表达。37°C下、170rpm再培养3h之后，通过离心C 000，g， 4°C，10分钟）收获所述细胞，用200ml冰冷却的PBS清洗一次，-20°C下保存。
[0160] 细胞裂解和分离包涵体
[0161] 室温下融化6_8g冰冻的大肠杆菌细胞，使用聚四氟乙烯玻璃均浆器在补充了 100μg/mL溶菌酶的30mL裂解缓冲液（50mMTris/HCl，25mMNaCl，2mMEDTA，pH8·0)中 再次悬浮。于冰上孵育15分钟之后，超声破裂细胞（功率设置6,占空比30%，30分钟，配 备微头的声波降解器250, Branson)，然后离心悬浮液（13' OOO · g，4°C，45分钟）。采样 上清液lmL，去除剩余液体。使用聚四氟乙烯玻璃均浆器在补充了 0.5% (v/v)聚山梨醇酯 20的35mL裂解缓冲液中，再次悬浮片状沉淀物即粗包涵体，然后离心（13< 000 *g，4°C，15 分钟）。使用洗涤剂再次清洗后，最后单独使用裂解缓冲液清洗。洗涤后的包涵体于_20°C 下保存直到使用。
[0162] 再折叠和纯化FcR变体
[0163] 在密封离心管中，20°C、持续搅拌（400rpm)下，将湿包涵体以200mg/mL溶解于 20mM Tris/HC1，6M胍，3mM EDTA，5mM DTT，pH 8. 0 达 2. 5 小时。离心（20，000 *g,20°C, 10 分钟）之后，通过倾析收集上清液，1:60稀释后通过在Knauer Bioselect C4上的RP-HPLC， 测定FcR含量。根据分析结果，用20mM Tris/HC，6M胍，3mM EDTA，5mM DTT，pH 8. 0稀释溶 解的包涵体至FcR含量为21mg/mL，将1份经稀释的FcR溶液逐滴加入20份搅拌（800rpm) 的再折叠缓冲液（20mM Tris/HC1，2M尿素，0. 5M精氨酸，2mM巯基乙胺，2mM胱胺，pH 7. 70， 6°C)中。在KTC下于密封容器内不搅拌孵育16h之后，将再折叠溶液升至室温。在持续 搅拌（400rpm)下，通过逐滴加入3· 5M(NH4)2S04,20mM NH4H2PO4, pH 7.0,将该升至室温的再 折叠溶液调整为（NH4)2SO4浓度为I. 1M。在200rpm下再搅拌Ih后，离心（20- 000 · g， 20min，20°C )所述悬浮液，过滤（0.2ymDurap〇re?，Millipore)上清液，以 4mL/min， < 4mg蛋白/mL树脂将滤液加载到35mL Phenyl Sepharose HP色谱柱（h = 6. 6cm，d = 2. 6cm，GE Healthcare)上，所述色谱柱在 I. 2M(NH4)2S04,20mM NH4H2PO4, pH 7· 0 中平衡。 使用 IOOmLL 2Μ (NH4) 2S04,20mM NH4H2PO4,，pH 7. 0 清洗色谱柱，然后使用 20mM NH4H2PO4, pH 7. 0中的I. 2M至OM (NH4) 2S04以5mL/min的350mL线性梯度洗脱结合的蛋白。以7. 5mL的 级分收集洗脱液，在Phenomenex Jupiter C4上使所述级分进行RP-HPLC分析。合并其中 期望的FcR变体的纯度在85%以上的级分，大致浓缩2次，然后通过切向流过滤（Vivaflow 50,5kDaMWC0,0·01m2，横向流200mL/min，pIN = 2bar;Sartorius)，相对于20mML-组氨酸 pH 6. 5渗滤直至传导率降低至大约5mS/cm。更换缓冲液之后，以2mL/min、< 20mg蛋白/mL 树脂将溶液加载到 9mL SP Sepharose HP 色谱柱（h = 4. 5cm，d = I. 6cm，GE Healthcare) 上，所述色谱柱在20mM L-组氨酸，pH 6. 5中平衡。使用30mL 20mM L-组氨酸，30mM氯化 钠 ，pH 6. 