列通常与用于表达的宿主细胞相适应。本领域已知多种类型的合适 的表达载体和合适的调控序列用于多种宿主细胞。
[0150] 典型地，所述一个或多个调控核苷酸序列可以包括但不限于，启动子序列，前导或 信号序列、核糖体结合位点、转录起始和终止序列、翻译起始和终止序列、和沉默子、增强子 或激活序列。
[0151] 对于启动子，组成型启动子（如CMV、SV40、牛痘、HTLVl和人延伸因子启动子）和 诱导型/阻遏启动子（如tet-阻遏启动子和IPTG-，金属硫蛋白（metalIothionin)-或蜕 皮激素诱导启动子）是在本领域众所周知的并且本发明所考虑的。还应当理解的是，启动 子可以是杂合的启动子，其结合一个以上的启动子元件，例如但不限于SRa启动子，其是 HTLVl元件和SV40启动子的杂合体。
[0152] 优选地，所述表达构建体还包括一个或多个适于选择转化的细菌目的的选择性标 记（如bla、kanR和tetR)或选择转化的哺乳动物细胞目的的选择性标记（如潮霉素，G418 和嘌呤霉素）。
[0153] 表达构建体可以通过一些公知技术中的任一个通过转染、转化或以其它方式引入 到宿主细胞中，所示公知技术包括但不是限于热休克、电穿孔、DEAE葡聚糖转染、显微注射， 脂质体介导的转染、磷酸钙沉淀、原生质体融合、微粒轰击、病毒转化等。
[0154] 合适用于蛋白质表达的条件将根据表达载体和宿主细胞的选择而变化。这很容易 由本领域技术人员通过常规实验确定。
[0155] 用于表达的合适的宿主细胞可以是原核或真核细胞，如细菌细胞包括大肠杆菌 (例如DH5 α )、酵母细胞如毕赤酵母（Pichia pastoris)、在杆病毒表达系统中使用的Sf9 细胞、哺乳动物细胞系，例如人胚胎肾（HEK) 293细胞、CHO细胞、COS细胞、CVl细胞、Jurkat 和NIH3T3细胞，而不局限于此。
[0156] 本发明的另一个方面提供了一种以重组形式生产本文所公开的分离的蛋白的方 法，所述方法包括在如上文所述的宿主细胞中表达分离的蛋白的步骤，以及在保持分离的 蛋白在基本上非聚集形式的条件下至少部分地纯化分离的蛋白。
[0157] 由本文中的"非聚集的"是指该分离蛋白质的主要部分在水溶液中（通常不存在 变性剂如尿素、SDS或鈪氯化物）是可溶形式。
[0158] 因为CTL表位和TAP序列的疏水性，所述分离的蛋白在细菌中的表达往往产生以 包涵体的形式（IB)聚集的蛋白质。虽然IB可以溶解并用亲和基质（如Ni-NTA基质）纯 化重组蛋白，然而包含二十（20)个CMV CTL表位的分离的蛋白对这种处理具有抵抗性。因 此，本发明的优选形式提供了分离的蛋白，其包含少于二十（20)个CMV和/或EBV CTL表 位。考虑到在表1和2中的每个CMV CTL表位包括8-13个氨基酸，少于二十（20)个CMV CTL表位相当于不到160-240个组成的、表位氨基酸。
[0159] 此外，保持可溶形式的纯化的重组蛋白有困难，也是不能将多表位蛋白作为引发 CD8+CTL应答的外源蛋白成功施用的主要因素。如实施例中更详细描述的，保持相容性缓冲 液系统表明所述分离的多表位蛋白需要在酸性pH的MES或甘氨酸缓冲液以保持溶解。
[0160] 因此，本发明的实施方案提供了以重组形式生产本文所公开的分离的蛋白的方 法，所述分离的蛋白具有少于二十（20)个CMV CTL表位或160-240个组成型表位氨基酸， 所述方法包括如上文所述的在细菌宿主细胞中表达所述分离的蛋白的步骤，以及在维持所 述分离的蛋白基本非聚集形式的条件下至少部分地纯化所述分离的蛋白，其中所述条件包 括维持分离的重组蛋白在酸性条件下在MES缓冲液中，或在甘氨酸缓冲液中。
