改进的人类疱疹病毒免疫疗法

改进的人类疱疹病毒免疫疗法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及人类疱瘆病毒免疫疗法。具体地，本发明涉及重组蛋白，其包括源自多 种人巨细胞病毒（CMV)或爱泼斯坦-巴尔（Epstein-Barr)病毒（EBV)抗原的多个细胞毒 性T细胞表位，其中当在免疫治疗中使用时能够引发细胞毒性T淋巴细胞免疫应答，而不仅 限于此。
【背景技术】
[0002] 爱泼斯坦-巴尔病毒以极高的发病率存在，超过90%的成年人显示出一定的暴露 迹象。EBV还作为一种终身潜伏感染持续存在以及可以是无症状的。然而，EBV可导致单核 细胞增多症，也被称为腺热，其在一些个体中导致显著的发病率。EBV可与若干自身免疫疾 病相关，如狼疮、类风湿关节炎和多发性硬化症。重要的是，已知EBV与许多癌症有关，如鼻 咽癌（NPC)、伯基特淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤。NPC是常见于中国和东南亚人群的癌症（在大 多数其它人群中罕见）。因为在早期阶段的症状难以识别，所以患者常呈现中级（第三期） 或晚期（IV期）疾病。诊断为鼻咽癌的患者首选是放疗和化疗，很有限地选择手术。放/ 化疗对大多数患者有效，但是大约20%的人或者有不良应答或者复发，此组具有不良预后。 呈现III和IV期肿瘤的患者仅具有50至60% (低于单独IV期患者）的5年总生存率。NPC 最常见的形式是与EBV相关联，这使得这些肿瘤易于通过靶向并杀死EBV感染的肿瘤细胞 进行免疫治疗。
[0003] 在健康个体中的原发性CMV -般无症状、建立偶有再活化并从粘膜表面脱落的潜 伏状态。在某些情况下，原发性CMV感染伴随有单核细胞增多症样疾病的临床症状，类似于 Epstein-Barr病毒所引起的症状。在两个重要的临床情况中CMV引起显著的发病率和死亡 率。这些临床情况包括先天性原发性感染以及在免疫抑制成人中病毒的原发或再活化。在 先天性情况中，CMV是儿童智力迟缓和其它异常如耳聋的主要原因，这种影响通过医学研宄 所将其分类为I级候选疫苗而得以重视[即，最有利影响-既节省了资金又挽救了质量调 整生命年（QALY)] ((Arvin，Fast等人，2004)。在免疫功能低下个体如艾滋病毒感染个体 中的CMV相关并发症常见于⑶4+ T细胞计数低于50/ μ 1的患者中（(Palella，Delaney等 人，1998 ;Salmon-Ceron，Mazeron等人，2000)。此外，在移植患者中，包括实体器官移植和 异基因造血干细胞移植接受者，CMV的影响是公认的。
[0004] 初次暴露至CMV导致强烈的初级免疫应答，其保持为长期记忆应答以便在再活化 后用来限制病毒复制。现在有可靠证据表明体液免疫和细胞免疫应答在控制CMV感染中 起到至关重要的作用。在鼠 CMV模型中进行的研宄提供T细胞免疫重要性上的初始证据， 其中的T细胞功能丧失与增加的病毒感染再活化和传播是一致的（Reddehase, Weiland等 人，1985 ;Mutter，Reddehase等人，1988)。此外，病毒特异性T细胞免疫重建与从急性病毒 感染恢复是一致的。在不同临床环境下人类随访研宄中进一步强调病毒特异性T细胞的作 用。这些研宄表明，抗病毒T细胞免疫不足的异源干细胞移植患者表现出患CMV相关并发症 的风险增加。对细胞免疫在控制CMV疾病中作用的可信服证据来自这种研宄，其中在异源 干细胞移植患者中供体来源CMV特异性CD8+T细胞的过继转移不仅恢复抗原特异性细胞免 疫而且也预防CMV相关的临床并发症（Riddell, Watanabe等人，1992 ;Walter, Greenberg 等人，1995).。
