亲水性重组蛋白的部分精制方法_2

文档序号:9203791阅读:来源:国知局
基以下、特别优选为12个残基以下。上述式1中,REP2为由10~200 个残基的氨基酸构成的氨基酸序列,上述氨基酸序列中所含的甘氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺、 脯氨酸及丙氨酸的总残基数相对于总氨基酸残基数为40%以上、优选为50%以上、更优选 为60%以上。
[0035] 大吐丝管拖丝中,上述REPl相当于纤维内形成晶体β折叠的晶体区域,上述 REP2相当于纤维内更具有柔软性且大部分缺乏整齐排列结构的无定型区域。并且,上述 [REP1-REP2]相当于由晶体区域和无定型区域构成的重复区域(反复序列),其为拖丝蛋白 的特征性序列。
[0036] 作为包含2个以上上述式I :REP1_REP2所示的氨基酸序列单元的多肽,可列举 出例如具有序列号1所示的氨基酸序列的ADF3来源的重组蛛丝蛋白。序列号1所示的氨 基酸序列为下述氨基酸序列:在从NCBI数据库获得的ADF3的部分氨基酸序列(NCBI的 Genebank的登录号:AAC47010、GI :1263287)的氨基酸序列的N末端添加由起始密码子、 HislO标签和HRV3C蛋白酶(Human rhinovirus 3C蛋白酶)识别位点构成的氨基酸序列 (序列号3)而成的氨基酸序列的第1个残基~第136个残基。作为编码具有序列号1所示 的氨基酸序列的ADF3来源的重组蛛丝蛋白的基因,可以使用由序列号4所示的碱基序列构 成的基因。另外,作为包含2个以上上述式I :REP1-REP2所示的氨基酸序列单元的多肽,还 可以使用由在序列号1所示的氨基酸序列中1个或多个氨基酸被替换、缺失、插入和/或添 加而成的氨基酸序列构成、具有由晶体区域和无定型区域构成的重复区域且HI为0以下的 多肽。其中,具有序列号1所示的氨基酸序列的多肽(ADF3Kai-small-M)的HI为一 0. 948。
[0037] 本发明中,"1个或多个"是指例如1~40个、1~35个、1~30个、1~25个、1~ 20个、1~15个、1~10个、或者1个或数个。另外,本发明中,"1个或数个"是指1~9 个、1~8个、1~7个、1~6个、1~5个、1~4个、1~3个、1~2个或1个。
[0038] 另外,作为包含2个以上上述式I :REP1_REP2所示的氨基酸序列单元的多肽,可 列举出例如具有序列号2所示的氨基酸序列的ADF3来源的重组蛋白。序列号2所示的氨 基酸序列为下述氨基酸序列:在从NCBI数据库获得的ADF3的部分氨基酸序列(NCBI的 Genebank的登录号:AAC47010、GI :1263287)的N末端添加由起始密码子、HislO标签及 HRV3C蛋白酶(人鼻病毒3C蛋白酶)识别位点构成的氨基酸序列(序列号3)而成的氨基 酸序列的第1个残基~第542个残基。作为编码具有序列号2所示的氨基酸序列的ADF3 来源的重组蛛丝蛋白的基因,可以使用由序列号5所示的碱基序列构成的基因。另外,作为 包含2个以上上述式I :REP1-REP2所示的氨基酸序列单元的多肽,还可以使用由在序列号 2所示的氨基酸序列中1个或多个氨基酸被替换、缺失、插入和/或添加而成的氨基酸序列 构成、具有由晶体区域和无定型区域构成的重复区域且HI为0以下的多肽。其中,具有序 列号2所示的氨基酸序列的多肽(ADF3Kai-NN)的HI为一 0. 92。