[0161] 酸性条件可以是低于7的任意pH，优选在pH 2-6范围或更优选在约pH 2. 5至约 pH值5. 6的范围中。
[0162] 生产重组蛋白质的一般指导可见于标准操作规程，例如，Sambrook等 人，MOLECULAR CLONING. A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press, 1989)，特别 是第 16 和第 17 章。CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY Ausubel 等人编，（John Wiley&Sons, Inc. NY USA 1995-2001)，特别是第 10 和第 16 章；以及 CURRENT PROTOCOLS IN PROTEIN SCIENCE Eds. Coligan等人，（John Wiley&Sons, Inc. NY USA 1995-2001，特别 是第1、5和6章。
[0163] 在涉及施用至人的表达构建体的实施方案中，本发明的表达构建体适用作DNA疫 苗。
[0164] 在特定的形式中，本发明的表达构建体可以是构建体，其利用病毒来源的表达和 递送载体，如痘病毒和腺病毒或DNA质粒载体。
[0165] 当作为疫苗递送系统时，病毒来源的表达构建体可以以VLP或作为"裸"核酸构建 体的形式施用至动物。
[0166] 在一个具体的实施方案中，根据本实施方案的表达构建体包括牛痘病毒启动子， 如存在于质粒载体上的p7. 5启动子。例如，如Khanna等人，1992. J Exp Med. 176169所提 供的，使用标记救援重组生产TK-重组牛痘病毒。
[0167] 在更优选的实施方案中，本发明提供了用于在疫苗递送系统中使用的基于腺病毒 的表达构建体。基于腺病毒的构建体能够感染广谱性的哺乳动物和人类细胞，包括静态和 增殖细胞类型。
[0168] 这种基于腺病毒的表达构建体可以包括组成型或诱导/阻遏启动子，例如通过四 环素诱导型/阻遏系统的方式。
[0169] 基于腺病毒表达构建体的一种形式是从至少缺乏El基因的复制能力不足的A5腺 病毒衍生的。
[0170] 特别形式是Ad5/F35基于腺病毒的表达构建体，下面详细提供疫苗递送系统。还 参考到Yotdna等人，2001，Gene Therapy 8 930,涉及腺病毒表达载体的Ad5/F35实施方 案。
[0171] 应当理解，本发明的分离的蛋白、编码其的分离的核酸和表达构建体可用于治疗 性和/或预防性处理疱瘆病毒相关疾病或病症，如动物中，优选人中的巨细胞病毒相关或 爱泼斯坦-巴尔相关疾病和/或病症。
[0172] 在人类中，CMV感染可引起伴有长期发热的单核细胞增多症样综合征，和/或温 和肝炎。在某些高危人群中疾病可能会更严重，如在妊娠中胎儿的感染期间，与儿童一起 工作的人中，以及在免疫功能低下者，如老年人、器官移植接受者和感染人类免疫缺陷病毒 (HIV)的人中。CMV也可以与一些癌症如神经胶质瘤相关联。因此，本发明提供药物组合物 和/或预防或治疗CMV感染的方法，优选在人类中。
[0173] EBV感染可引起严重的单核细胞增多症，并且还与多种癌症和可能的自身免疫性 疾病相关联。因此，本发明提供药物组合物和/或预防或治疗CMV感染的方法，优选在人类。
[0174] 这样的药物组合物和方法适用于递送重组形式的分离的蛋白，或通过表达构建体 如病毒递送载体编码的分离的蛋白。在这方面，应该理解的是，药物组合物可包含单独的分 离蛋白，其分别包含CMV和EBV CTL表位，或可包含单一的分离蛋白，其包含EBV和CMV表 位两者。