[0005] 鉴于这些研宄，多种CMV疫苗已经在临床前和临床试验中进行评估。
[0006] 这些CMV疫苗策略已经评估了糖蛋白B(gB)、pp65和IE-I作为潜在的靶，并通 过多个递送平台将其递送，这些递送平台包括减毒CMV Towne株（Jacobson, Sinclair等 人，2006)，编码全长抗原和表位的重组病毒载体（Bernstein, Reap等人，2009 ;Zhong and Khanna 2009)、DNA(Wloch, Smith 等人，2008)、致密体（Frankenberg, Pepperl-Klindworth 等人，2002)、和亚基（Drulak，Malinoski等人，2000)疫苗。然而，这些方法没有显示出令 人信服的临床疗效，因而并没有进入临床实践。
[0007] 典型地，已经提出，为了引发保护性的、CD8+细胞毒性的T细胞应答，病毒抗原必须 以核酸形式（例如，使用病毒载体递送系统）而不是以外源递送蛋白形式进行递送，以使得 表达蛋白质被正确处理并提呈至T细胞（Koup&Douek, 2012)。这些疫苗递送平台中的大多 数，特别是减毒活疫苗以及基于病毒载体的疫苗，已经提出了一些监管问题，如觉察到的长 期理论健康风险（Liu ;Soderberg_Naucler2006 ;Anderson 和 Schneider 2007) 〇

【发明内容】

[0008] 本发明解决对使用安全递送技术的疱瘆病毒免疫疗法开发的需要。本发明涉及降 低发育中胎儿和免疫损伤个体（例如固体器官和造血干细胞移植接受者和晚期HIV疾病感 染者）的CMV相关损伤的风险。本发明还涉及治疗如在免疫受损移植患者中、或在预防或 治疗EBV相关癌症如鼻咽癌（NPC)中存在的EBV感染的症状。
[0009] 本发明意想不到地发现，与过去的假设相反，施用给个体的外源多表位蛋白可引 发保护性、CD8+细胞毒性T细胞应答。
[0010] 因此，本发明广义地涉及分离的多表位蛋白，其包括能够引发细胞毒性T细胞应 答的多个人类疱瘆病毒细胞毒性T细胞（CTL)表位。
[0011] 在第一个方面，分离的蛋白包括来自两个或更多不同疱瘆病毒抗原的多个CTL表 位的每个各自的氨基酸序列，所述分离的蛋白还包括在至少两个所述CTL表位之间的干扰 氨基酸或氨基酸序列，所述氨基酸或氨基酸序列包含蛋白酶体释放氨基酸或氨基酸序列， 以及任选地，与抗原处理相关的转运子（transporter) (TAP)识别基序，其中所述分离的蛋 白作为外源蛋白施用给动物时能够引发细胞毒性T淋巴细胞免疫应答。
[0012] 适当地，分离的蛋白包含选择表位以提供人类群体的广泛覆盖。这些包括HLA I 类特异性^^41、42、43、411、423、424、426、429、430、-87、-88、-827、-835、-838、-B40、-B41、-B44、-B51、-B57 和-B58。
[0013] 合适地，所述多个表位包括总计少于二十个（20)表位。
[0014] 在一个实施方案中，所述疱瘆病毒是CMV。优选地，CTL表位来自选自：PP50、pp65、 ppl50 和 IE-I 的 CMV 抗原。
[0015] 在优选的实施方案中，所述分离的蛋白包括选自表1(SEQ ID NO: 1-21)的多个CTL 表位。在具体的实施方案中，所述分离的蛋白包括选自表2 (SEQ ID NO:1-13)的多个CTL 表位。
[0016] 在优选的实施方案中，至少一个CTL表位包括氨基酸序列VTEHDTLLY(SEQ ID NO : 11) 〇
