Tau免疫疗法
【专利说明】TAU免疫疗法
[0001] 相关申请案的交叉引用
[0002] 本申请是2013年3月13日提交的61/780, 624和2013年3月15日提交的 61/800, 382的非临时申请，所述每篇申请均通过引用的方式整体并入本文用于所有目的。
[0003] 发明背景
[0004]Tau是众所周知的人蛋白质，其可以磷酸化形式存在（参见，例如，Goedert，Proc. Natl.Acad.Sci.U.S.A. 85:4051-4055 (1988) ；Goedert,EMBOJ. 8 : 393-399 (1989)； Lee,Neuron2:1615-1624(1989) ；Goedert,Neuron3:519-526(1989)； Andreadis,Biochemistry31:10626-10633 (1992)。已报道Tau具有稳定微管的作用，尤 其是在中枢神经系统中。通过大脑响应神经损伤和神经退行性变释放总tau(t-tau，即磷 酸化和未磷酸化形式）和磷酸化-tau(p-tau，即磷酸化tau)，且已报道相对于普通人群其 在阿尔茨海默病（Alzheimer)患者的CSF中其发生的水平增加（Jack等，LancetNeurol 9:119 - 28(2010))〇
[0005]Tau是神经原纤维缠结的主要组分，其与斑块一起作为阿尔茨海默病的标志特征。 所述缠结构成直径IOnm的异常纤维，所述异常纤维成对出现并以SOnm的规则周期性按螺 旋方式缠绕。神经原纤维缠结中的tau被连接在分子特定位点的磷酸基团异常磷酸化（过 度磷酸化）。在阿尔茨海默病内嗅皮质的层II神经元、CAl和海马的钩回下区、杏仁核及新 皮层的更深层（层III、层V和浅层VI)可看到神经元纤维缠结的严重受累。也已报道过度 磷酸化的tau干扰微管组装，其可能加速神经元网络的破坏。
[0006]Tau内含物是几种神经退行性疾病的确定性神经病理学的一部分，所述神经退行 性疾病包括阿尔茨海默病、额颞叶变性、进行性核上性麻痹和皮克氏病（Pick'sdisease)。[0007] 发明概述
[0008] 本发明提供了与单克隆抗体16B5竞争结合tau的单克隆抗体。一些抗体是人源 化的、嵌合的、镶饰的或人抗体。一些抗体是人IgG同种型（例如，IgGUIgG2或IgG4)。一 些此类抗体具有包含序列SEQIDN0:29的人IgGl恒定区。一些抗体具有包含序列SEQID N0:32的人K恒定区。一些抗体具有在恒定区的至少一个突变。
[0009] -些抗体是人源化的、嵌合的或镶饰形式的单克隆抗体16B5。一些抗体具有单克 隆抗体16B5的如Kabat定义的三个轻链⑶R和如Kabat定义的三个重链⑶R。一些抗体与 磷酸化和未磷酸化形式的tau结合。
[0010] 本发明还提供了与SEQIDNO:USwiss-Prot编号P10636-8)的残基24-46中的 表位特异性结合的单克隆抗体。一些此类抗体是人的、人源化的、嵌合的或镶饰的抗体。一 些抗体与SEQIDNO: 1的残基25-44中的表位特异性结合。一些抗体与SEQIDNO: 1的残 基30-39中的表位特异性结合。一些抗体与磷酸化和未磷酸化形式的tau结合。
[0011] 本发明还提供了包含成熟的重链可变区和成熟的轻链可变区的单克隆抗体，所述 成熟的重链可变区具有与SEQIDN0:15至少90% (例如，至少95%、至少98%、至少99%) 相同的氨基酸序列，所述成熟的轻链可变区与SEQIDN0:22至少90% (例如，至少95%、至 少98%、至少99%)相同。在某些实施方案中，所述单克隆抗体包含具有SEQIDNO: 15的 三个Kabat⑶R和具有SEQIDNO: 22的三个Kabat⑶R。在一些抗体中，所述成熟的重链 可变区具有指定为SEQIDNO: 15的氨基酸序列，且所述成熟的轻链可变区具有指定为SEQ IDNO:21、22或23的氨基酸序列。