5清洗色谱柱，然后使用20mM L-组氨酸，pH 6. 5中的20mM至400mM氯化钠的90mL 线性梯度以3mL/min洗脱结合的蛋白。合并含主峰的级分，使用20mM L-组氨酸，pH 6. 5调 整至 15. 4mS/cm，通过超滤（4' 000 · g，5kDa MWCO, Vivaspin 20, Sartorius)浓缩至大约 2〇11^/1]11^然后使用2〇11111^-组氨酸，15〇1111氯化钠，卩!16.5稀释至1511^/1]1匕过滤（0.45 4111 PES膜，Puradi scTM25mm，Whatman)经稀释的FcR溶液，分装，液态氮快速冷冻，-80 °C下保存。
[0164] 沉淀筛选
[0165] 通过加入适量双蒸水、IOX组氨酸/氯化钠储备溶液（200mM组氨酸，1.5M NaCl) 和硫酸铵储备溶液（双蒸水中为4M)，在20mM组氨酸、150mM氯化钠和0-2. 8M硫酸铵的存 在下，调整FcR为0. 7mg/mL。通过使用IOX组氨酸/NaCl和合适pH的硫酸铵储备溶液，将 pH设定为6、7或8。重复设置每一个条件。25°C下孵育样品lh，离心（2(V 000xg，10min)， 然后将30 μ L上清液转移到384孔板（μ clear，非结合，黑色，Greiner Bio-one)。测定 280nm处的吸光度（Spectrofluor plus，Tecan)，然后根据兰伯特啤酒法使用质量消光系数 1.5625mL X mg-lx cm-Ι以及路径长度为0. 24cm，计算蛋白含量。通过仅包含空白缓冲液 的孔的吸光度来校正样品孔的吸光度。
[0166] SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
[0167] 为抑制后续二硫键交换，使用碘乙酰胺，通过将18 μ L IB溶解液或再折叠培养液 与新鲜制备的2yL 250mM碘乙酰胺在水中混合，使得游离硫醇烷基化。在30°C、750rpm 下，在暗处孵育混合物45分钟，然后根据NuPAGE? Novex?手册（Invitrogen)，直 接用于SDS-PAGE样品制备。在4-12% Bis-Tris凝胶上在MES电泳缓冲液（二者均为 NuPAGE?N〇vex?，Invitrogen)中根据制造商指南分离蛋白。用双蒸水清洗凝胶3 次，用Simply Blue? Safe Stain(Invitrogen)室温下染色至少6h。作为分子量标记物， 使用 10 U L 的SeeBlue? Plus2 预染标准物（Invitrogen) 〇
[0168] LC-MS
[0169] 通过质谱法联合生化MPI (Martinsried)测定完整的所表达蛋白的分子量。样品 在配备有 Phenomenex Aeris? Widepore C4 色谱柱(1 OOmm x 2. 1mm，3. 6 μ M 粒径，300 A 孔径）的ESI-TOF质量分析器（microTOF，Bruker)上分析，所述色谱柱预先在30%乙腈， 0.05% TFA中平衡。以0.25mL/min、20 °C下注射含有FcR的样品，然后采用30 %至80 %乙 腈，0. 05% TFA的15min线性梯度洗脱结合的蛋白。
[0170] UV/VIS 光谱学
[0171] 如有必要，使用相应的缓冲液稀释蛋白溶液，使其OD28tl为0.2至0.8。将该 溶液 400 μ L 转移到 UV-微量吸收池（UV-cuvette micro, Brand)。记录（TidasE，J&M Analytik) 280nm和320nm处的吸光度，并根据以下等式计算出以mg/mL计的蛋白浓度：
[0172] c 蛋白=(OD280-OD320)X 0· 64mg/mL
[0173] 相应的缓冲液用作空白组。一式三份进行试验，结果取平均数。
[0174] 实施例1 :沉淀筛选