[0017] 在另一个实施方案中，所述疱瘆病毒是EBV。
[0018] 优选地，将 CTL 表位来自选自：BMLF1、LMP2A、BRLF1、LMP2、EBNA3A、BZLF1、EBNA3C、 EBNAl 和 EBNA3B 的 EBV 抗原。
[0019] 在一个优选的实施方案中，所述分离的蛋白包括选自表3(SEQ ID N0:22-41)的多 个CTL表位。
[0020] 还应当理解的是，分离的蛋白可以包含来自相同或不同疱瘆病毒（如CMV和/或 EBV)的CTL表位。
[0021] 所述分离的蛋白可进一步包括干扰氨基酸或氨基酸序列。
[0022] 在一个优选的实施方案中，干扰氨基酸或氨基酸序列是蛋白酶体释放氨基酸或氨 基酸序列。
[0023] 在一个可选的实施方案中，干扰氨基酸或氨基酸序列是与抗原处理相关的转运子 (TAP)识别基序。
[0024] 在第二方面，本发明提供了分离的核酸，其编码第一方面的分离的蛋白。
[0025] 在第三方面，本发明提供包含所述第二方面的分离核酸的遗传构建体。
[0026] 优选地，所述遗传构建体是表达构建体，其中所述第二方面的分离的核酸可操作 地连接于存在于表达载体中的一个或多个调节序列。
[0027] 在一个实施方案中，表达构建体包括表达载体，其适于在体外生产分离的蛋白以 作为重组蛋白用于随后的纯化。
[0028] 在第四方面，本发明提供了宿主细胞，其包含第三方面的表达构建体。
[0029] 在另一个实施方案中，所述宿主细胞已被转染、转化或以其它方式体外引入表达 构建体，用于第一方面分离蛋白质的随后纯化目的。
[0030] 在第五方面，本发明提供了生产第一方面的分离蛋白质的方法，所述方法包括在 第四方面的宿主细胞中表达所述分离蛋白的步骤，并在保持所述分离的蛋白在基本上非聚 集形式的条件下至少部分地纯化所述分离的蛋白。
[0031] 在第六方面，本发明提供根据第五方面的方法产生的分离的蛋白。
[0032] 在第七方面，本发明提供了药物组合物，其包含所述第一或第六方面的分离的蛋 白或第三方面的遗传构建体，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
[0033] 优选地，药物组合物是适用于与动物中CMV和/或EBV感染相关的疾病或病症的 预防或治疗处理的免疫原性组合物。
[0034] 更优选地，免疫治疗组合物是引发针对CMV和/或EBV保护性免疫应答的疫苗。在 这方面，应该理解的是，药物组合物可包括分别包含CMV和EBV的CTL表位的单独的分离蛋 白，或可包括包含EBV和CMV表位两者的单一分离蛋白。
[0035] 在一个具体实施方案中，药物组合物还包含一种或多种免疫刺激分子或佐剂。
[0036] 适当地，免疫刺激分子或佐剂包含一种或多种toll样受体（TLR)激动剂。
[0037] 优选地，所述TLR激动剂包括TLR4激动剂和/或TLR9激动剂。
[0038] 优选的佐剂包括单磷酰脂质（MPL)和/或免疫刺激DNA，如CpG 0DN1826、CpG 0DN2006、CpG 0DN2216 和 / 或 CpG 0DN2336,而不局限于此。
[0039] 在第八方面，本发明提供预防或治疗性处理动物中疱瘆病毒感染的方法，包括向 动物施用第一或第六方面的分离蛋白，或第七方面的药物组合物的步骤，从而预防性或治 疗性处理动物中疱瘆病毒感染。
[0040] 在具体实施方案中，所述疱瘆病毒是CMV或EBV。
[0041] 在第九方面，本发明提供在动物中诱导细胞毒性T淋巴细胞（CTL)免疫应答的方 法，包括向所述动物施用第一或第六方面的分离蛋白、或第七方面的药物组合物的步骤，从 而在所述动物中诱导或引发细胞毒性T淋巴细胞（CTL)免疫应答。