[0012] 在一些抗体中，位置H13、H48和H91的至少一个分别由K、M和F占据，且位置LU L4、L36和L43的至少一个分别由N、L、F和S占据。在一些抗体中，位置H13、H48和H91分 别由K、M和F占据，位置L1、L4、L36和L43的至少两个分别由N、L、F和S占据。在一些抗 体中，位置H13、H48和H91分别由K、M和F占据，且位置LUL4、L36和L43的至少三个分 别由N、L、F和S占据。在一些抗体中，位置H13、H48和H91分别由K、M和F占据，且位置 LI、L4、L36和L43分别由N、L、F和S占据。
[0013] 在一些抗体中，所述成熟的重链可变区与重链恒定区融合，且所述成熟的轻链可 变区与轻链恒定区融合。在一些抗体中，所述重链恒定区是天然人恒定区的突变形式，其相 对于天然人恒定区具有降低的Fcy受体结合。在一些抗体中，所述重链恒定区是IgGl同 种型。
[0014] 在一些抗体中，分别来自SEQIDN0S: 15和22的成熟的重链可变区和成熟的轻链 可变区的⑶Rs的差异存在于位置H60-H65中。
[0015] 所述抗体可以是完整的抗体或片段，如Fab片段。
[0016] 任意单克隆抗体或片段可以与细胞毒性或细胞生长抑制剂结合。
[0017] 本发明还提供了使抗体人源化的方法。一些方法包括测定小鼠抗体的重链和轻链 可变区的序列；合成编码包含小鼠抗体重链的CDR的人源化重链的核酸和包含小鼠抗体轻 链的CDR的人源化轻链的核酸；并在宿主细胞中表达所述核酸以产生人源化抗体，其中所 述小鼠抗体是16B5。
[0018] 本发明还提供了生产人源化的、嵌合的或镶饰的抗体的方法。一些方法包括培养 由编码抗体的重链和轻链的核酸转化的细胞，以使细胞分泌抗体；并纯化来自细胞培养基 的抗体，其中所述抗体是16B5的人源化的、嵌合的或镶饰的形式。
[0019] 本发明还提供了制备产生人源化的、嵌合的或镶饰的抗体的细胞系方法。一些方 法包含将编码抗体的重链和轻链的载体及选择性标志物导入细胞；在一定条件下繁殖细胞 以选择拷贝数增加的载体的细胞；从选定细胞中分离单个细胞；并将由基于抗体产量选择 的单个细胞克隆的细胞建库；其中所述抗体是16B5的人源化的、嵌合的或镶饰的形式。
[0020] 本发明还提供了包含本文所公开的任意抗体和药学上可接受的载体的药物组合 物。
[0021] 本发明还提供了包含编码重链可变区的区段的核酸，所述重链可变区具有序列 SEQIDN0:10〇
[0022] 本发明还提供了包含编码重链可变区的区段的核酸，所述重链可变区具有序列 SEQIDNO: 15。在一些核酸中，所述区段具有核苷酸序列SEQIDNO: 25。一些核酸还包含编 码IgGl恒定区的区段，任选地人IgGl恒定区，例如，具有序列SEQIDNO: 29,条件是C-末端 赖氨酸可被省略。在一些核酸中，编码IgGl恒定区的区段具有核苷酸序列SEQIDN0:30。 一些此类核酸还包含连接编码重链可变区和IgGl恒定区的区段的内含子。例如，所述内含 子可具有SEQIDN0:31中发现的内含子的序列。因此，所述内含子和编码IgGl恒定区的 区段可具有核苷酸序列SEQIDN0:31。
[0023] 本发明还提供了包含编码轻链可变区的区段的核酸，所述轻链可变区具有序列 SEQIDNO:16〇
[0024] 本发明还提供了包含编码轻链可变区的区段的核酸，所述轻链可变区具有序列 SEQIDN0:21、22或23。在一些核酸中，所述编码轻链可变区的区段具有序列SEQID N0:26、27或28。一些此类核酸还包含编码K恒定区的区段。所述K恒定区可以是人K 恒定区且具有序列SEQIDN0:32。任选地，编码K恒定区的核酸具有序列SEQIDN0:33。 一些此类核酸还包含连接编码轻链可变区的区段和编码K恒定区的区段的内含子。例如， 所述内含子可具有SEQIDN0:34中发现的内含子的序列。因此，所述内含子和编码K恒 定区的区段可具有核苷酸序列SEQIDN0:34。
[0025] 任意上述抗体可包含重链和/或轻链，所述重链包含具有序列SEQ ID NO: 29的人 IgGl恒定区，所述轻链包含具有序列SEQ ID N0:32的人K恒定区。
