Fcγ受体IIB变体的制作方法
【专利说明】Fe γ受体I IB变体 发明领域
[0001] 本发明涉及编码SEQ ID NO: 1的蛋白的核酸序列；包含所述核酸序列的载体，以及 包含所述核酸序列或所述载体的宿主细胞。本发明还涉及通过在宿主细胞中表达所述核酸 序列或所述载体而得到的或可得到的蛋白。另外，本发明还涉及由SEQ ID N0:6的核酸序 列编码的蛋白。此外，本发明包含药物组合物及其制备方法。本发明还涉及包含根据SEQ ID N0:2和/或3的蛋白的物质组合物，所述组合物还包含根据SEQ ID N0:4和/或5的蛋 白。
【背景技术】
[0002] Fe γ R属于Fe受体（FcR)家族，所述Fe受体在保护人生物体防御感染方面起着 关键作用。一般而言，需要区分激活性Fe YR和抑制性Fcy R。在人的三种主要Fe YR中， Fe γ RI能够结合单体IgG，而Fe γ RII和Fe γ RIII结合由抗体和抗原组成的多价免疫复合 物（IC) (Takai，T. Nature Reviews Immunology 2002:580-592)。取决于所表达的 FcR 类型 及相关蛋白，由Fe γ R触发的效应功能包括经病原体和抗原递呈的随后中和作用的内吞作 用、抗体依赖性的细胞毒作用（ADCC)、介质分泌或抗体产生的调节（Fridman等人，Immunol Rev,1992125:49-76, van de Winkel and Capel Immunol Today，1993 :14(5) :215-21)〇
[0003] WO 00/32767记载了可溶性Fe受体（FcR)，其仅由受体的细胞外部分组成并且没 有被糖基化。由于这些蛋白没有跨膜结构域和信号肽，它们以可溶性形式存在并且不与 细胞结合。此外，WO 00/32767记载了 FcR可以被重组产生，由于它们能够与抗体Fe部分 相结合而不干扰免疫系统的其它组分，因此FcR已被提议用于治疗自身免疫性疾病。WO 00/32767还记载了某些FcR的晶体结构，并记载了发现下述物质的可能性：所述物质借助 于这些晶体结构而抑制IgG与FcR的相互作用。阐明所述晶体结构使得能够通过使用可得 到的计算机程序筛选数据库，寻找出这种抑制剂。如WO 03/043648中所限定的发明进一步 开发了 WO 00/32767的发现，并提供了尤其针对疾病（例如多发性硬化（MS)、系统性红斑狼 疮（SLE)和类风湿性关节炎（RA))以及用于自然杀伤细胞水平升高的疾病的治疗方法。
[0004] 当所述受体在原核生物中重组生成并因此未被糖基化时，WO 03/043648的发明人 意外地发现，尽管预期非糖基化蛋白的溶解度不高，但受体仍可以以高浓度的可溶形式的 Fe γ R纯化。WO 03/043648和其它出版物证实了 FcR在免疫系统的防御反应中起重要作用。
[0005] Fe受体在免疫系统中具有重要作用，在免疫系统中它们可以控制免疫反应 的程度和强度。这证明了特别是可溶的（即Fcy受体IIB的细胞外部分）Fc Y受体 IIB (sFc γ RIIB)(所述Fe γ受体IIB与免疫细胞上表达的Fe γ R竞争致病性免疫复合物） 在自身免疫性疾病的治疗中是有益的。在发生于自身免疫性疾病中的免疫反应的早期进行 干预，会预防导致炎症和组织破坏的级联反应的触发。具体而言，sFc YRIIB同时处于适应 症原发性免疫性血小板减少症（ITP)和系统性红斑狼疮（SLE)的II期临床试验中。众所 周知，对于临床试验，需要生物材料（本文为sFcy RIIB)优选具有良好的化学、制造和控制 (CMC)性能，例如纯化过程中的高纯度和高稳定性。
[0006] 因此，本发明的一个目的是提供具有良好CMC性能的人Fe γ RIIB蛋白。该目的通 过权利要求中反映的、本文描述的、在实施例和附图中示例的实施方案而得到解决。