[0042] 在第十方面，本发明提供扩大用于过继免疫治疗的疱瘆病毒特异性CTL的方法， 所述方法包括以下步骤：
[0043] ( i )使分离自动物的一种或多种细胞与第一或第六方面的分离蛋白相接触；以 及
[0044] ( ii )培养所述一种或多种细胞从而从所述一种或多种细胞扩大疱瘆病毒特异性 CTL0
[0045] 在具体实施方案中，所述疱瘆病毒是CMV或EBV。
[0046] 在第十一方面，本发明提供过继免疫治疗的方法，包括向动物施用所述第十方面 的步骤（ii)产生的所述疱瘆病毒特异性的CTL的步骤，从而预防性或治疗性处理所述动物 的疱瘆病毒感染。
[0047] 在具体实施方案中，所述的疱瘆病毒是CMV或EBV。
[0048] 在第十二方面，本发明提供的第一或第六方面的分离的蛋白，或第三方面的遗传 构建体用于预防性或治疗性处理动物中的疱瘆病毒感染。
[0049] 在具体实施方案中，所述疱瘆病毒是CMV或EBV。
[0050] 优选地，根据上述方面，所述动物是哺乳动物。
[0051] 更优选地，动物是人。
【附图说明】
[0052] 为了使本发明可以更容易地理解并放入实际效果，通过仅作为示例的方式并参考 附图对本发明的优选实施方式进行说明。
[0053] 图1 :说明CMV多表位的设计和下游处理。作为实例显示CMV多表位20mer编码序 列的设计。各表位的氨基酸序列以粗体显示；在所述表位序列之后的灰色斜体字母代表用 于通过蛋白酶体处理CMV多表位蛋白的氨基酸残基，以及下划线的氨基酸序列代表TAP基 序（称为CMVpoly-PTL)。合成制造编码CMV多表位蛋白的DNA序列，克隆进大肠杆菌诱导 质粒pjexpress 404,并转化到大肠杆菌中进行蛋白表达和纯化。
[0054] 图2 :CMVpoly_PTL蛋白的表达和纯化。pjexpress 404质粒表达包括13、14、15或 20个CMV⑶8+T细胞表位的CMVpoly-PTL蛋白质，将所述质粒转化至大肠杆菌BL21 (DE3) pLysS。用IPTG诱导蛋白表达，并用SDS PAGE在诱导样品之前和之后进行分析。图A和B 示出CMVpoly-PTL蛋白在大肠杆菌中表达：泳道1，分子量标记物（kDa);泳道2、4和6未诱 导的大肠杆菌细胞裂解物；泳道3、5和7诱导的大肠杆菌细胞裂解物。*表示CMVpoly-PTL 蛋白。
[0055] 图 3 :纯化的 CMVpoly-PTL 蛋白的 SDS PAGE 分析。继在 Ni NTA柱纯化 CMVpoly-PTL 之后，通过SDS PAGE分析来自各个纯化阶段的样本。图A、B、C和D代表CMVpoly-PTL蛋白 (13mer、14mer、15mer和20mer)的纯化。对于所有SDS PAGE凝胶，泳道1 :分子量标记物。 泳道2:在上样前溶解的蛋白。3泳道：流过。泳道4:洗涤。泳道5、6、7、8:洗脱级分。*表 示 CMVpoly-PTL 蛋白。
[0056] 图4 :CMVpoly-PTL蛋白质溶解度测试和表征，以确定CMVpoly-PTL存储作为可溶 性蛋白的相容缓冲系统，对纯化蛋白使用在不同PH范围的各种缓冲液组合物进行稀释，孵 育在4°C，0/N，离心，在SDS PAGE上分析上清级分。图A :泳道1 :分子量标记物。泳道2 : 用pH 5. 6的25mM 2-(N-吗啉代）乙磺酸（MES)缓冲液稀释。泳道3 :用pH 3. 2的25mM MES缓冲液稀释。泳道4 :用pH 4. 5的25mM MES稀释。泳道5 :用pH为4. 5的25mM MES 和400mM L-精氨酸稀释。泳道6 :用pH 4. 