专利名称：高亲和性白细胞介素－4突变蛋白质的制作方法
背景1．发明领域概括地说，本发明涉及药物学和免疫学领域。更明确一些，本发明涉及细胞因子家族的新型变异体，特别是人体白细胞介素-4(IL-4)。
2．相关技术说明白细胞介素-4是一种由活化T细胞(Howard et al.,J.Exp.Med.155:914(1982))、肥大细胞(Brown et al.,Cell50:809(1987))及嗜碱粒细胞(Seder et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:2835(1991))分泌的15kDa糖蛋白，它在造血及非造血细胞中调节着多种细胞功能。IL-4的序列已在美国专利第5,017,691号中公开。白细胞介素-4(IL-4)是一种多效性细胞因子，它对免疫系统、内皮、以及那些成纤维细胞性的细胞均具有活性。现已报道的IL-4体外给药效果包括，T细胞和B细胞的增殖、B细胞中免疫球蛋白的类别转换、刺激内皮细胞中细胞表面粘附分子的生成、以及刺激IL-6的释放。T细胞中，IL-4在以有丝分裂原预活化后刺激T细胞的增殖并下调IFN-γ的生成。在单核细胞中，IL-4诱导Ⅱ类MHC分子的表达、由脂多糖诱导的tPA的释放、以及CD23的表达。在内皮细胞(EC)中，IL-4诱导VCAM-1的表达和IL-6的释放。IL-4降低ICAM-1的表达。Maher,DW,et al.，人体白细胞介素-4一种具有治疗应用潜力的免疫调节剂，Progess in Growth Factor Research,3:43-56(1991)。
鉴于其能够刺激通过与IL-2接触而被活化的T细胞的增殖这一能力，IL-4治疗法一直得以研究应用。例如，IL-4在肾癌的动物模型中显示出其抗瘤活性并在小鼠中诱导肿瘤消退(Bosco,M.,et al.，通过外淋巴注射施于带有肿瘤的小鼠的低剂量IL-4可抑制不健康、外观上不产生免疫反应的肿瘤的生长并诱导一种肿瘤特异免疫记忆，J.Immunol.145:3136-43(1990))。但是，它的毒性限制了在人体中使用的剂量(Margolin,K,et al.，晚期肾癌和恶性黑素瘤中重组人白细胞介素-4的Ⅱ期研究，Immunotherapy15:147-153(1994))。
目前，对于IL-4的一般结构和功能以及相关的具有四个反向平行α-螺旋结构域(A-D)的单体配体已经了解。IL-4的三维结构已被阐明(Powers et al.,Science256:1673(1992))。该蛋白包含四个左手α-螺旋和两个b-折叠。
IL-4的受体至少包含两条链。第一条IL-4R链，即IL-4Rα，与IL-2R的b链以及生长因子受体超家族中的其它成员具有相当的同源性(Ldzerda et al.,J.Exp.Med.171:861(1990))。第二条IL-4R链已经被确认，它即为IL-2R链，或所谓“共同链”γc(Russell et al.,Science262:1877(1993))。这两个结合部位很可能参与一个顺序发生的两次结合作用，从而产生一个1∶1∶1三元复合物。IL-4中可能负责与IL-4Rα结合的区域被认为位于螺旋A或C或者同时在螺旋A和C上，而与gc发生相互作用的区域被认为位于D螺旋上。本理论认为，第一个结合作用涉及与主要结合组份IL-4Rα相接触的配体。该作用不与任何细胞信号活性相关联。第二个结合作用在IL-4/IL-4Rα复合物补充了第二条链gc时发生。在此第二结合作用发生之后，出现信号，细胞活性得以建立。当由第二区域(细胞活性所需)介导的结合作用被减少或消除时，便会出现野生型IL-4的拮抗作用，但又同时保持着与IL-4Rα的结合。当所定配体通过第一和第二区域在结构上与两个受体组份作用时，便发生激动作用。
关于IL-4的拮抗物已有文献报道。具有拮抗功能的IL-4的突变包括IL-4拮抗物突变蛋白质IL-4/Y124D(Kruse,N.,Tony,H.P.,Sedald,W.，单一氨基酸替换引起的人体白细胞介素-4向一种高亲和拮抗物的转化，Embo J.11:3237-44,1992)和一种双突变蛋白质IL-4[R121D/Y124D](Tony,H.,et al.，用于高度有效地抑制T细胞和B细胞中白细胞介素-4依赖性和白细胞介素-13依赖性反应的人体白细胞介素-4拮抗物的设计，Eur.J.Biochem.225:659-664(1994))。该单一突变蛋白质是D螺旋上位置124处酪氨酸被天冬氨酸代替的取代物。该双突变蛋白质是D螺旋上位置121处精氨酸被天冬氨酸代替、位置124处酪氨酸被天冬氨酸代替的取代物。D螺旋上这一部分的变异实际上与第二结合区域中相互作用的变化相关联。
显示野生型IL-4激动性或拮抗性的IL-4突变变异体可能有益于治疗与IL-4的某种多效性效果相关的病症。例如，IL-4的拮抗物有助于治疗那些由于IL-4的产生而加重的病症，如哮喘、过敏或其它与炎症反应相关的病症。IL-4的激动剂可能有益于治疗那些IL-4的存在与病势的好转或减弱相关的病症，例如类风湿性关节炎、多发性硬化症、胰岛素依赖性糖尿病等自身免疫疾病。这些自身免疫疾病以T辅助细胞群1型和2型(Th1,Th2)生成时的极化现象为特征。不成熟CD4+T细胞依靠刺激过程中出现的细胞因子分化成Th1或Th2小集团。一种IL-4激动剂可以理想地将分化转向产生所需的T辅助细胞，即转向Th2，从而使其具有治疗效果。
PCT/US93/03613公开了一种IL-4变异体，该变异体在一个α-螺旋区域中具有Phe-Leu或Tyr-Leu序列，并在位于最接近Phe-Leu或Tyr-Leu序列的上游或下游处的两个氨基酸中，有一个带负电荷的氨基酸；该变异体由于一个中性氨基酸被取代成为带负电荷的氨基酸而对IL-4受体具有更强的亲和力。同时公开的还有，IL-4的一个α-螺旋上Trp-Leu或Phe-Leu被两个带负电荷的残基特异性取代导致更强的亲和性。该变异体是一种IL-4融合蛋白(具有白喉毒素)。
