癌症患者组织的最被接受且大量利用的方法。
[0009] 来自所述一种或多种SRM/MRM测定的结果可用于关联在自其中收集并保藏组织 (生物样品）的患者或受试者的具体组织样品（例如，癌症组织样品）内运些蛋白质中的任 一种或全部的准确且精确的定量水平，加之运些蛋白质的潜在同种型的准确且精确的定量 水平。运不仅提供关于癌症的诊断信息，而且容许医师或其它医疗专业人员确定用于患者 或受试者的适当疗法。提供关于在患病组织中或在另一患者/受试者样品中蛋白质表达水 平的诊断和治疗重要信息的运一测定称为伴随诊断测定。例如，运一测定可设计用W诊断 癌症的阶段、程度或组织学并确定将最有效阻止癌症细胞生长的治疗剂，从而确定患者或 受试者将最可能应答的治疗剂。
[0010] 更具体地讲，在来自患者的癌症细胞中的ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFRl蛋白 质中的一种或多种、两种或更多种、=种或更多种、四种或多种、五种或多种的检测和/或 定量指示最值得注意的是肺癌的癌症的生长，并鉴定可通过祀向治疗方案祀向的蛋白质。
[0011] 详述
[0012] 本文所述的测定量化或测量来自包括ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFRl蛋白质 的蛋白质的特异性未修饰肤的相对或绝对水平并且可测量来自那些蛋白质的特异性修饰 肤的相对或绝对水平。修饰的实例包括在所述肤上存在的憐酸化氨基酸残基和糖基化氨基 酸残基。
[0013] 蛋白质和潜在同种型的相对定量水平可通过SRM/MRM方法学，例如通过比较SRM/ MRM波形特征峰面积（例如，波形特征峰面积或积分的片段离子强度）来确定。单个ALK、 Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFRl肤的相对水平可在不同样品（例如，对照样品和由患者或 受试者的组织制备的样品）中确定。或者，在各种肤具有其自己的具体SRM/MRM波形特征 峰的情况下，可W比较ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFRl波形特征肤中的一种或多种的 多个SRM/MRM波形特征峰面积。通过比较峰面积，可W确定在一种生物样品中或在一种或 多种额外或不同的生物样品中相对ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFRl蛋白质和潜在蛋白 质同种型的含量。W此方式，可通过可在相同实验条件下测定多个（例如，2、3、4、5或更多 个）生物样品来确定来自那些蛋白质的一种或多种特定肤的相对量且因此确定ALK、Ros、 Ron、Ret、TS和/或FGFRl蛋白质及其潜在同种型的相对量。另外，相对定量可通过比较通 过SRM/MRM方法学得到的一种或多种给定肤的波形特征峰面积与来自在来自生物样品的 相同蛋白质制剂内的一种或多种不同蛋白质的一种或多种另外且不同的肤的波形特征峰 面积而对于来自在单一样品内的ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFRl蛋白质的所述一种或 多种给定肤来确定。
[0014] 使用所述方法学，可确定来自ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFRl蛋白质的特定 肤的量，因此确定相应蛋白质及其潜在同种型中的每一种的量，所述量是相对于在同一样 品内或在不同样品中的一者对于另一者而言的。因为单个肤或多种肤的相对定量可相对 于在样品内或在样品之间另外一种或多种肤的量来进行，所W可W确定所存在的肤的相对 量（例如，通过确定一种肤相对于另一种肤的峰面积），而与在生物样品中蛋白质的绝对重 量：体积或重量：重量的量无关。因此，在来自生物样品的蛋白质制剂中ALK、Ros、Ron、 Ret、TS和/或FGFRl肤的量可用来确定在各种样品内及在各种样品之间那些蛋白质的量。 通常将关于在不同样品之间单个波形特征峰面积的相对定量数据标准化成每种样品中所 分析蛋白质的量（例如，使用样品的总蛋白质浓度和所分析的体积来使样品标准化）。相 对定量可对于来自多种蛋白质的许多肤和在单一样品中的ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或 FGFRl蛋白质同时进行和/或对于许多样品进行，W获得对于相对蛋白质量和/或一种肤/ 蛋白质相对于其它肤/蛋白质的进一步了解。
[0015]ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFRl蛋白质的绝对定量水平通过例如SRM/MRM方 法学确定，由此将来自在一种生物样品中的ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFRl蛋白质的 单个肤的SRM/MRM波形特征峰面积与在已知量的样品中"示踪的"已知量的一种或多种内 标物（例如，同位素标记的标准物）的SRM/MRM波形特征峰面积相比较。在一个实施方案 中，所述内标物为合成形式的相同的精确的ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFRl肤，其含有 用一种或多种重同位素标记的一个或多个氨基酸残基。合成所述同位素标记的内标物，由 此质谱分析产生与天然ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFRl肤波形特征峰不同且截然不同 并可用作比较峰的可预测且一致的SRM/MRM波形特征峰。因此，当内标物W已知量示踪到 来自已知量的生物样品的蛋白质或肤制剂中并通过质谱分析时，可将天然肤的SRM/MRM波 形特征峰面积与内标肤的SRM/MRM波形特征峰面积相比较。数值比较容许计算在来自生物 样品的原始蛋白质制剂中存在的天然肤的绝对摩尔浓度和/或绝对重量，可由其确定相应 蛋白质的浓度和重量。片段肤的绝对定量数据通常根据每种样品中所分析的蛋白质的量来 显示。绝对定量可对于许多肤进行，其容许同时定量确定在单一样品中的多种蛋白质（例 如，两种、S种、四种、五种等）；和/或对于多种样品进行，W获得对于在单个生物样品中和 /或在整组的单个样品中绝对蛋白质量的了解。在一个实施方案中，蛋白质的定量可使用如 由Gygi等在美国专利7, 501，286中描述的肤标准物来进行。
[0016] 除非另作指定，否则本文使用的术语量化（quantify)、量化（quantifying)、测量 (measure)或测量（measuring)意指测定例如蛋白质、多肤、肤、标准物（例如，内标物）的 分析物的相对或绝对水平。
[0017] 本文所述的测定法可在采用例如源自患者或源自受试者的组织如福尔马林固定 的组织时用作确定癌症的阶段的辅助手段。本文所述的SRM/MRM测定也可用作确定哪种治 疗剂将最有利地用于治疗该患者或受试者的辅助手段。
[0018] 为了检验与本文所述的肺癌相关的蛋白质的水平，可对经由手术除去部分或全部 肿瘤或经由为了确定疑似疾病的存在与否而进行的活检方法从患者或受试者移出的癌性 组织或怀疑患癌的组织进行分析。分析所述组织的样品W确定ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/ 或FGFRl蛋白质中的一种或多种和那些蛋白质的形式在患者或受试者的组织中是否存在。 此外，可确定那些蛋白质中的一种或多种的表达水平并将其与在健康组织中见到的"正常" 或参考水平相比较。在健康组织中的蛋白质的正常或参考水平可来源于例如没有癌症的一 个或多个个体的有关组织。或者，可通过分析未受癌症影响的有关组织（例如，相同器官的 部分）对于具有癌症的个体获得正常