亲水性重组蛋白的部分精制方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及亲水性重组蛋白的部分精制（partial purification)方法，详细而 言，本发明涉及从表达亲水性指数（hydropathy index)为0以下的重组蛛丝蛋白等亲水性 重组蛋白的宿主中将该亲水性重组蛋白部分精制的方法。
【背景技术】
[0002] 蛛丝纤维已知是具有高强度和韧性的纤维，其比高强度钢、尼龙6(注册商标）纤 维等具有更高的强度和韧性。由于这样的特性，蛛丝作为新型原料受到关注，利用基因重 组技术进行了使作为蛛丝原料的蛛丝蛋白在大肠杆菌等宿主细胞中的表达、回收。例如专 利文献1中公开了通过重组DNA技术制造络新妇蛛（Nephila clavipes)大吐丝管（major ampullate)拖丝蛋白、络新妇蛛小吐丝管（minor ampullate)拖丝蛋白等蜘蛛拖丝蛋白。
[0003] 现有技术文献
[0004] 专利文献
[0005] 专利文献1 :日本特开平6-98771号公报
【发明内容】
[0006] 发明所要解决的课题
[0007] 专利文献1中，在使细胞溶解而将细胞内存在的重组蜘蛛拖丝蛋白释放、回收时， 通过用细胞残渣溶解而蜘蛛拖丝蛋白不溶解的溶剂进行重复处理来使蜘蛛拖丝蛋白沉淀。 但是，在重组蜘蛛拖丝蛋白为水不溶性蛋白时是有效的，当重组蛋白为亲水性重组蛋白时， 并不是有效的手段且期望工序的简便化。
[0008] 本发明为了解决上述以往的问题，提供一种能够从表达亲水性指数为0以下的重 组蛛丝蛋白等亲水性重组蛋白的宿主中简便且高效地将亲水性重组蛋白部分精制的亲水 性重组蛋白的部分精制方法。
[0009] 用于解决课题的手段
[0010] 本发明涉及一种亲水性重组蛋白的部分精制方法，其为从表达亲水性重组蛋白的 宿主中将亲水性重组蛋白部分精制的方法，其特征在于，其包含在上述表达亲水性重组蛋 白的宿主中添加溶解用溶剂，使宿主细胞溶解，将不溶物分离来得到溶解液的溶解液获取 工序，其中，上述亲水性重组蛋白的亲水性指数为0以下，上述溶解用溶剂为非质子性极性 溶剂。
[0011] 本发明的亲水性重组蛋白的部分精制方法中，上述溶解用溶剂优选偶极矩为 3. OD以上，更优选为选自二甲基亚砜、N，N-二甲基甲酰胺、N，N-二甲基乙酰胺、1，3-二甲 基-2-咪唑啉酮和N-甲基-2-吡咯烷酮中的一种以上非质子性极性溶剂。上述溶解用溶 剂优选为在上述非质子性极性溶剂中添加无机盐而成的溶剂。上述不溶物的分离可以通过 利用过滤的分离和/或离心分离来进行。上述溶解用溶剂相对于上述宿主的质量以体积 (mL)/质量（g)比计优选添加0.5倍以上。优选将上述溶解液用水系溶剂进行溶剂替换。 经溶剂替换的溶解液更优选进一步采用选自柱、过滤和离心分离中的一种以上方法处理。 上述亲水性重组蛋白优选为选自重组蛛丝蛋白、重组节肢弹性蛋白和重组胶原中的一种蛋 白。
[0012] 发明效果
[0013] 根据本发明，通过使用非质子性极性溶剂作为溶解用溶剂，用溶解用溶剂使表达 亲水性指数为0以下的亲水性重组蛋白的宿主溶解，将不溶物分离、回收溶解液，能够简便 且高效地从宿主中将亲水性指数为0以下的亲水性重组蛋白部分精制。
[0014] 另外，根据本发明，通过使用在非质子性极性溶剂中添加无机盐而成的溶剂作为 溶解用溶剂，能够以更高的精制率将亲水性指数为0以下的重组蛛丝蛋白、重组节肢弹性 蛋白、重组胶原等亲水性重组蛋白部分精制。
【附图说明】
[0015] 图1为表示实施例1和比较例1中得到的蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE)的结果的照片。
[0016] 图2为表示实施例2~6中得到的蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE) 的结果的照片。
[0017] 图3为表示比较例2中得到的蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE)的结 果的照片。
[0018] 图4为表示实施例8中得到的蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE)的结 果的照片。
【具体实施方式】
[0019] 本发明中，蛋白的亲水性指数（hydropathy index)是如下算出的数值。首先，求 出蛋白中存在的氨基酸的亲水性指数的总和。接着，用该总和除以蛋白中的氨基酸残基数 求出平均值，将算出的平均值作为蛋白的亲水性指数。其中，关于氨基酸的亲水性指数，使 用公知的指标（Hydropathy index :Kyte，J. &Doolittle，R.F. (1982)A simple method for displaying the hydropathic character of a protein. J. Mol. Biol. 157,105-132. )〇 具 体而言，各氨基酸的亲水性指数（下文也记为HI)如下表1所示。
[0020] 表 1
[0021]