发明概述本发明涉及根据野生型IL-4编号的重组人体IL-4突变蛋白质，该突变蛋白质在野生型IL-4的A或Cα-螺旋链的结合表面至少包含一个氨基酸取代，从而使该突变蛋白质以至少比天然IL-4更高的亲和力与IL-4Rα受体结合。取代优选选自A-螺旋上的位置13和16，以及C-螺旋上的位置81和89。一个更优选的实施方案是位置13上Thr被取代为Asp的重组人体IL-4突变蛋白质。本发明中也对药用组合物、为突变蛋白质编码的氨基酸和多核苷酸序列、转化宿主细胞、突变蛋白质的抗体、以及治疗方法进行了说明。
本发明还涉及确定一种突变蛋白质与某种受体结合能力的测定方法，该方法包括以下步骤第一，将一种受体链的结合部分导入包被有链霉亲和素的闪蒸平板(FlashPlate)，该受体链的结合部分有一个能够被链霉亲和素结合的肽末端；第二，将一个经放射性标记的天然配体导入闪蒸平板，该天然配体对受体链的结合部分具有亲和性；第三，将对受体链的结合部分具有亲和性的突变蛋白质配体导入闪蒸平板；达到平衡后测定闪蒸平板发出的信号量；最后，计算突变蛋白质配体相对于天然配体的相对亲和性。在一个优选的实施方案中本方法使用IL-4Rα受体链。
本发明还涉及根据野生型IL-4编号的重组人体IL-4拮抗物突变蛋白质，该突变蛋白质包括(a)野生型IL-4D-螺旋链上的两个取代R121D和Y124D；(b)在野生型IL-4的A或Cα-螺旋链的结合表面至少有一个氨基酸取代，从而使该突变蛋白质以至少比天然IL-4更高的亲和力与IL-4Rα受体结合。取代选自A-螺旋上的位置13和16，以及C-螺旋上的位置81和89。一个更优选的实施方案是位置13上Thr被取代为Asp的重组人体IL-4拮抗物突变蛋白质。本发明中也对药用组合物、为突变蛋白质编码的氨基酸和多核苷酸序列、转化宿主细胞、突变蛋白质的抗体、以及治疗方法进行了说明。
插图简要说明
图1为IL-4配体/受体结构的示意图。IL-4是一种四螺旋束蛋白，四个螺旋在此以端视图示出(A、B、C和D，分别自N-末端至C-末端)。IL-4受体的主要结合组份为IL-4Rα，它通过IL-4的A-和C-螺旋与IL-4配体发生作用。三元复合物IL-4/IL-4Rα/IL-4Rγ的形成在靶细胞中诱发信号。
图2为T13D-IL-4[R121D/Y124D]竞争性结合的X-Y曲线图。图中示出了T13D-IL-4[R121D/Y124D]“·”在固相结合测定中相对于IL-4[R121D/Y124D]“o”与125I-IL-4竞争的能力。用本测定方法确定的T13D-IL-4[R121D/Y124D]的Kd为0.28nM,IL-4[R121D/Y124D]的Kd为5.0nM。
图3为类似的X-Y曲线图，它描绘了由T13D-IL-4[R121D/Y124D]“o”产生的IL-4的拮抗性。图中示出了T13D-IL-4[R121D/Y124D]相对于IL-4[R121D/Y124D]“·”对IL-4诱发PHA母细胞增殖的竞争能力。用本测定方法确定的T13D-IL-4[R121D/Y124D]的IC50为2nM,IL-4[R121D/Y124D]的IC50为13nM。
图4为sIL-4Rα-STX的氨基酸序列表。
图5为T13D-IL-4突变蛋白质的组成序列表。
图6为T13D-IL-4[R121D/Y124D]突变蛋白质的组成序列表。
优选实施方案的说明以下描述的是一些新型突变蛋白质以及获得对于野生型IL-4受体具有较高亲和性的新型IL-4突变蛋白质的方法。
以下使用的“野生型IL-4”或“wtIL-4”表示天然或重组的人体白细胞介素-4。正如美国专利第5,017,691号所公开的，它具有天然人体IL-4中正常出现的129个氨基酸序列。该专利在此引入作为参考。
以下使用的“IL-4突变蛋白质”表示一种多肽，在此多肽上对人体成熟白细胞介素-4蛋白质进行了特异性氨基酸取代。具体地说，对A-或C-螺旋、或更优选的是对那些组成其结合表面的氨基酸进行了特异性氨基酸取代。A螺旋的结合表面一般大约位于氨基酸位置5到16之间，而在C螺旋中大约在位置77到89之间。对于这些螺旋链的改变增加了所得突变蛋白质对IL-4Rα的亲和性。根据分子附加取代最终性质的不同，该突变蛋白质可能是wtIL-4的激动剂或者拮抗物。
以下使用的“IL-4拮抗物突变蛋白质”表示一种多肽，在此多肽上对人体成熟白细胞介素-4蛋白质进行了特异性氨基酸取代。具体地说，以下所述的拮抗物突变蛋白质至少包含三个独立的取代。成对取代“IL-4[R121D/Y124D]”存在于以下所含的所有拮抗物突变蛋白质之中且涉及D螺旋中主链的成对取代，即R121D(Arg成为Asp)和Y124D(Tyr成为Asp)。此外，在A螺旋或C螺旋的结合表面上能够提高突变蛋白质对受体α链亲和性的位置导入了第三个取代。除了这些变化之外，最优选的IL-4拮抗物突变蛋白质具有一个在其它未取代残基处与野生型IL-4相同的氨基酸序列。
本发明中IL-4突变蛋白质的特征还包括，天然IL-4多肽链的其它残基的一个或多个位点上氨基酸的插入、缺失、取代和修饰。按照本发明，任何上述插入、缺失、取代和修饰都应该生成一种保持其IL-4相关活性的IL-4突变蛋白质。
在IL-4的其它位置(即那些对突变蛋白质二级和三级结构具有微小影响的位置)，我们推荐保守性修饰和取代。这种保守性取代包括Dayhoff在蛋白质序列和结构图谱(The Atlas of Protein Sequence andStructure)5(1978)和Argos在EMBO J.,8:779-785(1989)中描述的那些。例如，属于以下各组的氨基酸代表保守性变化-ala、pro、gly、gln、asn、ser、thr；-cys、ser、tyr、thr；-val、ile、leu、met、ala、phe；-lys、arg、his；-phe、tyr、trp、his；和-asp、glu、tyr。