[0026] 本发明还提供了tau的分离片段，其包括SEQIDNO:I(Swiss-Prot编 号P10636-8)的残基24-46内的tau的3-10个连续残基。一些片段包括SEQID NO:I(Swiss-Prot编号P10636-8)的残基30-39内的tau的3-10个连续残基。一些片段包 括SEQIDNO:USwiss-Prot编号P10636-8)的残基33-37。一些片段任选地通过间隔基与 载体分子连接，所述间隔基有助于引发对抗所述片段的抗体。一些片段是药物组合物的一 部分，所述组合物包括可接受施用于人的佐剂。
[0027] 本发明还提供了治疗或实现预防阿尔茨海默病的方法。一些方法包括向患有阿尔 茨海默病或处于患有阿尔茨海默病风险的患者施用有效方案的抗体或诱导所述抗体的试 剂，所述抗体与SEQIDNO:I(Swiss-Prot编号P10636-8)的残基24-46内的表位特异性结 合，从而治疗或实现预防所述疾病。优选地，所述抗体是本文所述的抗体。在一些方法中， 所述诱导所述抗体的试剂是tau的片段，其包括SEQIDNO:I(Swiss-Prot编号P10636-8) 的残基24-46内的tau的3-10个连续残基。在一些方法中，所述患者是ApoE4携带者。
[0028] 本发明还提供了治疗或实现预防tau相关疾病的方法。一些方法包括向患有疾病 或处于患有该病风险的患者施用有效方案的抗体或诱导所述抗体的试剂，所述抗体与SEQ IDNO:I(Swiss-Prot编号P10636-8)的残基24-46内的表位特异性结合，从而治疗或实现 预防所述疾病。优选地，所述抗体是本文中所述的抗体（例如，人源化的16B5抗体）。在 一些方法中，所述诱导所述抗体的试剂是tau的片段，其包括SEQIDNO:I(Swiss-Prot编 号P10636-8)的残基24-46中tau的3-10个连续残基。在一些方法中，所述疾病是神经疾 病。
[0029] 本发明还提供了减少tau异常传送的方法。一些方法包括向患有与tau异常传送 相关的疾病或处于患有与tau异常传送相关的疾病风险的患者施用有效方案的抗体或诱 导所述抗体的试剂，所述抗体与SEQ ID NO: USwiss-Prot编号P10636-8)的残基24-46内 的表位特异性结合，从而治疗或实现预防所述疾病。优选地，所述抗体是本文中所述的抗体 (例如，人源化的16B5抗体）。在一些方法中，所述诱导所述抗体的试剂是tau的片段，其 包含SEQ ID NO: I (Swiss-Prot编号P10636-8)的残基24-46中tau的3-10个连续残基。
[0030] 本发明还提供了诱导tau的吞噬作用的方法。一些方法包括向患有与tau的积聚 相关的疾病或处于患有与tau的积聚相关的疾病风险的患者施用有效方案的抗体或诱导 所述抗体的试剂，所述抗体与SEQ ID NO: I (Swiss-Prot编号P10636-8)的残基24-46内的 表位特异性结合。优选地，所述抗体是本文所述的抗体（例如，人源化的16B5抗体）。在 一些方法中，所述诱导所述抗体的试剂是tau的片段，其包括SEQ ID NO: I (Swiss-Prot编 号P10636-8)的残基24-46中tau的3-10个连续残基。在一些方法中，所述疾病是神经疾 病。
[0031] 本发明还提供抑制tau聚集或沉积的方法。在某些实施方案中，所述方法包括向 患有与tau聚集或沉积相关的疾病或处于患有与tau聚集或沉积相关的疾病风险的患者 施用有效方案的抗体或诱导所述抗体的试剂，所述抗体与SEQ ID NO: I (Swiss-Prot编号 P10636-8)的残基24-46内的表位特异性结合。优选地，所述抗体是本文所述的抗体（例 如，a人源化的16B5抗体）。在一些方法中，所述诱导所述抗体的试剂是tau的片段，其包 括SEQ ID NO: I (Swiss-Prot编号P10636-8)的残基24-46中tau的3-10个连续残基。在 一些方法中，所述疾病是神经疾病。
