y-Ser-Ser构成的氨基酸 序列（序列号15)而成的氨基酸序列。具有序列号13所示的氨基酸序列的重组胶原的HI 为一 0. 792。另外，作为连续含有10个以上上述式5 :REP4所示的氨基酸序列单元的多肽， 还可以使用由在序列号13所示的氨基酸序列中1或多个氨基酸被替换、缺失、插入和/或 添加而成的氨基酸序列构成的多肽。
[0054] 胶原是构成真皮、韧带、肌腱、骨、软骨等的蛋白之一，是多细胞动物的细胞外基质 的主成分。人的胶原据报告有30种以上，但在任意胶原中，均具有被称为胶原样序列的 REP4所示的氨基酸序列的重复序列，这可列举为其序列特征。
[0055] 上述重组蛋白可使用采用含有编码重组蛋白的基因的表达载体进行了转化的 宿主来制造。基因的制造方法没有特别限制，从基因来源的细胞将编码重组蛋白的基因 通过聚合酶链反应（PCR)等进行扩增、克隆或进行化学合成。基因的化学合成方法也没 有特别限制，例如可以以重组蛋白的氨基酸序列信息为基础，用AKTA oligopilot plus 10/100(GEHealthcare Japan株式会社制）等将自动合成的寡核苷酸通过PCR等连接来合 成。此时，容易进行蛋白的精制和确认，因此可以合成编码由在上述对象蛋白的氨基酸序列 的N末端添加由His标签构成的氨基酸序列而成的氨基酸序列构成的蛋白的基因。
[0056] 作为上述表达载体，可以使用能够从DNA序列表达蛋白的质粒、嗤囷体、病毒等。 作为上述质粒型表达载体，只要在宿主细胞内能够表达目标基因且自身能够进行扩增即 可，没有特殊限定。例如作为宿主使用大肠杆菌R〇setta(DE3)时，可以使用pET22b (+)质粒 载体、pCold质粒载体等。其中，从蛋白生产率的观点出发，优选使用pET22b(+)质粒载体。 作为上述宿主（细胞），可以使用蛋白表达体系中使用的动物细胞、植物细胞、微生物等，从 生产成本的观点出发，优选使用微生物，从安全性和操作性的观点出发，更优选使用大肠杆 菌。
[0057] 当将大肠杆菌等微生物作为宿主进行重组蛋白生产时，从生产率的观点出发，上 述重组蛋白的分子量优选为500kDa以下、更优选为300kDa以下、进一步优选为200kDa以 下。
[0058] 通过对含有上述重组蛋白的溶解液进行溶剂替换可以进行进一步精制。溶剂替换 可以通过透析来进行。透析用的溶剂（透析液）可以使用含有水的水系溶剂。作为水系溶 剂，可列举出例如水、水与水混和性有机溶剂的混合液、水溶性缓冲液、酸性水溶液、碱性水 溶液等。作为水，可以使用例如纯水、蒸馏水、超纯水等。作为酸性水溶液，可列举出甲酸、 乙酸、稀盐酸等酸性水溶液，作为碱性水溶液，可列举出氢氧化钠水溶液、氢氧化钙水溶液 等碱性水溶液。作为水混和性有机溶剂，只要是能够与水混合的有机溶剂即可，可以使用公 知的有机溶剂。具体而言，可列举出甲醇、乙醇等醇类。
[0059] 当将含有上述重组蛋白的溶解液用水系溶剂进行溶剂替换时，上述非质子性极性 溶剂优选为不具有环状结构的非质子性极性溶剂。当使用不具有环状结构的非质子性极性 溶剂作为溶解用溶剂、并将含有重组蛋白的溶解液用水系溶剂进行溶剂替换时，能够以更 高的纯度提取重组蛛丝蛋白、重组节肢弹性蛋白、重组胶原等重组蛋白。作为不具有环状结 构的非质子性极性溶剂，可列举出二甲基亚砜（DMSO)、N, N-二甲基甲酰胺（DMF)和N, N-二 甲基乙酰胺（DMA)等。
[0060] 另外，经溶剂替换的溶解液还可以进一步通过选自柱、过滤、离心分离等中的一种 以上方法处理。柱可以使用凝胶过滤柱或离子交换柱等，过滤可以使用滤纸或过滤膜等。通 过上述处理，目标蛋白（亲水性重组蛋白）的精制度（纯度）进一步提高。
[0061] 实施例
[0062] 以下，用实施例对本发明进一步具体地进行说明。需要说明的是，本发明并不限于 下述实施例。
[0063] (大肠杆菌中的重组蛋白的表达）
[0064] 〈基因合成〉
[0065] (l)ADF3Kai-small_M 的基因的合成
[0066] 合成编码下述多肽的基因：从NCBI的web数据库获得作为十字园蛛的两种主要 的拖丝蛋白之一的ADF3的部分氨基酸序列（NCBI的Genebank的登录号：AAC47010、GI : 1263287)，在该序列的N末端添加由起始密码子、HislO标签和HRV3C蛋白酶（人鼻病毒3C 蛋白酶）识别位点构成的氨基酸序列（序列号3)，由该序列的第1个残基~第136个残基 的氨基酸（序列号1)构成的多肽。其结果，获得了导入了由序列号4所示的碱基序列构成 的ADF3Kai-small-M基因的pUC57载体（基因在5'末端紧接的上游具有Nde I位点、和在 5'末端紧接的下游具有Xba I位点）。其后，用Nde I和EcoR I对该基因进行限制酶处理， 然后重组到pET22b(+)表达载体中，得到导入了 ADF3Kai-small-M基因的pET22b(+)载体。 [0067] (2)Drosophila-Resilin-Kai 的基因的合成