我们也推荐不给位点带来额外分子间交叉偶联或错误二硫键形成的修饰和取代。例如，已知IL-4在野生型位置3、24、46、65、99和127处有六个cys残基，其中一个或多个可能参与交叉偶联作用。取代的选择应尽可能保持野生型蛋白质的三级结构。
我们使用“根据野生型IL-4编号”表示对于某选定氨基酸中位置的确定，野生型IL-4中该氨基酸通常出现这一位置。例如，本领域技术人员会注意到，在对IL-4拮抗物突变蛋白质引入插入或缺失的地方，当根据野生型IL-4编号时，通常出现在位置125的Ser(S)在突变蛋白质中可能发生移位。然而，移动后Ser(S)的位置可以很容易地通过检查以及其侧翼氨基酸与野生型IL-4中侧翼Ser的相互关系得到确定。
本发明的IL-4突变蛋白质可通过本领域已知的任何适当方法得到。这些方法包括构建一个为本发明中IL-4突变蛋白质编码的DNA序列，然后在经过适当转化的宿主中表达这些DNA序列。这一方法可生成本发明的重组体突变蛋白质。然而，虽然不是最优选，本发明的突变蛋白质也可通过化学合成、或化学合成与重组DNA技术结合的方式生成。
在一个生成本发明突变蛋白质的重组法实施方案中，DNA序列的构建通过分离或合成一个为野生型IL-4编码的DNA序列来完成，然后将苏氨酸-13的密码子通过位点特异性诱变改为天冬氨酸的密码子。这一技术众所周知。例如，可参照Mark et al.，人体成纤维细胞干扰素基因的位点特异性诱变，Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:5662-66(1984)；美国专利第4,588,585号，在此引入作为参考。
构建为本发明中IL-4突变蛋白质编码的DNA序列的另一个方法是化学合成。例如，一个为所需IL-4突变蛋白质编码的基因可以利用寡聚核苷酸合成仪以化学方式合成。该寡聚核苷酸根据所需IL-4突变蛋白质的氨基酸序列设计，同时，优选选择用于产生重组突变蛋白质的宿主细胞的优势密码子。在这方面，遗传密码众所周知是简并的-即一个氨基酸可能由多个密码子编码。例如，Phe(F)由两个密码子编码，TTC或TTT；Tyr(Y)以TAC或TAT编码；His(H)以CAC或CAT编码。Trp(W)以单一密码子TGG编码。相应地也可以看到，对于某个为特定IL-4突变蛋白质编码的DNA序列，会有许多DNA简并序列为同一IL-4突变蛋白质编码。例如，可以看到，除了SEQ ID NO:9中表示的突变蛋白质T13D-IL-4[R121D/Y124D]的优选DNA序列以外，还有许多简并DNA序列为所示的IL-4突变蛋白质编码。我们认为这些简并DNA序列在本发明范围之内。因此，本发明文字记述中的“有关的简并变异型”表示所有为某一特定突变蛋白质编码的DNA序列。
本发明中为IL-4突变蛋白质编码的DNA序列，无论是通过定点诱变、化学合成、还是其它方法制备而成，都可能包含或不包含一个为信号序列编码的DNA序列。如果存在，这个信号序列应该是一个被选用进行IL-4突变蛋白质表达的细胞所能够识别的序列。它可以是原核的、真核的、或是两者的组合。它也可以是天然IL-4突变蛋白质的信号序列。信号序列的包含与否取决于IL-4突变蛋白质是否需要从产生它的重组细胞中分泌出来。如果选定的细胞是原核的，DNA序列一般优选不用于信号序列的编码，但是包括一个指导表达的N-末端甲硫氨酸。如果选定的细胞是真核的，一般优选有一个信号序列被编码，最优选的是使用野生型IL-4的信号序列。
按照本发明合成一个为IL-4突变蛋白质编码的基因时，可以利用标准的方法。例如，完整的氨基酸序列可以用于建立一个反向翻译基因(back-translated gene)。可以合成一个包含为IL-4突变蛋白质编码的核苷酸序列的DNA寡聚物。例如，可以合成几个为所需多肽中特定部分编码的小寡聚核苷酸，然后将它们连接起来。每个单独的寡聚核苷酸通常包含5′或3′突出端，用于互补装配。
本发明中为IL-4突变蛋白质编码的DNA序列一旦(通过合成、定点诱变或其它方法)装配后，即被插入一个表达载体，然后在所需的转化宿主中与适于IL-4突变蛋白质表达的表达控制序列有效地连接在一起。适当的装配通过核苷酸测序、限制性酶切图谱、以及在适当宿主中一个具生物活性的多肽的表达得以确认。本领域众所周知，要想在一个宿主中得到一个转染基因的高表达水平，就必须将这个基因有效地连接到能够在所选宿主中起作用的转录和转译表达控制序列上。
表达控制序列和表达载体的选择取决于宿主的选择。可以使用多种不同的表达宿主/载体组合。譬如，原核宿主的有效表达载体包括含有来自SV40、牛乳头瘤病毒、腺病毒和细胞肥大病毒的表达控制序列的载体。细菌宿主的有效表达载体包括已知的细菌质粒，如大肠杆菌质粒(包括col El、pCR1、pER32z、pMB9以及它们的衍生物)、宿主范围更广的质粒，如RP4、噬菌体DNAs(如λ噬菌体的多种衍生物，如NM989)、以及其它DNA噬菌体，如MI3和丝状单链DNA噬菌体。酵母细胞的有效表达载体包括2m质粒及其相关的衍生物。昆虫细胞的有效表达载体包括pVL941。我们推荐使用pFastBacTM1(GibcoBRL,Gaithersburg,MD)。Cate et al.，牛和人体缪勒氏抑制物质基因的分离以及人体基因在动物细胞中的表达，Cell,45,pp.685-98(1986)。
此外，多种表达控制序列中的任何一种都可用于这些载体。这些有效表达控制序列包括与前述表达载体的结构基因相关的表达控制序列。例如，有效表达控制序列的范例包括，SV40或腺病毒的早期和晚期启动子、lac系统、trp系统、TAC或TRC系统、λ噬菌体的主要操纵子和启动子区域，如PL、fd衣壳蛋白的控制区域、3-磷酸甘油酸激酶或其它糖酵解酶的启动子、酸性磷酸酶的启动子如PhoA、酵母a-接合系统的启动子、杆状病毒的多角体启动子、以及其它已知的、控制原核或真核细胞或它们的病毒的基因表达的序列及其各种组合体。