[0022] 本发明者们发现在表达亲水性指数为0以下的亲水性重组蛋白的宿主中添加非 质子性极性溶剂、使细胞溶解、将不溶物分离，能够将上述亲水性指数为0以下的亲水性重 组蛋白通过上清液回收而得到部分精制，从而完成了本发明。即发现了，通过用非质子性 极性溶剂使宿主细胞溶解，亲水性指数为〇以下的亲水性重组蛋白溶解于非质子性极性溶 剂，从而完成了本发明。下文中，在没有特别说明的情况下，亲水性蛋白是指亲水性指数为〇 以下的亲水性蛋白。另外，下文中，在没有特别说明的情况下，重组蛋白是指亲水性指数为 〇以下的亲水性重组蛋白。
[0023] 上述非质子性极性溶剂没有特别限定，从降低夹杂物的观点出发，优选纯度为 90%以上、更优选为95%以上。上述非质子性极性溶剂的偶极矩优选为3. OD以上。偶极矩 被用作表示分子的极性强度的指标，偶极矩越大则极性强度也越大。通常，偶极矩为3. OD 以上的分子的极性强，当溶解蛋白等具有极性的化合物时，极性大的溶剂是有效的。下表2 中记载了基于讲谈社Scientific公司出版的溶剂手册（2007年）的各种有机化合物（有 机溶剂）的偶极矩。作为偶极矩为3. OD以上的非质子性极性溶剂，可列举出二甲基亚砜 (DMSO)、N，N-二甲基甲酰胺（DMF)、N，N-二甲基乙酰胺（DMA)、1，3-二甲基-2-咪唑啉酮 (DMI)、N-甲基-2-吡咯烷酮（NMP)、乙腈等。
[0024] 表 2
[0025]
[0026] 当上述溶解用溶剂为在非质子性极性溶剂中添加无机盐而成的溶剂时，没有特别 限定，从提高重组蛋白的纯度（精制度）的观点出发，无机盐的浓度优选为〇. IM以上、更优 选为0. 25M以上、进一步优选为0. 5M以上。另外，上述溶解用溶剂中，无机盐的浓度的上限 没有特别限定，优选为饱和状态以下，例如可以为2. 5M以下。
[0027] 上述溶解用溶剂的添加量只要是能够溶解上述宿主的量即可，没有特别限定，从 提高溶解性的观点出发，相对于上述宿主（细胞）的质量以体积（mL)/质量（g)比计优选 为0. 5倍以上、更优选为0. 75倍以上、进一步优选为1倍以上。另外，从操作的简便性出发， 上述溶解用溶剂的添加量相对于上述宿主的质量以体积（mL)/质量（g)比计优选为10倍 以下、更优选为6倍以下、进一步优选为4倍以下。上述宿主（细胞）可以为干燥的状态、 也可以为湿的状态。
[0028] 将上述溶解用溶剂添加到宿主中、将宿主细胞溶解的工序没有特别限定，从重组 蛋白的溶解性的观点出发，优选在20°C以上的条件下进行、更优选在45°C以上的条件下进 行、进一步优选在50°C以上的条件下进行。另外，从抑制重组蛋白分解的观点出发，上述溶 解物获取工序优选在l〇〇°C以下的条件下进行、更优选在95°C以下的条件下进行。另外，上 述溶解物获取工序没有特别限定，例如优选进行10~300分钟、更优选进行30~180分钟。
[0029] 本发明中，不溶物的分离只要能够将沉降物分离则没有特别限定。从操作的简便 性出发，优选通过利用过滤的分离和/或离心分离来进行。利用过滤的分离可以使用例 如滤纸、过滤膜等来进行。离心分离的条件没有特别限定。例如可以在室温（20±5°C)、 8000Xg~15000Xg下进行5~20分钟。上述不溶物的分离可以进行2次以上。
[0030] 上述重组蛋白只要是亲水性指数为0以下的亲水性重组蛋白即可，没有特别限 定。从提高提取效率的观点出发，亲水性指数优选为一 0. 1以下、更优选为一 0. 3以下。
[0031] 作为上述重组蛋白，没有特别限定，例如优选为选自重组蛛丝蛋白、重组节肢弹性 蛋白和重组胶原等中的一种蛋白。
[0032] 上述重组蛛丝蛋白只要是天然型蛛丝蛋白来源的重组蛛丝蛋白即可，没有特别限 定。包括例如天然型蛛丝蛋白的变异体、类似物或衍生物等。上述重组蛛丝蛋白从韧性优异 的观点出发，优选为由蜘蛛的大壶状腺产生的大吐丝管拖丝蛋白来源的重组蛛丝蛋白。作 为上述大吐丝管拖丝蛋白，可列举出络新妇蛛（Nephila clavipes)来源的大壶状腺丝蛋白 (spidroin)MaSpl、MaSp2、十字园蛛（Araneus diadematus)来源的 ADF3、ADF4 等。另外，上 述重组蛛丝蛋白也可以是从蜘蛛的小壶状腺产生的小吐丝管拖丝蛋白来源的重组蛛丝蛋 白。作为上述小吐丝管拖丝蛋白，可列举出络新妇蛛来源的小壶状腺丝蛋白MiSpl、MiSp2。 另外，上述重组蛛丝蛋白还可以是由蜘蛛的鞭状腺（flagelliform gland)产生的横丝蛋 白来源的重组蛛丝蛋白。作为上述横丝蛋白，可列举出例如络新妇蛛来源的鞭毛状丝蛋白 (flagelliform silk protein)等。
[0033] 作为上述大吐丝管拖丝蛋白来源的重组蛛丝蛋白，可列举出含有2个以上、优选4 个以上、更优选6个以上的由式I :REP1-REP2所示的氨基酸序列单元的多肽。其中，在上述 大吐丝管拖丝蛋白来源的重组蛛丝蛋白中，式I :REP1-REP2所示的氨基酸序列单元可以相 同也可以不同。
[0034] 上述式1中，REPl表示聚丙氨酸。上述REPl中，连续排列的丙氨酸优选为2个残 基以上、更优选为3个残基以上、进一步优选为4个残基以上、特别优选为5个残基以上。另 外，上述REPl中，连续排列的丙氨酸还优选为20个残基以下、更优选为16个残基以下、进 一步优选为14个残