3的IOmM Tris和IOOmM NaH2PO4稀释。泳道7 : 用 pH 值 4. 3 的 IOmM Tris、100mM NaH2P04、400mM L-精氨酸稀释。泳道 8 :用 ρΗ7· 4 的 PBS、 50mM L-精氨酸和50mM L-谷氨酸稀释。泳道9 :加水稀释。泳道10 :用pH为2的IOOmM 甘氨酸缓冲液进行稀释。图B、C&D显示CMVpoly-PTL蛋白质纯度分析。继CMVpoly-PTL多 表位蛋白（13mer，14mer和15mer)在pH 5. 6的MES缓冲液中透析之后，不同浓度的每种蛋 白在SDS PAGE上进行分析以观察最终纯度和降解产物。
[0057] 图5 :在使用CMVpoly-PTL蛋白刺激来自CMV血清阳性供体的PBMC之后，扩大CMV 特异性T细胞：使用重组CMVpoly-PTL蛋白（13、14和15mer)离体刺激来自各种健康CMV 血清阳性供体的PBMC，以及存在重组IL 2时培养10天。用在ICS分析确定扩大的产生 IFN- γ的肽特异性⑶8+T细胞百分比，并且使用FlowJo对结果进行分析。图A显示使用或 不使用CMVpoly-PTL蛋白刺激PBMC之后，体外扩大的CMV特异性⑶8+T细胞的代表性FACS 曲线。图B&C显示使用CMVpoly-PTL蛋白（13、14和15mer)刺激之后，来自不同个体的扩 大的CMV特异性CD8+T细胞的整体分析。
[0058] 图6 :使用CMV多表位蛋白刺激之后扩大的CMV特异性⑶8+T细胞的维度和质量： 使用CMVpoly-PTL蛋白（13mer)刺激PBMC之后，将细胞进行分析以通过多参数流式细胞仪 评估效应子功能。在FIowJo上分析证明细胞溶解功能（CD107a脱粒标记物）和细胞内细 胞因子产生（IFNy、TNF和MIPl β )的⑶8+ T细胞的频率，使用的SPICE程序绘制多功能 细胞因子生产。在饼图中的数据表示各个表位，以及饼图的每片代表功能的每个可能组合。
[0059] 图7 :具有和没有接头的CMV多表位蛋白构建体的设计方案和蛋白质纯化：图A显 示没有接头的CMV多表位蛋白（SEQ ID NO :46)(简称CMVpoly)的设计。图B显示具有蛋白 酶体接头的多表位蛋白（SEQ ID NO :47)(简称CMVpoly-PL)的设计。每个可选择的CD8+T 细胞的表位序列以斜体和下划线表示。对于CMVpoly-PL，每个表位序列由是蛋白酶体降解 靶标的氨基酸残基（以红色显示）分离。编码CMV多表位蛋白的DNA序列质克隆到IPTG 诱导质粒pjexpress404,并转化到大肠杆菌中用于蛋白质表达。使用Ni-NTA亲和层析纯化 多表位蛋白。
[0060] 图8 :体外评估具有和不具有接头的CMV多表位蛋白的处理和提呈：图A显不了通 过人类细胞的CMVpoly、CMVpoly-PL和CMVpoly-PTL蛋白的体外交叉提呈。使用CMVpoly、 CMVpoly-PL或CMVpoly-PTL蛋白（各25 μ g)脉冲刺激EBV转化的LCL两小时，洗涤，过 夜孵育，然后暴露于CMV特异性CD8+T细胞，所述CMV特异性CD8+T细胞对HLA A2限制性 的 NLV(pp65)、HLA Al 限制性的 VTE(pp50)、HLA B8 限制性的 ELR(IEl)、HLA B7 限制性的 RPH(pp65)和 HLA B7 限制性的 TPR(pp65)表位特异。FACS 曲线显示与 CMVpoly、CMVpolyPL 或CMVpoly-PTL蛋白脉冲刺激的LCL共同培养后CMV特异性⑶8+T细胞产生的IFN-γ表 达。图B显示了与CMVpoly (空条）、CMVpolyPL(黑色条）或CMVpoly-PTL(灰色条）脉冲 刺激的LCL共培养之后产生IFN- γ的CMV表位特异性⑶8+Τ细胞的平均值土 SEM。误差代 表土SEM，林或林*表示统计学显著的（Ρ〈0·001或Ρ〈0·0001)，双尾学生t检验来计算。