任何合适的宿主都可用于生成本发明的IL-4突变蛋白质，其中包括细菌、真菌(包括酵母)、植物、昆虫、哺乳动物或其它合适的动物细胞或细胞系，以及转基因动物或植物。更具体地讲，这些宿主可以包括众所周知的真核和原核宿主，如大肠杆菌、假单胞菌、芽孢杆菌、链霉菌、真菌、酵母、昆虫细胞如Spodoptera frugiperda(SF9)、动物细胞如中国仓鼠卵巢(CHO)和小鼠细胞如NS/O、非洲绿猴细胞如COS1、COS7、BSC1、BSC40和BNT10、人体细胞、以及组织培养的植物细胞。对于动物细胞的表达，我们推荐在培养中使用CHO细胞和COS7细胞，特别是使用CHO细胞系的CHO(DHFR-)。
当然应该明白，在表达所述DNA序列时，不是所有的载体和表达控制序列都能起到同样好的作用。也不是所有宿主都对同一表达系统起着同样好的作用。但是，技术人员无需试验，在这些载体、表达控制序列和宿主中做出适当的选择。例如，选择载体时，必须同时考虑宿主，因为载体必须在宿主中复制。载体的拷贝数量、控制该拷贝数量的能力、以及被载体编码的任何其它蛋白质，如抗生素标记的表达也应该加以考虑。譬如，本发明中优选使用的载体包括那些允许为IL-4突变蛋白质编码的DNA在拷贝数量上得以扩增的载体。这些可扩增型载体在本技术领域中众所周知。譬如，它们包括能够通过DHFR扩增而得到扩增的载体(例如参照Kaufman，美国专利第4,470,461号，Kaufmanand Sharp，模式二氢叶酸还原酶cDNA基因的构建用于有效表达的信号分析，Mol.Cell.Biol.,2:1304-19(1982))，或谷氨酰胺合酶(“GS”)扩增(例如参照美国专利第5,122,464号和欧洲公开申请EPO338841)。
选择表达控制序列时，应考虑一系列因素。譬如，它们包括序列的相对强度、它的可控制性、以及它与本发明中为IL-4突变蛋白质编码的实际DNA序列的相容性等。特别在考虑潜在的二级结构时更是如此。宿主选择应考虑它们与所选载体的兼容性、由本发明中DNA序列编码的产物的毒性、它们的分泌特征、它们准确折叠多肽的能力、它们的发酵或培养要求、以及由DNA序列编码的产物纯化的便利性。
从这些参数中，本领域技术人员能够选出各种载体/表达控制序列/宿主的组合，这些组合将在发酵或大规模动物培养时表达所需DNA序列，譬如，利用CHO细胞或COS7细胞进行表达。
根据本发明得到的IL-4突变蛋白质，可根据用以产生突变蛋白质的宿主有机体的不同而糖基化或非糖基化。如果细菌被选择作为宿主，生成的IL-4突变蛋白质就会是非糖基化。与此相反，真核细胞会使IL-4突变蛋白质糖基化，尽管也许与天然IL-4的糖基化方式不同。
由转化的宿主产生的IL-4突变蛋白质可根据任何适当方法得到纯化。现已知有各种方法可以纯化IL-4。例如参照美国专利第5,013,824号、第5,017,691号和WO9604306-A2。我们推荐使用免疫亲和纯化法。例如参照Okamura et al.，人体类成纤维细胞干扰素免疫吸附柱层析和N-末端氨基酸序列，Biochem,19:3831-35(1980)。
本发明的IL-4突变蛋白质的生物活性，可以通过本领域中任何已知合适方法进行测定。测定包括在EP-B1-41313中所描述的抗病毒活性的抗体中和、蛋白激酶、寡腺苷酸2,5-A合酶或磷酸二酯酶活性的诱导。测定还包括免疫调节测定(例如参照美国专利第4,753,795号)、生长抑制测定、T细胞增殖、IL-6的诱导和内皮细胞中MCP-1的诱导、以及测定与表达白细胞介素-4受体的细胞的结合。同时参照Spits H,Yssel H,Takebe Y,et al.，重组白细胞介素-4促进人体T细胞的生长，J.Immunol.139:1142-47(1987)。
本发明的IL-4突变蛋白质的给药剂量大约与野生型天然或重组IL-4用于治疗时的剂量相同或更大。优选给予有效量的IL-4突变蛋白质。“有效量”表示能够防止或减轻所治疗病症或适应症的严重程度或扩散的药量。对于本领域技术人员来说很显然，IL-4突变蛋白质的有效量特别取决于疾病、剂量、IL-4突变蛋白质的给药时间计划、IL-4突变蛋白质单独使用还是与其它治疗药剂结合使用、组合物在血清中的半衰期、以及患者的一般健康状况。
优选以包含可药用载剂的组合物形式给予IL-4突变蛋白质。“可药用载剂”表示在给药患者中不引起任何不适当作用的载剂。这些可药用的载剂在本领域中众所周知。我们推荐pH7.0下使用2％HSA/PBS。
本发明中的IL-4突变蛋白质可以通过众所周知的方法配制成药用组合物。例如，在此作为参考收入的E.W.Martin的Remington′sPharmaceutical Science中描述了合适的制剂。IL-4突变蛋白质的药用组合物可配制成各种类型，包括液体、凝胶体、冻干或其它合适形式。优选形式取决于所治疗的特殊病症，对本领域技术人员是显而易见的。
IL-4突变蛋白质的药用组合物可通过口服、喷雾、静脉、肌肉、腹膜内、皮内或皮下注射、或其它认可的方式给予。优选给药方式取决于所治疗的特殊病症，而且对本领域技术人员是很显然的。IL-4突变蛋白质的药用组合物可以与其它治疗药剂结合使用。这些药剂可以作为同一药用组合物的一部分加入，也可以与IL-4突变蛋白质分开，同时或按照任何其它认可的时间计划单独给予。此外，IL-4突变蛋白质的药用组合物可作为其它疗法的添加剂使用。
因此，本发明提供了治疗免疫性疾病、癌症或肿瘤、异常细胞生长、或对任何合适动物进行免疫调节的组合物和方法，所述动物优选为哺乳动物，最优选人。如同前面背景一节所述，IL-4具有多种作用。其中包括T细胞增殖和T辅助细胞分化的刺激、人体B-细胞活化及增殖、以及淋巴因子指导的免疫球蛋白类别转换的诱导。对淋巴系统的作用包括提高B细胞上MHCⅡ型抗原的表达(Noelle,R.,et al.，静止B细胞Ia抗原表达的提高B细胞生长因子的新作用，PNAS USA,81:6149-53(1984))和CD23的表达(Kikutani,H.,et al.,人体淋巴细胞免疫球蛋白受体的分子结构，Cell47:657-61(1986))。由此，IL-4生物学表明，它在包括哮喘的过敏症及过敏性炎症疾病的发病中可能起着重要的作用。T辅助细胞1型(Th1)和2型(Th2)参与免疫反应。受到刺激的Th2细胞可分泌IL-4，阻止Th1的进展。任何与Th2关联的疾病都可以用IL-4拮抗物加以控制，而任何与Th1关联的疾病都可以用IL-4激动剂加以控制。