[0175] 合适地，药物组合物还包含药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
[0176] "药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂"指的是可以被安全地用于全身施用的固 体或液体填充剂、稀释剂或包封物质。取决于具体的施用途径，可以使用在本领域中公知的 各种载体。这些载体可选自糖、淀粉、纤维素及其衍生物、麦芽、明胶、滑石、硫酸钙、植物油、 合成油、多元醇、藻酸、磷酸盐缓冲溶液、乳化剂、等渗盐水和盐（例如，包括盐酸盐、溴化物 和硫酸盐的无机酸盐，和如醋酸盐、丙酸盐和丙二酸盐的有机酸）、和无致热原的水。
[0177] 描述药学上可接受的载体、稀释剂和赋形剂的一个有用参考是Remington' s Pharmaceutical Sciences(Mack Publishing Co. NJ USA, 1991)，其以引用并入本文。
[0178] 可以采用任何安全的施用途径用于向患者提供本发明的组合物。例如，可采用口 月艮、直肠、肠胃外、舌下、口腔、静脉内、关节内、肌内、真皮内、皮下、吸入、眼内、腹膜内、脑室 内、经皮施用等。
[0179] 剂型包括片剂、分散剂、混悬剂、注射剂、溶液、糖浆剂、锭剂、胶囊剂、栓剂、气雾 剂、经皮贴剂等。这些剂型也可包括专门为此目的而设计的注射或植入控制释放装置，或经 改造而用于以这种方式发挥额外作用的植入物的其它形式。治疗剂的控制释放，可以通过 用疏水性聚合物包被该药剂而起作用，疏水性聚合物包括丙烯酸树脂、蜡、高级脂肪醇、聚 乳酸和聚乙醇酸、以及某些纤维素衍生物如羟丙基甲基纤维素。此外，控制释放可通过使用 其它聚合物基质、脂质体和/或微球而起作用。
[0180] 优选的药物组合物是"免疫原性组合物"，其引发CT:应答，从而提供对这种免疫 治疗应答的疱瘆病毒（例如，CMV和/或EBV)的预防和/或治疗，而不一定引发保护性免 疫应答。
[0181] 在一个优选形式中，所述免疫原性组合物可以是疫苗，其用于在人类受试者引发 保护性的基于CD8+CTL的免疫应答以保护免受CMV感染，或治疗出现的疱瘆病毒（例如，CMV 和/或EBV)感染。
[0182] 在一个具体实施方案中，包括免疫原性组合物和疫苗的药物组合物，包含本文所 公开的分离的蛋白和所述药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
[0183] 如将在实施例中更详细地描述，包括多个CMV和/或EBV CTL表位的分离的蛋白 在病毒健康携带者中高效产生CMV特异性的CD8+T细胞应答。此外，在使用蛋白刺激后，扩 大的⑶8+T细胞显示出IFN-γ、TNF、MIP-1 β和⑶107a的强表达。建议的是，⑶8+T细胞的 这些功能特征对于预测CTL-介导的免疫应答和病毒清除的功效是重要的。
[0184] 可选择的实施方案提供一种药物组合物，包括免疫原性组合物和疫苗，所述药物 组合物包含编码本文所公开的分离蛋白的核酸表达构建体（包括DNA疫苗）和所述药学上 可接受的载体、稀释剂或赋形剂。根据可选择的实施方案，包括免疫原性组合物和疫苗的药 物组合物可以包含表达构建体，其利用的病毒载体，例如前述的腺病毒载体或痘病毒衍生 载体。
[0185] 任何适宜的方法可考虑用于生产这种疫苗。示例性方法包括，例如New Generation Vaccines(1997, Levine 等人，Marcel Dekker, Inc. New York, Basel, Hong Kong)中描述的那些，其通过引用并入本文。
[0186] 药物组合物、免疫原性组合物、疫苗和/或预防性或治疗性处理方法可以包括一 个或多个用于施用至动物的免疫刺激分子或佐剂。