[0032] 本发明还提供了抑制tau缠结形成的方法。一些方法包括向患有与tau缠结形成 相关的疾病或处于患有与tau缠结形成相关的疾病风险的患者施用有效方案的抗体或诱 导所述抗体的试剂，所述抗体与SEQ ID NO: USwiss-Prot编号P10636-8)的残基24-46内 的表位特异性结合。优选地，所述抗体是本文所述的抗体（例如，a人源化的16B5抗体）。 在一些方法中，所述诱导所述抗体的试剂是tau的片段，其包括SEQ ID NO: I (Swiss-Prot 编号P10636-8)的残基24-46中tau的3-10个连续残基。在一些方法中，所述疾病是神经 疾病。
[0033] 本发明还提供筛选抗阿尔茨海默病活性剂的方法。一些方法包括将所述试剂施用 于表达tau转基因的转基因动物，并测定所述试剂是否抑制或延迟阿尔茨海默病的至少一 个体征或症状，其中所述试剂是与SEQ ID NO: USwiss-Prot编号P10636-8)的残基24-46 内的表位特异性结合的抗体，或诱导所述抗体的试剂。
[0034] 附图简述
[0035] 图1描述了设计用于对16B5单克隆抗体结合的表位作图的实验结果。含有全长 Tau或Tau缺失突变体（A5-24或A25-44)的Western印迹用16B5抗体（左图）或Tau46 抗体（右图）染色。Tau46抗体与Tau的C-末端表位结合。
[0036] 图2描述了设计用于对16B5单克隆抗体结合的表位作图的实验结果。含有全长 Tau或Tau缺失突变体的Western印迹用16B5抗体（左上图）或Tau46抗体（右图）染 色。左下图示出了用16B5抗体染色的印迹曝光更长。该实验中分析的Tau缺失突变体包 括A25-44、A5-24、A23-32、A30-39 和A37-46。
[0037]图3描述了设计用于对16B5单克隆抗体结合的表位作图的丙氨酸扫描实验结 果。含有野生型Tau(WT)或Tau的丙氨酸点突变体的Western印迹用16B5抗体（左图） 或Tau46抗体（右图）染色。该实验中分析的Tau的丙氨酸突变体包括T30A、M31A、H32A、 Q33A、D34A、Q35A、E36A、G37A、D38A、T39A、D40A、A41L和G42A。
[0038] 图4示出了在表达人tau.P301L蛋白的转基因小鼠脑干的肌氨酰不溶物中检测的 tau蛋白相对量。所述小鼠用16B5抗体或6F10抗体被动免疫，非免疫IgGl同种型对照。 通过Western印迹、抗体染色及所获信号的定量分析样品。用于检测tau的抗体包括抗磷 酸化-tau特异性抗体（AT8,左上图；AT100,左下图；或1F5,右上图）和泛tau抗体（HT7， 右下图）。
[0039] 图5示出了磷酸化-tau和总tau蛋白的比例（左图）及在表达人tau.P301L蛋 白的转基因小鼠总脑干匀浆中检测的标准化的总tau量（右图）。所述小鼠用16B5抗体 或6F10抗体被动免疫，非免疫IgGl同种型对照。通过Western印迹、抗体染色及所获信号 的定量分析样品。使用AT8抗体检测磷酸化-tau且用HT7抗体检测总tau。使用抗GAPDH 抗体来标准化在用16B5抗体和对照6F10抗体治疗的小鼠中检测到的tau量。
[0040] 图6描述了表达人tau.P301L蛋白的转基因小鼠小脑核的切片，使用AT8抗-磷 酸化-tau抗体免疫组织化学染色。所述小鼠用16B5抗体（左上图）或6F10抗体（左下 图）被动免疫，非免疫IgGl同种型对照。上面的条形图示出了 16B5或6F10抗体被动免疫 的小鼠的小脑间位核、小脑前部和后部、附带小脑外侧核（IntA/P/LAT)及丘脑底核附带未 定带区（STH/ZI)内用AT8抗体检测的tau染色数量的定量分析。下面的条形图示出了使 用AT100抗-磷酸化-tau抗体对16B5或6F10抗体被动免疫的小鼠的IntA/P/LAT和STH/ ZI部分检测的磷酸化-tau染色数量的定量分析。使用Student's测试评估统计学显著性， p<0. 05〇
[0041] 图7描述了用嵌合的16B5抗体和人源化的16B5抗体（H1L2和H1L3版）获得的 tau免疫沉淀结果。Tau由阿尔茨海默病患者的额叶皮层样本的可溶性和不溶性部分免疫 沉淀。使用多克隆抗-tau抗体（taupAb)检测印迹的免疫沉淀物中存在的tau。