另一个预想是将为本发明中IL-4突变蛋白质编码的DNA序列用于基因疗法应用。预想的IL-4拮抗物基因疗法应用包括对那些可能由IL-4引起或加重的现有临床病症，如与炎症相关的病症(哮喘)或过敏症的治疗。激动剂的适用症包括类风湿性关节炎、多发性硬化症、胰岛素依赖性糖尿病等自身免疫病症。这些自身免疫病症的特征是T辅助细胞群体生成时向着1型T辅助细胞(Th1)生成的极化。
通过基因治疗的局部施用拮抗物或激动剂IL-4突变蛋白质可以向靶区域提供治疗性药剂，同时也可避免与激动剂的非特异性给药相关的潜在毒性问题。体外和体内的基因疗法方法都已有所预想。现已知有几种将具有潜在疗效的基因转移到特定细胞群体的方法。例如参照Mulligan，基因疗法的基础科学，Science,260:926-31(1993)。这些方法包括1)直接基因转移。例如参照Wolff et al.,活体内向小鼠肌肉的直接基因转移，Science,247:1465-68(1990)；2)脂质体介导的DNA转移。例如参照Caplen et al.，向囊纤维变性患者鼻上皮的脂质体介导CFTR基因转移，Nature Med.3:39-46(1995)；Crystal，作为药物的基因，Nature Med.1:15-17(1995)；Gao和Huang，用于哺乳动物细胞有效转染的新型阳离子脂质体试剂，Biochem.Biophys.Res.Comm.,179:280-85(1991)；3)逆转录病毒介导的DNA转移。例如参照Kay et al.，血友病B的体内基因疗法IX-因子缺乏犬中的持久局部修正，Science,262:117-19(1993)；Anderson，人体基因疗法，Science,256:808-13(1992)。
4)DNA病毒介导的DNA转移。这些DNA病毒包括腺病毒(优选以Ad-2或Ad-5为基础的载体)、疱疹病毒(优选以单纯疱疹病毒为基础的载体)、以及细小病毒(优选以“缺陷性”或非自发性细小病毒为基础的载体，更优选以腺相关病毒为基础的载体，最优选以AAV-2为基础的载体)。例如参照Ali et al.,DNA病毒作为基因疗法载体的利用，Gene Therapy,1:367-84(1 994)；在此作为参考收入的美国专利第4,797,368号；和在此作为参考收入的美国专利第5,139,941号。
对用于感兴趣基因转移的一个特定载体系统的选择取决于多种因素。一个重要的因素是靶细胞群的性质。尽管对逆转录病毒已有深入研究，而且已用于多种基因疗法的应用，但是这些载体一般不适合用于非分裂性细胞的感染。此外，逆转录病毒似乎具有潜在的致肿瘤性。
腺病毒具有优势，他们拥有广泛的宿主范围，能够感染静止或末期分化的细胞，如神经元或肝细胞，而且似乎基本属于非致肿瘤性。例如参照Ali et al.，同上，p.367。腺病毒似乎不与宿主基因组整合。因为它们存在于染色体外，所以发生插入诱变的危险得到大幅度降低。Ali et al.，同上，p.373。
腺相关病毒显示出与以腺病毒为基础的载体相似的优点。然而，AAVs显示了对人体染色体19的位点特异性整合。Ali et al.，同上，p.377。
根据这一实施方案，在诊断时或诊断后立即向需要的患者提供本发明IL-4突变蛋白质编码DNA的基因疗法。
本领域技术人员会认识到，任何适当的、包含IL-4突变蛋白质的DNA的基因治疗载体都可以按照这一实施方案使用。构建所述载体的技术方法已有所知。例如参照Ohno et al.，同上，p.784；Chang et al.，同上p.522。含有IL-4突变蛋白质DNA的载体向靶位点的引入，可通过已知技术，如Ohno et al.，同上，p.784中所描述的技术完成。
为了更好地理解本发明，以下举出一些例子。这些例子仅用于解释目的，而不应以任何方式被解释为对本发明范围的限制。
实施例概况丙氨酸取代通过定点诱变引入野生型IL-4序列，取代位置与预测位于IL-4A-或C-螺旋表面的残基相对应(Smith LJ；Redfield C；Boyd J；Lawrence GM；Edwards RG；Smith RA和Dobson CM)，人体白细胞介素4。四螺旋束蛋白质的溶液结构，J.Mol.Biol.,224(4):899-904(1992)。这些残基很可能介导IL-4与IL-4Rα相互作用(图1)，丙氨酸取代对IL-4突变蛋白质与IL-4Rα结合亲和性的影响表明，经取代的残基可能参与结合作用。通过对那些丙氨酸取代时对亲和性产生中等效果的残基进行广泛的取代，鉴别亲和性改善上的差异。组合时，那些对亲和性有所改善的变异可能综合提高IL-4(或IL-4相关肽)对IL-4Rα的亲和性。亲和性的提高应对应着效价的提高。
突变蛋白质通过定点诱变产生，在杆状病毒系统中表达，纯化至同质，通过氨基酸分析进行定量，然后利用受体结合测定进行评价。用于本研究的成熟人体IL-4的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)如以下所示。其中位置1处的His代表成熟多肽的N-末端。A-、C-和D-螺旋分别在其开始处标明且标划下线。