[0039] 另外,作为包含2个以上上述式I :REP1_REP2所示的氨基酸序列单元的多肽,可 列举出例如具有序列号6所示的氨基酸序列的ADF4来源的重组蛛丝蛋白。序列号6所示 的氨基酸序列为下述氨基酸序列:在从NCBI数据库获得的ADF4的部分氨基酸序列(NCBI 的Genebank的登录号:AAC47011、GI :1263289)的N末端添加由起始密码子、HislO标签及 HRV3C蛋白酶(人鼻病毒3C蛋白酶)识别位点构成的氨基酸序列(序列号3)而成的氨基 酸序列的第1个残基~第318个残基。作为编码具有序列号6所示的氨基酸序列的ADF4 来源的重组蛛丝蛋白的基因,可以使用由序列号7所示的碱基序列构成的基因。另外,作为 包含2个以上上述式I :REP1-REP2所示的氨基酸序列单元的多肽,还可以使用由在序列号 6所示的氨基酸序列中1个或多个氨基酸被替换、缺失、插入和/或添加而成的氨基酸序列 构成、具有由晶体区域和无定型区域构成的重复区域且HI为O以下的多肽。其中,具有序 列号6所示的氨基酸序列的多肽(ADF4Kai-W)的HI为一 0. 357。
[0040] 作为上述小吐丝管拖丝蛋白来源的重组蛛丝蛋白,可列举出包含式2: (Gly-Gly-Z) m (Gly-Ala) I (Ala)o所示的氨基酸序列的多肽。
[0041] 上述式2中,Z是指任意一种氨基酸,特别优选为选自Ala、Tyr和Gln中的一种氨 基酸。另外,m优选为1~4范围的整数、1优选为0~4范围的整数、〇优选为1~6范围 的整数。
[0042] 蛛丝中,小吐丝管拖丝从蜘蛛网的中心以螺旋状卷绕,其被用作网的补强材料或 者用作包裹所捕捉的猎物的丝。已知与大吐丝管拖丝相比,拉伸强度差但伸缩性高。这考 虑是由于在小吐丝管拖丝中,大量的晶体区域由甘氨酸与丙氨酸交替连接的区域形成,与 仅由丙氨酸形成晶体区域的大吐丝管拖丝相比,晶体区域的氢键更易于变弱的原因。
[0043] 作为上述横糸蛋白来源的重组蛛丝蛋白,可列举出包含式3 : (Gly-Pro-Gly-Gly-X) η所示的氨基酸序列的多肽。Gly-Pro-Gly-Gly-X所示的氨基酸序列 单元可以相同也可以不同。
[0044] 上述式3中,X是指任意一种氨基酸,特别优选为选自Ala、Ser、Tyr和Val中的一 种氨基酸。另外,η为4以上的整数、优选为10以上的整数、更优选为20以上的整数。
[0045] 作为包含上述式3 : (Gly-Pro-Gly-Gly-X)n所示的氨基酸序列的多肽,可列举出 例如具有序列号8所示的氨基酸序列的鞭毛状丝蛋白来源的重组蛋白。序列号8所示的 氨基酸序列为下述氨基酸序列:在从NCBI数据库获得的络新妇蛛的鞭毛状丝蛋白的部分 序列(NCBI的Genebank的登录号:AAF36090、GI :7106224)的相当于重复部分及基序的 第1220个残基~第1659个残基的氨基酸序列的N末端添加由起始密码子、HislO标签及 HRV3C蛋白酶识别位点构成的氨基酸序列(序列号3)而成的氨基酸序列。作为编码具有 序列号8所示的氨基酸序列的鞭毛状丝蛋白来源的重组蛛丝蛋白的基因,可以使用由序列 号9所示的碱基序列构成的基因。另外,作为包含上述式3 : (Gly-Pro-Gly-Gly-X)n所示 的氨基酸序列的多肽,可以使用由在序列号8所示的氨基酸序列中1个或多个氨基酸被替 换、缺失、插入和/或添加而成的氨基酸序列构成、具有由无定型区域构成的重复区域且HI 为〇以下的多肽。其中,具有序列号8所示的氨基酸序列的多肽(Flag92-sh〇rt2-UU)的HI 为一 0· 482。