[0007] 令人惊讶的是，对于例如本文所述那些的蛋白已证明，由于在超过I. 5Μ时的硫酸 铵浓度下更好的溶解度，能够达到更高的纯化程度。作为很多纯化方案中的第一个步骤，硫 酸铵沉淀有用于去除大量污染蛋白。当目标是高纯度蛋白时，硫酸铵浓度越高，则结果越 好，但是由于硫酸铵离子强度高，在蛋白上施加的应力越大。因此，蛋白抗应力越强，硫酸铵 浓度可越高，因此蛋白纯度越高。具体来说，通过加入离液序列低的（kosmotropic)硫酸 铵，副产物如未折叠或错误折叠的物质以及源自宿主细胞的杂质如细胞壁组分和蛋白被沉 淀。随着沉淀浓度增大，沉淀效率将增大，因此得到高度纯化的蛋白沉淀，只要感兴趣的蛋 白在如此高的硫酸铵抵抗沉淀即可。如所述，令人惊讶地证实，如本文所述的FcR蛋白在硫 酸胺浓度等于或超过1.5M时，是高度可溶的。这尚未被预期得到，原因在于，如实施例所 示，现有技术的FcR蛋白表现不同，而且也没有对如何改变FcR蛋白使其具有如本发明所提 供的FcR蛋白的表现方式和特性的任何可得到的教导。如所述，本发明人非常惊讶的是，证 实本文所述蛋白实际上抵抗高浓度硫酸铵，由此相比于现有技术中FcyRIIB蛋白，例如WO 00/3276或WO 03/043648中所述的FcyRIIB蛋白，其具有更高的纯度。
【发明内容】
[0008] 本发明涉及编码一种根据SEQ ID NO: 1的蛋白的核酸序列。本发明还提供编码示 于SEQ ID N0:2、3、4、5或9的蛋白的核酸序列。示于SEQ ID N0:6的核酸序列编码SEQ ID NO: 1的蛋白。
[0009] 本发明还涉及一种载体，其包含编码根据SEQ ID NO: 1的蛋白的核酸序列。本发 明还涉及载体，其包含编码根据SEQ ID N0:2、3、4、5或9的蛋白的核酸序列。
[0010] 进一步地，本发明还涉及一种通过在宿主细胞中表达编码根据SEQ ID NO: 1的蛋 白的核酸序列或表达本发明的载体而得到的或可得到的蛋白，优选地，所述宿主细胞为原 核宿主细胞，更优选为大肠杆菌。
[0011] 此外，本发明还涉及一种由根据SEQ ID N0:6的核酸序列编码的蛋白。
[0012] 本发明还涉及一种药物组合物，其包含通过在宿主细胞中表达编码根据SEQ ID N0:1的蛋白的核酸序列或表达本发明的载体而得到的或可得到的蛋白，或包含由根据SEQ ID N0:6的核酸序列编码的蛋白。
[0013] 进一步地，本发明涉及一种包含SEQ ID N0:2和/或3的蛋白的物质组合物。优 选地，所述物质组合物为药物组合物。
[0014] 在一个实施方案中，本发明的物质组合物还包含根据SEQ ID N0:4和/或5的蛋 白。优选地，所述物质组合物为药物组合物。
[0015] 在另一个实施方案中，本发明的物质组合物具有的根据SEQ ID No:2的蛋白的量 超过根据SEQ ID N〇:3的蛋白的量。
[0016] 在另一个实施方案中，本发明的物质组合物具有的根据SEQ ID No:2的蛋白的量 超过根据SEQ ID N〇:3的蛋白的量，而且根据SEQ ID N〇:2和3的蛋白的量超过根据SEQ ID N〇:4和/或5的蛋白的量。
[0017] 另外，本发明涉及一种物质组合物，其包含根据SEQ ID N0:9的蛋白。优选地，所 述物质组合物为药物组合物。
[0018] 本发明还涉及一种宿主细胞，其包含编码根据SEQ ID No: 1的蛋白的核酸序列，或 者所述宿主细胞包含本发明的载体，所述载体包含权利要求1的核酸序列。本发明还涉及 一种宿主细胞，其包含编码根据SEQ ID N〇:2、3、4、5或9的蛋白的核酸序列，或者所述宿主 细胞包含本发明的载体，所述载体包含编码根据SEQ ID N〇:2、3、4、5或9的蛋白的核酸序 列。
[0019] 在一个实施方案中，本发明的宿主细胞为原核或真核宿主细胞。