[0175] 通过基于再折叠的方法的FcR蛋白制备通常涉及硫酸铵沉淀步骤。通过加入离液 序列低的（kosmotropic)硫酸按，折叠副产品如未折叠或错误折叠的物质以及源自宿主细 胞的杂质如细胞壁组分和蛋白被沉淀。随着沉淀浓度增大，沉淀效率将增大，因而得到高度 纯化的FcR制备物，只要FcR变体在如此高的硫酸铵浓度下抵抗沉淀即可。因此，理想的是 具有在硫酸铵浓度等于或超过I. 5M时仍高度可溶的FcR变体。除了杂质直接沉淀以外，高 硫酸铵浓度促进与HIC树脂的有效结合。由于高动态结合能力一直是色谱捕获步骤的关键 开发目标，在高硫酸铵浓度存在下的可溶性是必须的。
[0176] 为了评估FcR变体在硫酸铵存在下的溶解度，用pH 6至8下的增大浓度的硫酸铵 孵育每一个变体。在25°C下Ih后，通过紫外/可见光谱测定上清液中FcR浓度。如图2所 示，变体3在（NH 4)2S042. 05M至2. 13M时具有半最大沉淀从而对硫酸铵沉淀的抗性最大。相 反地，"变体2"（SEQ ID N0:8)和"变体4"（SEQ ID N0:9)在高硫酸铵浓度下的溶解度较 差，从而显示在（NH4)2SO4浓度为0. 70M-1. 7M范围时具有半最大沉淀。然而，"变体4"在高 硫酸铵浓度下仍可溶。对所有FcR变体而言，可以忽略溶解度的pH依赖。
[0177] 需要注意的是，不能进行沉淀筛选，因此无法测定"变体1"在高硫酸铵浓度下的溶 解度，因为"变体1"不能充分再折叠，因此无法获得可溶性蛋白来进行沉淀筛选。
【主权项】
1. 一种编码根据SEQIDNo: 1的蛋白的核酸序列。2. -种包含权利要求1所述的核酸序列的载体。3. -种通过在宿主细胞中表达权利要求1所述的核酸序列或表达权利要求2所述的载 体而得到的或可得到的蛋白。4. 根据权利要求3所述的蛋白，其中所述宿主细胞为原核宿主细胞。5. 根据权利要求3或4所述的蛋白，其中所述宿主细胞为大肠杆菌。6. -种由根据SEQIDN〇:6的核酸序列编码的蛋白。7. -种包含权利要求3或4所述的蛋白的药物组合物。8. -种包含根据SEQIDN〇:2和/或3的蛋白的物质组合物。9. 所述物质组合物还包含根据SEQIDNo:4和/或5的蛋白。10. 根据权利要求8所述的物质组合物，其中根据SEQIDN〇:2的蛋白的量超过根据 SEQIDNo:3的蛋白的量。11. 根据权利要求8至10中任一项所述的物质组合物，其中根据SEQIDN〇:2和3的 蛋白的量超过根据SEQIDN〇:4和/或5的蛋白的量。12. -种包含权利要求1所述的核酸序列或权利要求2所述的载体的宿主细胞。13. 根据权利要求12所述的宿主细胞，其为原核宿主细胞或真核宿主细胞。14. 根据权利要求12所述的原核宿主细胞，其为大肠杆菌。15. 根据权利要求14所述的原核宿主细胞，其为大肠杆菌BL21。16. -种制备药物组合物的方法，所述方法包括在允许表达所编码蛋白的条件下培养 权利要求12至15中任一项所述的宿主细胞，和回收得到的药物组合物。
【专利摘要】本发明涉及编码SEQ ID NO:1的蛋白的核酸序列；包含所述核酸序列的载体和包含所述核酸序列或所述载体的宿主细胞。本发明还涉及通过在宿主细胞中表达所述核酸序列或所述载体而得到的或可得到的蛋白。进一步地，本发明涉及由SEQ ID NO:6的核酸序列编码的蛋白。本发明还包括药物组合物及其制备方法。
【IPC分类】A61K38/17, C07K14/735
【公开号】CN104918955
【申请号】CN201380056738
【发明人】P·松德尔曼, D·特米尔, T·波尔, R·温特, U·雅各布
【申请人】苏伯利莫尔公司
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2013年10月30日
【公告号】CA2887164A1, EP2914624A1, US20140120080, WO2014068012A1