[0187] 合适的免疫刺激分子和佐剂包括但不限于：TLR激动剂、脂多糖及其衍生物如 MPL、弗氏完全或不完全佐剂，十八烷基胺、十八烷基胺、十八烷基氣基酸醋、溶血卵憐脂，> 甲基双十八铵溴化物、N，N-双十八基W双（2-羟乙基丙二胺）、甲氧基十六烷基甘油 醇和聚醚多元醇；多胺，如吡喃、硫酸葡聚糖，聚IC羧乙烯聚合物；肽，如胞壁酰二肽和衍生 物、二甲基甘氨酸，促吞噬肽；油乳剂；和矿物凝胶，如磷酸铝，氢氧化铝或明矾；淋巴因子、 咪喹莫特、Guardiquimod、QuilA和免疫刺激复合物（ISCOMS)。
[0188] 药物组合物、免疫原性组合物、疫苗和/或预防性或治疗性处理方法可以包括一 个或多个其它用于施用给动物的TLR激动剂。优选地，所述一个或多个TLR激动剂包括TLR4 激动剂和/或TLR9激动剂。
[0189] 优选的TLR4激动剂是脂多糖（LPS)或衍生物或LPS的组分。这些包括源自明尼 苏达沙门氏菌（Salmonella minnesota)的单磷酸脂质A(MPlZ')和合成的TLR4激动剂，如 氨基烷基氨基葡萄糖苷磷酸盐（AGP)。优选的TLR4激动剂是MPL。
[0190] TLR9识别特定未甲基化的CpG寡核苷酸（ODN)序列，其从哺乳动物DNA中区分出 微生物DNA。CpG ODN寡核苷酸包含在特定序列环境中未甲基化的CpG二核苷酸（CpG基 序）。这些CpG基序在细菌DNA中比在哺乳动物DNA具有20倍更高的频率。已经描述三种 类型的刺激性ODN :A、B和C型。
[0191] TLR9 激动剂的非限制性实例包括 CpG 0DN1826、CpG 0DN2006、CpG 0DN2216 和 CpG 0DN2336,虽然不局限于此。
[0192] 通常，药物组合物、免疫原性组合物、疫苗和/或预防性或治疗性治疗方法可 以使用任何安全施用途径，可以采用向患者提供本发明的药物组合物。例如，口服、直 肠、肠胃外、舌下、口腔、静脉内、关节内、肌内、真皮内、皮下、吸入、眼内、腹膜内、脑室内、 透皮等也可使用。肌内和皮下注射是适当的，例如，用于施用免疫原性组合物、蛋白质 (proteinacious)疫苗和 DNA 疫苗。
[0193] 对于治疗疱瘆病毒感染的方法，如CMV或EBV感染和/或与其相关的疾病或病症、 或CMV或EBV感染的结果，本发明考虑过继免疫治疗。
[0194] 优选地，虽然不是唯一地，发明考虑使用体外产生的自体CTL的过继免疫治疗。
[0195] 目前的方法很难扩大疱瘆病毒（例如，CMV或EBV)CTL，并且通常基于或者使用CMV 裂解物或个体肽表位。
[0196] 本发明的分离的蛋白通过促进扩大广泛关注的T细胞应答预计比任意现有技术 方法更有利。
[0197] 因此，扩大用于过继免疫治疗的疱瘆病毒特异性CTL的方法，包括以下步骤：
[0198] (a)使分离自动物的一种或多种细胞与本文公开的分离的蛋白相接触；以及
[0199] (b)培养所述一种或多种细胞从而从所述一种或多种细胞扩大疱瘆病毒特异性 CTL0
[0200] 此外，过继免疫治疗的方法包括施用在步骤（b)所产生的所述疱瘆病毒特异性的 CTL给动物的步骤，从而预防性或治疗性处理所述动物的疱瘆病毒感染。
[0201] 优选地，动物是哺乳动物，例如人。
[0202] 在一个实施方案中，本发明提供在人中自体过继免疫治疗的方法，包括以下步 骤：
[0203] (A)使分离自人的一种或多种细胞与本文公开的分离的蛋白相接触；
[0204] (B)培养所述一种或多种细胞从而从所述一种或多种细胞扩大疱瘆病毒特异性 CTL ;以及
[0205] (C)施用所述疱瘆病毒特异性CTL给所述人，从而预防或治疗性处理所述动物的 疱瘆病毒感染。