适当取代时能产生高亲和性变异体的氨基酸用黑体字表示A:→His Lys Cys Asp Ile Thr Leu Gln Glu Ile Ile Lys Thr Leu Asn1 5 10 15Ser Leu Thr Glu Gln Lys Thr Leu Cys Thr Glu Leu Thr Val Thr20 25 30Asp Ile Phe Ala Ala Ser Lys Asn Thr Thr Glu Lys Glu Thr Phe35 40 45Cys Arg Ala Ala Thr Val Leu Arg Gln Phe Tyr Ser His His Glu50 55 60Lys Asp Thr Arg Cys Leu Gly Ala Thr Ala Gln Gln Phe His Arg65 70 75His Lys Gln Leu Ile Arg Phe Leu Lys Arg Leu Asp Arg Asn Leu80 85 90Trp Gly Leu Ala Gly Leu Asn Ser Cys Pro Val Lys Glu Ala Asn95 100 105D: →Gln Ser Thr Leu Glu Asn Phe Leu Glu Arg Leu Lys Thr Ile Met110 115 120Arg Glu Lys Tyr Ser Lys Cys Ser Ser125将本研究中检出的变异引入一个已知的人体IL-4的拮抗物变异体，该变异体在D螺旋上包含两个取代，即R121D和Y124D(Tony HP,et al.,用于高度有效地抑制T细胞和B细胞中白细胞介素-4依赖性和白细胞介素-13依赖性反应的人体白细胞介素-4拮抗物的设计，Eur.J.Biochem,225(2):659-65(1994)，该突变蛋白质以“IL-4[R121D/Y124D]”命名)。突变蛋白质在杆状病毒系统中进行表达，纯化至同质，然后利用固相IL-4Rα受体结合测定进行评价。对IL-4Rα亲和性改善的生物学意义在T细胞增殖测定中进行了评价。由于IL-4[R121D/Y124D]突变蛋白质是IL-4的拮抗物，因此，对IL-4Rα亲和性的改善应在较高亲和性拮抗物突变蛋白中导致较低的IC50值(IC50表示抑制某特定激动剂反应50％所需的拮抗物浓度)。
实施例1.突变蛋白质的生成。如Kunkel TA、Roberts JD和ZakourRA所述(“无需表型选择的、快速和有效的定点诱变”，Methods Enzymol154:367-382(1987))，突变蛋白质通过使用包含所需变异的相应密码子的引物进行定点诱变而产生。简单地说，是利用同一位点将包含限制性酶切位点BamHⅠ和XbaⅠ的人体IL-4cDNA，亚克隆至M13噬菌体载体M13mp19(New England Biolabs,Beverly,MA)。野生型IL-4cDNA通过聚合酶链反应(“PCR”)从一个来自mRNA的cDNA库中获得，该mRNA是从经过24小时佛波醇12-十四烷酸酯13-乙酸酯(10ng/ml)诱导的人体外周血淋巴细胞中分离出来的。用于IL-4开放阅读框5′端的PCR引物为5′-CGC GGA TCC ATG GGT CTC ACC TCC-3′(SEQ ID NO:2)，用于IL-4开放阅读框的3′端的PCR引物为5′-CGC TCT AGA CTA GCT CGA ACA CTT TGA AT-3′(SEQ ID NO:3)。
限制性酶切位点BamHⅠ(5′端)和XbaⅠ(3′端)被整合入每一寡聚核苷酸，以斜体字表示。使用的PCR条件为94℃下1分钟、58.7℃下1分钟及72℃下1分钟，共进行25个循环。如此得到的正确的IL-4cDNA序列按照生产厂商的说明，使用Sequenase测序试剂盒(Amersham Life Sciences,Arlington Heights,IL)进行测序加以确认。包含尿苷的单链DNA(U-DNA)通过利用包含IL-4cDNA的M13mp19转化大肠杆菌菌株CJ236(Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA)而获得。定点诱变一般使用的引物包含15个与诱变对象密码子的模板U-DNA5′端同源的核苷酸、引入所需改变的核苷酸、以及另外10个与最后改变的核苷酸模板U-DNA 3′端同源的核苷酸。D螺旋上的突变-Arg-121成为Asp及Tyr-124成为Asp-被引入野生型IL-4序列。命名为IL-4[R121D/Y124D]的该变异体尿苷DNA通过以上所述方法生成。这些研究中的所有突变体均使用IL-4[R121D/Y124D]模板生成。
引物按生产厂商规定的步骤用T4多核苷酸激酶(New EnglandBiolabs,Beverly,MA)进行磷酸化。然后将磷酸化的引物与U-DNA模板退火，然后用T7 DNA聚合酶(Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA)按照生产厂商(Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA)说明的步骤延长。大肠杆菌菌株DH5aTM(GibcoBRL,Gaithersburg,MD)的细胞用5微升反应混合物进行转化后置于含有0.7％琼脂的“LB培养基”中。37℃下温育后，从每一诱变反应中取出三个单独的噬斑转入2毫升“LB培养液”，将其扩增，然后在37℃下培养过夜。单链DNA按生产厂商规定用M13纯化试剂盒(Qiagen,Inc.,Chatsworth,CA)进行分离，包含所需变异的克隆按生产厂商规定的步骤，使用Sequenase测序试剂盒(Amersham Life Sciences,Arlington Heights,IL)进行单链DNA测序加以确认。与包含正确IL-4变异序列的噬斑相对应的复制型DNA(双链型M13噬菌体)用Qiagen质粒Miniprep试剂盒(Qiagen,Inc.,Chatsworth,CA)进行分离。IL-4突变蛋白质cDNA用BamHⅠ和XbaⅠ从纯化后的复制型DNA中分离出来，然后亚克隆至质粒载体pFastBacTM1(GibcoBRL,Gaithersburg,MD)。亚克隆之后，重组杆状病毒DNA(以下称Bacmid)按照生产厂商说明的步骤，通过将包含突变蛋白质cDNA的pFastBacTM1转化大肠杆菌菌株DH10BacTM(GibcoBRL,Gaithersburg,MD)而生成。