[0046] 蛛丝中,横丝的一大特征是不具有晶体区域而具有由无定形区域构成的重复区 域。大吐丝管拖丝等中,由于具有由晶体区域和无定形区域构成的重复区域,因此推测同 时具有高的应力和伸缩性。另一方面,横丝虽然比大吐丝管拖丝的应力差,但具有高的伸缩 性。这考虑是由于横丝的大部分由无定形区域构成的原因。
[0047] 上述重组蛛丝蛋白优选为十字园蛛(Araneus diadematus)的两个主要拖丝蛋白 之一的ADF3来源的重组蛛丝蛋白。关于ADF3来源的重组蛛丝蛋白,作为其优点,还可列举 出强伸度和韧性基本上高、易于合成。
[0048] 作为重组节肢弹性蛋白,可以使用例如天然节肢弹性蛋白来源的重组节肢弹性蛋 白。作为天然节肢弹性蛋白来源的重组节肢弹性蛋白,优选包含多个式4 :REP3所示的氨基 酸序列单元、优选为4个以上、更优选为10个以上、进一步优选为20个以上的多肽。式4 中,REP3所示的氨基酸序列单元可以相同也可以不同。
[0049] 上述式4中,REP3是指由(Ser-J-J-Tyr-Gly-U-Pro)构成的氨基酸序列,J是指任 意一种氨基酸,特别优选选自Asp、Ser和Thr中的一种氨基酸。另外,U是指任意一种氨基 酸,特别优选选自Pro、Ala、Thr和Ser中的一种氨基酸。
[0050] 作为包含多个上述式4 :REP3所示的氨基酸序列单元的多肽,可列举出例如具有 序列号10所示的氨基酸序列的重组节肢弹性蛋白等。序列号10所示的氨基酸序列为下述 氨基酸序列:从NCBI的web数据库获得果蝇的节肢弹性蛋白的部分序列(NCBI的Genebank 的登录号:Q9V7U0. 1、GI :75026432),在该序列中相当于重复序列和基序的第19个残基~ 第321个残基的氨基酸序列的N末端添加由起始密码子、His6标签构成的氨基酸序列(序 列号12)而成的氨基酸序列。具有序列号10所示的氨基酸序列的重组节肢弹性蛋白的HI 为一 1. 229。另外,作为包含多个上述式4 :REP3所示的氨基酸序列单元的多肽,可以使用 由在序列号10所示的氨基酸序列中1个或多个氨基酸被替换、缺失、插入和/或添加而成 的氨基酸序列构成且HI为0以下的多肽。
[0051] 节肢弹性蛋白是存在于昆虫角质层的特定区域的橡胶样蛋白,是优异的弹性材 料。该物质的弹力(elasticity)据测为97%,|£藏能量中仅3%以热的形式损失。该弹力 考虑是由节肢弹性蛋白中的酪氨酸相互间交联所产生的。二酪氨酸交联而成的节肢弹性蛋 白赋予角质层以优异的弹性,在昆虫的飞行系统、跳跃系统中发挥重要的作用。
[0052] 作为重组胶原,可以使用例如天然胶原来源的重组胶原。作为天然胶原来源的重 组胶原,可列举出连续包含5个以上、优选8个以上、更优选10个以上式5 :REP4所示的氨 基酸序列单元的多肽。上述式5中,REP4是指由Gly-X-Y构成的氨基酸序列,X和Y是指除 Gly以外的任意一种氨基酸。上述式5中,REP4所示的氨基酸序列可以相同也可以不同。
[0053] 作为连续含有10个以上上述式5 :REP4所示的氨基酸序列单元的多肽,可列举出 例如具有序列号13所示的氨基酸序列的重组胶原。序列号13所示的氨基酸序列为下述 氨基酸序列:在从NCBI数据库获得的人的4型胶原的部分序列(NCBI的Genebank的登录 号:CAA56335. 1、GI :3702452)的相当于重复部分和基序的第301个残基~第540个残基的 氨基酸序列的N末端添加由起始密码子、His6标签和Ser-Ser-Gl
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