[0068] 合成编码下述多肽的基因：从NCBI的web数据库获得果蝇的节肢弹性蛋白的部分 序列（NCBI的Genebank的登录号：Q9V7U0. 1、GI :75026432)，由在该序列中相当于重复部 分和基序的第19个残基~第321个残基的氨基酸序列的N末端添加由起始密码子和His6 标签构成的氨基酸序列（序列号12)而成的氨基酸序列（序列号10)构成的多肽。其结果， 获得了导入有由序列号11所示的碱基序列构成的Drosophila-Resilin-Kai基因的pUC57 载体（基因在5'末端紧接的上游具有Nde I位点、和在5'末端紧接的下游具有Xba I位 点）。其后，用Nde I和EcoR I对该基因进行限制酶处理，然后重组到pET22b(+)表达载体 中，得到导入了 Drosophila-Resilin-Kai 基因的 pET22b(+)载体。
[0069] (3)Collagen-type4_Kai 的基因的合成
[0070] 合成编码下述多肽的基因：从NCBI的web数据库获得人的4型胶原的部分序 列（NCBI的Genebank的登录号：CAA56335. 1、GI :3702452)，由在该序列中相当于重复 部分和基序的第301个残基~第540个残基的氨基酸序列的N末端添加由起始密码子、 His6标签和Ser-Ser-Gly-Ser-Ser构成的氨基酸序列（序列号15)而成的氨基酸序列 (序列号13)构成的多肽。其结果，获得了导入有由序列号14所示的碱基序列构成的 C〇llagen-type4-Kai基因的pUC57载体（基因在5'末端紧接的上游具有Nde I位点、和 在5'末端紧接的下游具有Xba I位点）。其后，用Nde I和EcoR I对该基因进行限制酶处 理，然后重组到pET22b (+)表达载体中，得到导入了 Collagen-type4-Kai基因的pET22b (+) 载体。
[0071] 〈蛋白的表达〉
[0072] 将导入有ADF3Kai-small_M基因的pET22b⑴表达载体、导入有 Drosophila-Resilin-Kai 基因的 pET22b(+)载体、导入有 Collagen-type4_Kai 基因 的pET22b(+)载体分别转化到大肠杆菌Rosetta(DE3)中。将得到的单菌落在含有氨苄 青霉素的2mL的LB培养基中培养15小时后，将该培养液I. 4ml添加到含有氨苄青霉素 的HOmL的LB培养基中，在37°C、200rpm的条件下进行培养，直至培养液的0D_达到 3. 5。接着，将0D_为3. 5的培养液与50%葡萄糖HOmL -起加入到含有氨苄青霉素的 7L的2XYT培养基中进一步进行培养，直至OD6tltl达到4. 0。其后，向得到的OD 6QQ为4. 0 的培养液中添加异丙基-β -硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG)，使终浓度达到0. 5mM，诱导蛋 白表达。在IPTG添加后经过2小时的时刻，将培养液离心分离，回收菌体（湿菌体）。使 用由IPTG添加前和IPTG添加后的培养液中的菌体制备的蛋白溶液，按照通常的操作规 程用SDS-PAGE确认了依赖于IPTG添加的目标蛋白（ADF3Kai-smalI-M为约12. 5kDa、 Drosophila-Resilin-Kai 为约 28. 5kDa、Collagen-type4_Kai 为约 24. 5kDa)的表达。 ADF3Kai-small_M蛋白的亲水性指数为一 0· 948、Drosophila-Resilin-Kai的亲水性指数 为一 1. 229、Collagen-type4-Kai 的亲水性指数为一 0· 792。将表达 ADF3Kai-small-M 蛋 白的大肠杆菌、表达Drosophila-Resilin-Kai蛋白的大肠杆菌、表达Collagen-type4_Kai 蛋白的大肠杆菌保存在冰箱（一 20°C )中。
[0073] (实施例1)
[0074](蛋白的精制）
[0075] (1)在表达ADF3Kai-small_M蛋白的大肠杆菌的湿菌体约15g中添加45ml含有 IM的LiCl的DMS0,在60°C下使其溶解30分钟。之后，用离心分离机（Τ0ΜΥ精工公司制的 "MX-305"）在20°C、11000Xg下离心分离10分钟，回收上清液（溶解液）。
[0076] (2)通过对回收的溶解液进行透析，进行DMSO与水的溶剂替换。每隔6小时交换 透析液（水），总共进行48小时透析。将透析后的溶解液用离心分离机（Τ0ΜΥ精工公司制 的"MX-305"）在20°C、11000Xg下离心分离10分钟，回收上清液（溶剂替换后的溶解液）。
[0077] (3)在溶剂替换后的溶解液40ml中加入50体积％的Ni树脂（与His结合）的 浆料2ml，在室温下振荡1小时。接着，将Ni树脂回收，用洗脱缓冲液（50mM Tris、50mM NaCl) IOml洗涤5次，然后用300mM的咪唑使目标蛋白（ADF3Kai-small-M)洗脱，回收洗脱 液。
[0078] (比较例1)
[0079] 在表达ADF3Kai-small_M蛋白的大肠杆菌的湿菌体约0· 2g中加入纯水500 μ 1，超 声破碎、得到超声破碎液。
[0080] 使用实施例1中得到的溶解液、溶剂替换后的溶解液和柱洗脱液、以及比较例 1中得到的超声破碎液进行SDS-PA