突变蛋白质在Spodopterafruipperda(Sf)9细胞中使用Bac-to-Bac‰(GibcoBRL,Gaithersburg,MD)杆状病毒表达系统进行表达。所有昆虫细胞的温育都在28℃下进行。简单地说，2毫升Sf9细胞培养物通过使用CellFECTINTM(GibcoBRL,Gaithersburg,MD)而被5微升重组Bacmid转染。转染60小时后收集上清液，该上清液在Grace溶液中用于感染100-200毫升的1×106Sf9细胞/毫升培养物(GibcoBRL,Gaithersburg,MD)。按照生产厂商规定的步骤，感染48-60小时后，使用带GSA转头的SorvallRC-5B离心机(Dupont Instrument Co.,Wilmington,DE)在5000rpm下离心10分钟，收集上清液后测定病毒效价(通常所获测定值＞1×108噬斑形成单位/毫升)。对于蛋白质的生成，将2-3×106Sf9细胞/毫升在500毫升SF900Ⅱ溶液(GibcoBRL,Gaithersburg,MD)中感染，感染复数为4-10。感染60-72小时后，使用带GSA转头的SorvallRC-5B离心机(Dupont Instrument Co.,Wilmington,DE)在5000rpm下离心10分钟，收集上清液后用0.2μM无菌过滤装置进行过滤。
实施例2.突变蛋白质的纯化。抗人体IL-4单克隆抗体C400.1和C400.17以重组人体IL-4(Genzyme Diagnostics,Cambridge,MA)为免疫原，按照标准方法从小鼠中生成，该单克隆抗体作为腹水生成、纯化并按生产厂商规定的步骤偶联到被CNBr活化的Sepharose琼脂糖上(Pharmacia,Uppsala,Sweden)。将由Sf9细胞经含有各自IL-4突变蛋白质的重组杆状病毒感染产生的Sf9细胞上清液装入1毫升抗IL-4 MAb偶联Sepharose琼脂糖柱内，用pH8.3的100mM NaHCO3和500mM NaCl冲洗，之后水洗除去盐份。然后用8个柱体积的100mM甘氨酸、pH3.0进行洗脱。级份用装有0.1体积1M、pH8.0三羟甲基氨基甲烷(Tris)的硅化小瓶收集。突变蛋白质使用Dynamax-300C18柱(Rainin Instrument Co.,Woburn,MA)和梯度为0-100％的缓冲液A到B(缓冲液A，水；缓冲液B，乙酸腈，0.1％三氟乙酸)，经反相层析进一步提纯。级份用SDS-PAGE评定，包含突变蛋白质的级份冷冻干燥、储藏，重新悬浮于无菌磷酸缓冲盐水(PBS；l0mM NaPO4,137mM NaCl,pH7.6)中后进行测定。如在SDS-PAGE(银染色)中所观察到的，如此提纯的突变蛋白质通常为单带，定量测定利用氨基酸分析进行(通常准确度＞90％)。
实施例3.受体结合测定。为了确定取代对IL-4突变蛋白质与IL-4Rα结合能力的影响(Ldzerda,R L.,et al.,人体白细胞介素4受体赋予生物反应性并定义新的受体超家族，J.Exp.Med.171:861-873(1990))，我们设计了固相受体结合测定。简单地说，突变蛋白质的亲和性以它们从结合于固相表面的IL-4Rα中置换出放射性标记IL-4的能力进行测定。图2示出了相应于IL-4[R121D/Y124D],T13D-IL-4[R121D/Y124D]在固相受体结合测定中与125Ⅰ-IL-4竞争的能力。测定规划使用包被有链霉亲和素的96孔FlashPlate(DupontNEN,Boston,MA)进行，即IL-4Rα的胞外区域通过一个被加入IL-4Rα胞外区域能与链霉亲和素结合的肽标记结合于平板。闪蒸平板包含一个渗入平板塑料内的闪烁体，该闪烁体具有一种性质，即只有那些非常接近平板表面的放射性标记化合物会激发闪烁。将含有放射性标记IL-4和IL-4拮抗物突变蛋白质的样品加入每个孔，温育至平衡。因为未结合的放射性标记化合物不引发闪烁信号，所以在测定结合于每一孔中的放射活性之前无需经过冲洗步骤。因此，所测定的放射活性代表了结合于IL-4Rα的放射性标记IL-4。同时，经过考虑所加入的未经放射性标记的IL-4拮抗物突变蛋白质的量，可以计算出未经放射性标记的IL-4拮抗物突变蛋白质对IL-4Rα的亲和性。每一测定中的内在标准，通过与每一突变蛋白质同时测定IL-4[R121D/Y124D]亲和性得以建立。由此能够获得亲和性的特定相对测定值，从而能够对单一取代对IL-4Rα亲和性的影响进行评估。
IL-4Rα胞外区域利用PCR从Jurkat细胞lgt11文库(StratageneCloning Systems,La Jolla,CA)获得。用于分离IL-4Rα胞外区域的IL-4Rα开放阅读框5′端的PCR引物为5′GGC ATG GAT CCA TGG GGT GGC TTT GCT CTG G3′(SEQID NO:4)；用于IL-4Rα胞外区3′端的开放阅读框的PCR引物为5′AAG CCG CTA GCG CTG TGC TGC TCG AAG GGC 3′(SEQ ID NO:5)。使用的PCR条件为94℃下1分钟，65.8℃下1分钟，72℃下1分钟，共进行三十个循环。生成的PCR产物用限制性内切酶BamHⅠ和Eco47Ⅲ消化，然后亚克隆至pBluescript载体((Stratagene Cloning Systems,La Jolla,CA)。该载体以同样的酶进行消化，该载体包含具有与序列Ser-Ala-Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly(SEQ ID NO:6)相应的密码子的DNA。据报道，该序列与链霉亲和素结合(SchmidtTG和Skerra,A.,用于功能性Ig Fv片段检出及纯化的C-末端亲和性肽的随机肽文库辅助工程，Protein Eng.6(1):109-122(1992))。如此产生的IL-4Rα胞外区域为SEQ ID NO:7，它在胞外区域的C-末端为肽序列Ser-Ala-Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly(SEQ ID NO:6)编码，并命名为sIL-4Rα-STX(位置1处的Met为成熟IL-4Rα的N-末端)。