[0206] 在具体实施方案中，所述疱瘆病毒是CMV或EBV。
[0207] 为了使本发明可以容易地理解并实践，具体的实施方案现在将通过下列非限制性 实施例的方式加以说明。
[0208] 实施例
[0209] 实施例1 :
[0210] CMV多表位蛋白的纯化和免疫原性
[0211] 材料和方法
[0212] CMV多表位载体的构建
[0213] 设^一系列CMV多表位插入体编码来自五个不同抗原（pp65、IE_l、pp50、ppl50和 gB)的多个HLA I类限制性的T细胞表位。这些多表位序列编码13、14、15或20个不同的 HLA I类限制性的CD8+表位（参见表1)。
[0214] 以这种方式设计多表位序列，以使得每个表位序列之前加上蛋白酶体释放的氨基 酸序列（AD或K或R)和TAP识别基序（MI、S·、NIW或NQY)。此外，在每个多表位蛋白 的C末端插入体六组氨酸标签以允许使用镍-次氮基三乙酸（Ni-NTA)柱进行纯化。基于 大肠杆菌的密码子利用率将每个构建体的氨基酸序列翻译成DNA序列，合成地构建所述 插入体（DNA2.0, California，美国），并在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG)诱导启动 子下克隆至表达质粒（pjexpress404)。这些合成设计的多表位构建体被转化到化学感受 态大肠杆菌DH5a (Invitrogen、Carlsbad，CA,美国），然后质粒使用QIAGEN大提试剂盒 (QIAGEN, Hilden,德国）纯化。
[0215] 蛋白表达
[0216] 使用CMV多表位表达载体转化化学感受态大肠杆菌BL21 (DE3) pLysS(Invitrogen, California,美国）。转化的细胞铺在添加100 μ g/mL氨节青霉素 （LB 氨苄）的Luria Bertani(LB)琼脂上，然后将板在37°C孵育过夜。挑取一个分离的菌落，接 种到IOml的LB氨苄培养基中，并在摇床上在37°C和200rpm下过夜生长。少量过夜培养物 接种到50mL的LB氨苄肉汤中生长12小时，然后1 %的培养物转移到2L的LB氨苄肉汤，然 后使其生长直至〇. D在600nm处达到0. 6。通过加入ImM/mL的IPTG来进行CMV多表位蛋 白诱导。允许这些细胞再生长4小时，通过在12-15 %的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电 泳（SDS-PAGE)上分析未诱导和诱导的样品来测定蛋白质表达水平。
[0217] CMV多表位蛋白纯化
[0218] 在诱导阶段结束时，大肠杆菌培养物以10, OOOrpm离心15分钟来收集，将细胞 沉淀再悬浮于补充有蛋白酶抑制剂混合物（Roche, Mannheim,德国）的80mL裂解缓冲液 (25mM Tris pH 7.4、0.5%Triton X100、150mM NaCl、0.5mg/mL 溶菌酶），然后孵育在冰上 30分钟。通过在冰上超声4X5分钟循环进行细胞裂解，每个循环之间有10分钟的休息时 间。将裂解物在13, OOOrpm离心30分钟，使用SDS-PAGE分析上清液和沉淀级分。由于大 多数的蛋白质以包涵体（IB)的形式发现于沉淀级分中，在室温中在搅拌下使用裂解缓冲 液（无溶菌酶）洗涤IB-次达两小时，然后溶解于150mL的增溶缓冲液中（IOOmM NaH2P04、 IOmM Tris、8M尿素 pH 8.0)在4°C下过夜。通过以13, OOOrpm离心30分钟来纯化可溶性 蛋白，上清液用于多表位蛋白的纯化。
