GE。具体而言，向各样品30 yL中加入2xSDS缓冲液 (4w/v% SDS、20w/v%甘油、10w/v% 2-疏基乙醇、0· 004w/v%溴酷蓝、0· 125M Tris、pH 为 6. 8) 30 μ L，在95°C下热处理10分钟，使用在室温下冷却了的经热变性的蛋白溶液，通过聚 丙稀酰胺凝胶电泳确认条带。电泳后，将凝胶用Oriole Fluorescent Gel Stain染色，将 其结果示于图1。另外，通过用分析软件ImageLab(Bi〇-RAD Laboratories，Inc.)对染色 后的蛋白的电泳照片进行图像分析，求出目标蛋白（重组蛋白）的纯度。将其结果示于下 表3〇
[0081] 表 3
[0082]
[0083] 图1示出了使用了实施例1中得到的溶解液、溶剂替换后的溶解液和柱洗脱液、以 及比较例1中得到的超声破碎液的SDS-PAGE的结果。图1中，Lane M表示分子量标记物、 Lane 1表示比较例1中得到的超声破碎液中所含的蛋白、Lane 2、3、4分别表示实施例1中 得到的溶解液、溶剂替换后的溶解液、柱洗脱液中所含的蛋白。图1中，用箭头表示的为与 ADF3Kai-small-M(分子量为约12. 5kDa)对应的蛋白的条带。如从图1和表3的结果所确 认的，用含有IM的LiCl的DMSO将大肠杆菌溶解而得到的溶解液中的ADF3Kai-smalI-M的 纯度比将大肠杆菌超声破碎而得到的超声破碎液中的ADF3Kai-smalI-M的纯度高，通过用 非质子性极性溶剂将大肠杆菌溶解、将不溶物分离，目标蛋白（ADF3Kai-small-M)得到部 分精制。另外，通过将溶解液用水进行溶剂替换，目标蛋白（ADF3Kai-small-M)的纯度提 高。另外，通过将溶剂替换后的溶解液用柱进行处理，目标蛋白（ADF3Kai-small-M)的纯度 进一步提尚。
[0084] (实施例2)
[0085] 在表达ADF3Kai-small_M蛋白的大肠杆菌的湿菌体约15g中添加45ml含有IM 的LiCl的DMS0,在60°C下使其溶解30分钟。之后，用离心分离机（Τ0ΜΥ精工公司制的 "MX-305"）在20°C、11000Xg下离心分离10分钟，将上清液（溶解液）回收。
[0086] (实施例3)
[0087] 代替含有IM的LiCl的DMS0,使用含有IM的LiCl的DMF，除此以外，与实施例2 同样地操作，回收上清液（溶解液）。
[0088] (实施例4)
[0089] 代替含有IM的LiCl的DMS0,使用含有IM的LiCl的DMA，除此以外，与实施例2 同样地操作，回收上清液（溶解液）。
[0090] (实施例5)
[0091] 代替含有IM的LiCl的DMS0,使用含有IM的LiCl的NMP，除此以外，与实施例2 同样地操作，回收上清液（溶解液）。
[0092] (实施例6)
[0093] 代替含有IM的LiCl的DMS0,使用含有IM的LiCl的DMI，除此以外，与实施例2 同样地操作，回收上清液（溶解液）。
[0094] (比较例2)
[0095] 代替含有IM的LiCl的DMS0,使用含有IM的LiCl的异丙醇（异丙醇的纯度： 90% )，除此以外，与实施例2同样地操作，回收上清液（溶解液）。
[0096] 使用实施例2~6、比较例2中得到的上清液（溶解液），如上所述地进行 SDS-PAGE。电泳后，将凝胶用Oriole Fluorescent Gel Stain染色，将其结果示于图2和 图3。另外，通过用分析软件ImageLab(Bi〇-RAD Laboratories，Inc.)对染色后的蛋白的 电泳照片进行图像分析，求出目标蛋白（重组蛋白）的精制度。将其结果示于下表4。
[0097] 表 4
[0098]
[0099] 图2中，Lane M表不分子量标记物、Lane 1、2、3、4、5分别与实施例2、3、4、5、6对 应。图2中，用箭头表示的为与ADF3Kai-small-M(分子量为约12. 5kDa)对应的蛋白的条 带。从图2可知，通过用非质子性极性溶剂将表达亲水性指数为0以下的亲水性重组蛋白 的大肠杆菌溶解，将不溶物分离，能够将亲水性指数为0以下的亲水性重组蛋白部分精制。 图3中，Lane M表不分子量标记物、Lane 1与比较例2对应。图3中，用箭头表不的为与 ADF3Kai-small-M(分子量为约12. 5kDa)对应的蛋白的条带。
[0100] 从上述表4的结果可知，使用了 DMSO等非质子性极性溶剂的实施例中经部分精制 的目标重组蛛丝蛋白的纯度为使用了质子性极性溶剂异丙醇的比较例中经部分精制的目 标重组蛛丝蛋白的纯度的2. 2~3. 1倍，通过使用DMSO等非质子性极性溶剂，能够将亲水 性指数为〇以下的亲水性重组蛋白部分精制。
[0101] (实施例7)
[0102] 在表达Drosophila-Resilin-Kai蛋白的大肠杆菌的湿菌体约0. 3g中添加 Iml含 有IM的LiCl的DMS0,在60°C下静置30分钟，使其溶解。之后，用离心分离机（Τ0ΜΥ精工 公司制的"MX-305"）在20°C、11000Xg下离心分离5分钟，回收上清液（溶解液）。