[0020] 在本发明另一个实施方案中，所述原核宿主细胞为大肠杆菌，优选为大肠杆菌 BL21ji^DBL21(DE3)。
[0021] 本发明还涉及一种制备药物组合物的方法，所述方法包括在允许表达所编码蛋白 的条件下培养本发明的宿主细胞，和回收得到的药物组合物。
【附图说明】
[0022] 图I :a)人sFc γ RIIB的晶体结构（PDB条目：2FCB)。如变体1的氨基酸序列（SEQ ID N〇:7)表示的不可变核心结构对于此研宄中测试的所有SFcR变体均相同，显示为深灰 色，认为对于IgG结合很重要的环显示为浅灰色，N-和C-端延伸显示为黑色。两个二硫键 显示为球状和棒状图示。由图Ib所示序列比对还明确鉴定出在所有测试变体之间的该核 心结构的同一性。
[0023] b)本研宄中使用的SFcR变体（缩写为"var") 1-4的序列比对。SEQ ID No:被缩 写为SEQ。
[0024] 图2 :FcR沉淀筛选结果。FcR变体1-4在25 °C以及指示的pH值和硫酸铵浓度下 孵育1小时。离心后，上清液中的FcR含量通过OD28tl测量而测定，并且相对于硫酸铵浓度 绘图。
[0025] 序列
[0026] 以下序列提供本文使用的序列的概述：
[0027] SEQ ID No: 1 (本文有时也被称为"变体3"）
[0033] SEQ ID No :4
【具体实施方式】
[0045] 需要指出的是，本文使用的单数形式"一种"、"一个"和"所述/该"，除非本文有其 它明示，其包括复数指代。因此，例如提及"一种试剂"包括此类不同试剂中的一种或多种， 提及"所述方法"包括对本领域普通技术人员已知的可修改或替换本文所述方法的等同步 骤和方法的指代。
[0046] 本公开内容中引用的所有出版物和专利通过引用其全文而并入。在所述材料通过 引用并入与本说明书矛盾或不一致的程度，本说明书优先于任意此类材料。
[0047] 除非有其它明示，在一系列元素前使用术语"至少"应被理解为是指该系列中的每 一个成分。本领域技术人员将确认或使用常规试验能够确定本文所述发明的【具体实施方式】 的许多等同物。预期此类等同物都被本发明包含。
[0048] 在本说明书全文及后附的权利要求书中，除非上下文另有要求，术语"包含"以及 例如"包括"和"含有"的变型应被理解为表示包含所述整数或步骤或者整数或步骤的组， 但不排除任何其他整数或步骤或者整数或步骤的组。本文如用到术语"含有"，其能够被替 代为术语"包含"，或者被替代为本文有时用到的术语"具有"。
[0049] 本文使用"由…组成"时排除了所要求保护的元素中没有表明的任何元素、步骤或 成分。本文使用"基本上由…组成"时没有排除实质上不影响权利要求的基本特征和新颖 性特征的材料或步骤。
[0050] 本文每一个实例中，术语"包含/包括"、"基本上由…组成"和"由…组成"中的任 一个可以被其它两个术语中的任一个代替。
[0051] 本说明书全文中引用了若干文件。本文引用的每个文件（包括所有的专利、专利 申请、科学出版物、制造商说明书、操作指南等），无论是上文还是下文，都通过引用全文并 入本文。本文绝不理解为承认本发明由于之前的发明而不先于此类公开。
[0052] 在第一方面，本发明涉及一种编码根据SEQ ID NO: 1的蛋白的核酸序列。
[0053] 本文使用的术语"核酸"和"核苷酸序列"或"核酸序列"包括DNA分子（例如cDNA 或基因组DNA)、RNA分子（例如mRNA)、DNA和RNA分子的组合或杂合DNA/RNA分子以及DNA 或RNA分子的类似物。这种类似物能够通过使用例如核苷酸类似物产生，所述核苷酸类似 物包括但不限于肌苷或三苯甲基化（tritylated)碱基。这些类似物还可以包含DNA或RNA 分子，所述DNA或RNA分子包含经修饰的主链，其给