[0219] 为了纯化CMV多表位蛋白，我们用5mL的Ni-NTA(QIAGEN，Hilden，德国）金属亲和 层析基质。使用5倍柱体积的蒸馏水来洗涤基质，随后用3倍柱体积的增溶缓冲液来平衡。 可溶性蛋白加样在该柱上，流速调节至ImL/分钟。用10倍柱体积的洗绦缓冲液I(K)OmM NaH 2PO4UOmM Tris、8M 尿素 pH 6. 3)和 20 倍体积的洗涤缓冲液 2(100mM NaH2PO4UOmM Tris、8M尿素 pH 5. 9)洗出未结合的蛋白质和杂质。用洗脱缓冲液（IOOmM NaH2P04、10mM Tris、8M尿素 pH4. 3)洗脱结合的蛋白，然后使用SDS-PAGE分析洗脱的级分。阳性的级分汇 集起来，使用Bradford测定试剂盒（Bio-Rad, Hercules, California,美国）按照生产商的 说明来进行CMV多表位蛋白评估。纯化的蛋白进行溶解性试验（以确定以可溶形式储存蛋 白质的正确的缓冲组合物），其中将80 μ L纯化的蛋白稀释至800 μ L的具有不同pH范围的 各种组合物的缓冲液。这些包括（a)25mM MES缓冲液pH 5. 6 ; (b)25mM MES缓冲液pH 3. 2 ; (c)25mM MES pH 4.5;(d)25mM MES(2-(N-吗啉代）乙磺酸）pH 4.5 和 400mM L-精氨酸； (e) IOmM Tris 和 IOOmM NaH2Po4PH 4· 3 ; (6) IOmM Tris、IOOmM NaH2Po4和 400mM L-精氨酸 pH 4· 3 ; (f)PBS、50mM L-精氨酸和 50mM L-谷氨酸 ρΗ7· 4 ; (g)稀释在水中；（h) IOOmM pH 2 的甘氨酸缓冲液。将这些样品孵育在4°C下过夜，以13, OOOrpm离心25分钟，使用SDS-PAGE 对上清液级分进行分析。CMV多表位蛋白使用25mM MES缓冲液在pH 5. 6进行透析。使用 Ultracel-IOK离心柱（(Millipore, County Cork,爱尔兰）来随后采用0.22 μ膜过滤器通 过无菌过滤浓缩CMV多表位蛋白，用BIO-RAD Bradford蛋白分析试剂盒来估算总蛋白，以 及使用SDS-PAGE来分析各种CMV多表位蛋白的浓度以确定多表位蛋白的最终纯度。将纯 化的蛋白质以Iml等分储存在-70°C中。
[0220] 使用多表位蛋白体外刺激和扩大来自健康供体的CMV特异性的T细胞
[0221] 来自健康的病毒携带者的外周血单核细胞（PBMC)与25 μ g纯化的多表位蛋白在 37°C、6. 5% CO 2下孵育2小时。孵育后，这些PBMC与未脉冲刺激的PBMC混合并重新悬浮 在添加有10% FCS的RPMI 1640介质中（称为生长介质）。这些细胞在37°C、6. 5% CO 2 下培养在24孔板中达10天。在第三天和第六天，向培养物补充ImL含100U重组IL-2的 生长介质。使用标准的ICS分析来评估这些体外扩大细胞的T细胞特异性。另外，还使用 多参数流式细胞仪对这些培养物中的T细胞的多功能能力进行评估。
[0222] 分析通过人类细胞处理和提呈的来自CMV多表位蛋白的CD8+T细胞表位
[0223] 爱泼斯坦-巴尔病毒（EBV)转化的LCL和HEK 293细胞用作这些分析中的抗原提 呈细胞。用25-100 μ g CMV多表位蛋白在37°C、6. 5% CO2中脉冲刺激这些细胞两小时，然 后用RPMI 1640介质洗涤两次，再悬浮于生长介质中，并在37°C、6. 5% C0J?育过夜。过夜 孵育后，在37°C、6. 5% CO2中以反应物对刺激物比率4:1下，抗原提呈细胞暴露于CMV特异 性T细胞中四小时，然