[0061] 图9 :通过人类细胞的CMV多表位蛋白的交叉提呈的分析：为了鉴定肽转运子 (TAP-1和TAP-2)在CMV多表位蛋白的交叉提呈中所起的作用，使用CMV-PTL蛋白脉冲刺激 TAP1&2+细胞（CEM. Tl)和TAP1&2细胞（CEM. T2或CEM. T2HLA B7)两小时，洗涤，过夜孵育， 并暴露于HLA A2限制性的NLV(pp65)或HLA B7限制性的TPR(pp65)表位特异性的CD8+T 细胞。图A显示使用CMV多表位蛋白预致敏的CEM. Tl细胞暴露之后，NLV特异性T细胞产 生的IFNy表达。图B&C显示在分别暴露至CMV多表位蛋白致敏的CEM. T2和CEM. T2HLA B7细胞之后，表达IFNy的NLV和TPR特异性⑶8+T细胞的百分比。在图A、B&C所示的数 据是来自两个独立实验的一个代表性实验。
[0062] 图10 :不同的化学抑制剂对处理和提呈多表位蛋白的效果：CEM. Tl和CEM. T2细 胞或者未经处理或者用抑制剂预处理后，所述抑制剂针对自噬（3-MA)、溶酶体/内含体（氯 喹或巴弗洛霉素 A 1)、再循环途经（伯氨喹）、半胱氨酸蛋白酶（亮肽素或E64)或酸性蛋 白酶（胃酶抑素 A)(图A)、蛋白酶体抑制剂、乳胞素、环氧酶素和MG132(图B)和ER驻留 氨肽酶抑制剂（硫醇亮氨酸+DTT)，或其对照（单独DDT)或高尔基体抑制剂（布雷菲德菌 素 A或莫能菌素）（图C)，用CMV-PTL蛋白孵育。洗涤细胞，在各种抑制剂存在下孵育十二 个小时，然后暴露在HLA A2限制性NLV (pp65)特异性CD8+T细胞中，然后由ICS分析评估 IFN- γ表达。每个呈现数据表示在暴露于CMV-PTL致敏的CEM. Tl (空条；称作Tl)和CEM. T2(黑色条；称为T2)细胞之后由抗原特异性T细胞产生的相对IFN-Y表达。数据表示一 式三份进行的两独立实验的平均值。误差棒代表土SEM。*或**表示统计学显著的（Ρ〈0. 05 或ρ〈0. 01)，通过双尾学生t检验来计算。
[0063] 图11 :Sec61和ATG12shRNA在多表位蛋白交叉提呈中的作用：使用编码用于 Sec610亚基或ATG12的shRNA的重组慢病毒或对照载体（pLKO)来转导（transduce) CEM Tl和CEM T2细胞，在R 10介质中培养两天，在嘌呤霉素选择七天，然后用作抗原提呈细 胞。图A&D显示在shRNA转导之后，在CEM. Tl和CEM. T2细胞中Sec61和ATG12蛋白表达 的Western印迹分析。GAPDH用作蛋白上样对照。图B-F表示，在暴露至CMVpoly-PTL致敏 的Sec61 β和ATG12shRNA慢病毒或对照载体转导的CEM. Tl和CEM. T2细胞之后，通过CMV 特异性⑶8+T细胞产生的IFN-γ表达。
[0064] 图12 :体内评估CMVpoly、CMVpoly-PL及CMVpoly-PTL蛋白的免疫原性：为了评 估CMVpoly、CMVpoly-PL或CMVpoly-PTL蛋白的免疫原性，20 yg蛋白与25 yg MPL (单磷 酰脂质A)和50 μ g CpG 0DN1826配制在每剂量100 μ L体积中。在第0天，对6-8周龄的 HLA Α2转基因小鼠进行皮下免疫，以及在第21天使用相同制剂给予加强剂量。在第35天处 死小鼠，使用HLA Α2限制性NLV (ρρ