[0042] 定义
[0043] 通常以分离的形式提供单克隆抗体和其它治疗剂。这意味着所述药剂通常是至少 50%w/w纯度的由其生产或纯化过程产生的干扰蛋白及其它污染物，但不排除所述药剂与 过量的药学上可接受的载体或旨在促进其应用的其它载体结合的可能性。有时单克隆抗体 (或其它治疗剂）是至少60 %、70 %、80 %、90 %、95 %或99 %w/w纯度的由其生产或纯化过 程产生的干扰蛋白及其它污染物。
[0044] 本发明的抗体通常以至少106、107、10 8、109或101°111的结合常数与其指定的靶标 结合。此类结合是特异性结合，其数量级可检测地更高，且明显区别于与至少一个不相关靶 标的非特异性结合。特异性结合可以是特定功能性基团或特定空间适配（例如，锁匙型）之 间的键形成结果，然而非特异性结合通常是范德华力（vanderWaalsforce)的结果。然 而特异性结合并不一定意味着一个单克隆抗体只结合一个且仅一个靶标。
[0045] 基本的抗体结构单元是亚基的四聚体。每个四聚体包括两对相同的多肽链，每对 具有一条"轻"链（大约25kDa)和一条"重"链（大约50_70kDa)。每条链的氨基端部分包 括大约100至110个或更多氨基酸的可变区，其主要负责抗原识别。该可变区最初表达连 接到可裂解信号肽。无信号肽的可变区有时是指成熟的可变区。因此，例如，轻链成熟的可 变区是指无轻链信号肽的轻链可变区。每条链的羧基端部分界定了恒定区，其主要负责效 应功能。恒定区可包括CHl区、铰链区、CH2区和CH3区中的任一个或全部。
[0046] 轻链分为K或A。重链分为y，y，a，5或e，且分别定义抗体同种型为IgG、 IgM、IgA、IgD和IgE。在轻链和重链中，可变区与恒定区通过大约12个或更多个氨基酸的 〃J〃区相连接，重链还包括大约10个或更多个氨基酸的"D〃区（一般参见，Fundamental Immunology(Paul,W.，编，第二版，RavenPress,N.Y.，1989)，Ch. 7)(通过引用的方式整体 并入本文用于所有目的）。
[0047]各轻链/重链对的成熟的可变区形成抗体结合位点。因此，完整的抗体具有两 个结合位点。除了在双功能或双特异性抗体中，两个结合位点是相同的。所有链都示出 了相同的相对保守框架区（FR)的一般结构，其被三个高变区连接，也称为互补决定区或 CDR。每对双链的CDR通过框架区对齐，使其与特异性表位结合。从N-末端到C-末端， 轻链和重链都包括FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。各个域的氨基酸排列根据 Kabat，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest(NationalInstitutesof Health，Bethesda，MD，1987 和 1991)或Chothia&Lesk，J.Mol.Biol. 196:901-917 (1987); Chothia等，Nature342:878-883(1989)定义。Kabat还提供了广泛使用的编号惯例（Kabat 编号），其中不同重链之间或不同轻链之间的相应残基被指定相同编号。
[0048] 术语"抗体"包括完整的抗体及其结合片段。通常，片段与其来源的完整的抗体 竞争以特异性结合靶标。片段包括独立的重链、轻链Fab、Fab'、F(ab'）2、F(ab)c、Fv和单 域抗体。单（可变）域抗体包括在常规抗体中由其VL配偶体分离的VH区（或反之亦然） (Ward等，1989,Nature341:544-546)及来自如骆驼科（Camelidae)或软骨鱼类（例如，护 士鲨）物种的VH区（有时称作VHH)，其中VH区与VL区不相关（参见，例如，W09404678)。 其中一条链是由其天然配偶体分离的单域抗体有时被称为Dabs且来自骆驼科或软骨鱼类 的单域抗体有时被称为纳米体。在