[0103] (比较例3)
[0104] 在表达Drosophila-Resilin-Kai蛋白的大肠杆菌的湿菌体约0· 3g中添加 Iml的 Tris缓冲液（50mM Tris、IOOmM NaCl、pH为7.0)，超声破碎、得到超声破碎液。
[0105] 使用实施例7中得到的上清液（溶解液）和比较例3中得到的超声破碎液， 如上所述地进行SDS-PAGE。电泳后，将凝胶用Oriole Fluorescent Gel Stain染 色。用分析软件ImageLab (Bio-RAD Laboratories，Inc.)对染色后的蛋白的电泳照 片进行图像分析，求出目标蛋白（Drosophila-Resilin-Kai)的精制度。实施例7中， 目标蛋白（Drosophila-Resilin-Kai)的精制度为14. 5 %，而比较例3中目标蛋白 (Drosophila-Resilin-Kai)的精制度为 8. 0% 〇
[0106] (实施例8)
[0107] 在表达Collagen-type4_Kai蛋白的大肠杆菌的干燥菌体约0.1 g中添加 Iml含有 IM的LiCl的DMS0,在60°C下静置30分钟，使其溶解。之后，用离心分离机（Τ0ΜΥ精工公司 制的"MX-305"）在20°C、11000Xg下离心分离5分钟，回收上清液（溶解液）。
[0108] 使用实施例8中得到的上清液（溶解液）如上所述地进行SDS-PAGE。电泳后，将 凝胶用考马斯亮蓝（CBB)染色，将其结果示于图4。
[0109] 图4中，用箭头表示的为与Collagen-type4_Kai (分子量为约24. 5kDa)对应的蛋 白的条带。另外，用分析软件ImageLab(Bi〇-RAD Laboratories，Inc.)对染色后的蛋白的 电泳照片进行图像分析，结果目标蛋白（Collagen-type4_Kai)的精制度为11.6%。
[0110] 产业上的可利用性
[0111] 本发明能够用于从表达亲水性指数为〇以下的亲水性重组蛋白的宿主中将亲水 性重组蛋白部分精制。
[0112] 序列表自由文本
[0113] 序列号 1、2、3、6、8、10、12、13、15 :氨基酸序列
[0114] 序列号4、5、7、9、11、14 :碱基序列
【主权项】
1. 一种亲水性重组蛋白的部分精制方法，其为从表达亲水性重组蛋白的宿主中将亲水 性重组蛋白部分精制的方法，其特征在于，其包含在所述表达亲水性重组蛋白的宿主中添 加溶解用溶剂，使宿主细胞溶解，将不溶物分离来得到溶解液的溶解液获取工序； 其中，所述亲水性重组蛋白的亲水性指数为O以下，所述溶解用溶剂为非质子性极性 溶剂。2. 根据权利要求1所述的亲水性重组蛋白的部分精制方法，其中，所述溶解用溶剂的 偶极矩为3. OD以上。3. 根据权利要求1或2所述的亲水性重组蛋白的部分精制方法，其中，所述溶解用溶剂 为选自二甲基亚砜、N，N-二甲基甲酰胺、N，N-二甲基乙酰胺、1，3-二甲基-2-咪唑啉酮、和 N-甲基-2-吡咯烷酮中的一种以上非质子性极性溶剂。4. 根据权利要求1~3中任一项所述的亲水性重组蛋白的部分精制方法，其中，所述溶 解用溶剂为在所述非质子性极性溶剂中添加无机盐而成的溶剂。5. 根据权利要求1~4中任一项所述的亲水性重组蛋白的部分精制方法，其中，所述不 溶物的分离通过利用过滤的分离和/或离心分离来进行。6. 根据权利要求1~5中任一项所述的亲水性重组蛋白的部分精制方法，其中，所述 溶解用溶剂相对于所述宿主的质量以体积/质量比计添加〇. 5倍以上，其中体积的单位为 mL、质量的单位为g。7. 根据权利要求1~6中任一项所述的亲水性重组蛋白的部分精制方法，其中，将所述 溶解液用水系溶剂进行溶剂替换。8. 根据权利要求7所述的亲水性重组蛋白的部分精制方法，其中，将所述经溶剂替换 的溶解液进一步用选自柱、过滤、离心分离中的一种以上方法处理。9. 根据权利要求1~8中任一项所述的亲水性重组蛋白的部分精制方法，其中，所述亲 水性重组蛋白为选自重组蛛丝蛋白、重组节肢弹性蛋白和重组胶原中的一种蛋白。
【专利摘要】本发明涉及一种亲水性重组蛋白的部分精制方法，其为从表达亲水性重组蛋白的宿主中将亲水性重组蛋白部分精制的方法，其包含在上述表达亲水性重组蛋白的宿主中添加溶解用溶剂，使宿主细胞溶解，将不溶物分离来得到溶解液的溶解液获取工序；其中，上述亲水性重组蛋白的亲水性指数为0以下，上述溶解用溶剂为非质子性极性溶剂。上述溶解液优选用水系溶剂进行溶剂替换。
【IPC分类】C07K14/435, C12P21/02, C07K1/14
【公开号】CN104918950
【申请号】CN201380068309
【发明人】大泽利昭, 森田启介
【申请人】丝芭博株式会社
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2013年12月18日
【公告号】EP2940033A1, US20150344542, WO2014103847A1