sIL-4Rα-STX蛋白质使用杆状病毒系统以与IL-4拮抗物突变蛋白质同样的方法生成，通过已经介绍的IL-4偶联基质亲和层析进行纯化(Kruse N,et al.，“人体白细胞介素4的两个独特的功能位点通过受体结合或受体活化损伤的变异体得以确认。”EMBO J.,12(13)p5121-9(1993))，然后储存于PBS。IL-4基质的生成按照生产厂商(Pharmacia,Uppsala,Sweden)指定的步骤，通过将大肠杆菌中产生的IL-4偶联到CNBr Sepharose4B上进行。用100微升在100mM三羟甲基氨基甲烷(Tris)、0.1％BSA、pH7.0中的2微克/毫升的sIL-4Rα-STX包被已经包被有链霉亲和素的FlashPlate(DuPont NEN,Boston,MA),20℃下进行2小时，用pH7.6的PBS、0.1％BSA冲洗后，与200pM125Ⅰ-IL-4(DuPont NEN,Boston,MA)以及各种不同浓度的IL-4拮抗物突变蛋白质一起，于100微升PBS和0.1％BSA中培养1.5小时，一式四组，pH7.6，温度为20℃。测定至少重复两次。IL-4[R121D/Y124D]作为内在参照与同一FlashPlate中的每种突变蛋白质同时进行滴定。结合的放射性活性用TopCount闪烁计数器(Packard Instrument Co.,Meriden,CT)测量，Kd值用配体程序计算(Munson,P.J.和Rodbard,D.，“配体结合数据的计算机化分析”。Meth.Enzymol.,92p543-576(1983))。其中Kd值误差为2-20％,以％CV表示。结果通过从每一测定平板获得的数据以Kd值突变蛋白质/Kd值IL-4[R121D/Y124D]比率表示。所测Kd值的差异显示出各个突变蛋白质对IL-4Rα亲和性的相对提高(即突变蛋白质Kd值/IL-4[R121D/Y124D]Kd值＜1)或各个突变蛋白质对IL-4Rα亲和性的相对降低(即突变蛋白质Kd值/IL-4[R121D/Y124D]Kd值＞1)。
实施例4.1°T细胞增殖测定。原代T细胞来自正常捐献者的新鲜血液，使用Ficoll-PaquePlus(Pharmacia,Uppsala,Sweden)离心提纯，提纯方法基本按照Kruse,N.,Tony,H.P.和Sebald,W.所述，“单一氨基酸替换引起的人IL-4向一种高亲和性拮抗物的转化”,Embo J.,11:3237-44(1992)。提纯的外周血单核细胞与10微克/毫升植物凝血素(Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO)温育7天，离心收集，然后用RPMI1640培养基(GibcoBRL,Gaithersburg,MD)清洗。5×104活化T细胞/孔(PHA-母细胞)在96孔平板中与不同量的IL-4或突变蛋白质一起置于RPMI培养基中温育48小时，温度为37℃。该RPMI培养基包含10％胎牛血清、10mM HEPES,pH7.5、2mM L-谷氨酰胺、100单位/毫升青霉素G、以及100微克/毫升硫酸链霉素。以1μCi3H-胸苷(Dupont NEN,Boston,MA)/孔进行6小时脉冲处理后收集。放射活性用TopCount闪烁计数器测定(Packard Instrument Co.,Meriden,CT)。
实施例5.丙氨酸取代对IL-4与IL-4Rα亲和性的影响。丙氨酸取代IL-4A-和C-螺旋表面暴露残基对IL-4与IL-4Rα亲和性的影响示于表Ⅰ。
表Ⅰ．IL-4A-和C-螺旋表面暴露残基丙氨酸扫描结果。*
*所有突变均附加于IL-4[R121D/Y124D]主链。由于丙氨酸取代一般不引起蛋白质折叠的结构变化，因此对活性的影响，在此为对亲和性的影响可以认为是由于被取代侧链的丧失而引起的(Cunningham,B.C.,Wells,J.A.，通过丙氨酸扫描诱变进行的hGH受体相互作用的高分辨率表位定位，Science244(4908):1081-5(1989))。丙氨酸取代引起的亲和性上微小的变化(如大约2倍)表示残基/被取代位置不参与相互作用，而大的影响(如大于100倍)则表示残基/被取代位置对相互作用至关重要(Lowman HB,et al.，“通过单价噬菌体显示选择高亲和性结合蛋白”。Biochemistry30(45)p10832-8(1991))。Lowman等(出处同前)发现，除最敏感的残基外，这些由于丙氨酸取代而在结合中显示中等作用的残基也参与所研究的相互作用。
将这些结论与IL-4的A-和C-螺旋丙氨酸扫描结果结合考虑，IL-4与IL-4Rα相互作用中最关键的残基是Glu-9和Arg-88。中等作用的残基可能包括Ile-5＞Asn-89＞Lys-84-Arg-81＞Thr-13-Gln-78-Arg-85-Lys-77；可能不参与相互作用的残基包括Gln-8、Ile-11、Lys-12、Asn-15、His-74、Phe-82和Trp-91。鉴于其在被丙氨酸取代时显示出的亲和性的提高，Ser-16可能存在于IL-4与IL-4Rα间形成的介面上或介面内。这些结果明确表示出IL-4上与IL-4Rα结合时可能的结合表面。从IL-4结构上讲，该表面由IL-4A-和C-螺旋的相邻部分组成(Smith LJ,et al.,人体白细胞介素4。四螺旋束蛋白的溶液结构，J.Mol.Biol.224(4):899-904(1992))，而且在每一螺旋上延伸约三个螺旋回转，即在A螺旋上的位置5至16，和C螺旋上的位置77至89。与IL-4受体α接触可能性最大的残基在A螺旋上为Ile-5、Glu-9、Thr-13和Ser-16，在C螺旋上为Lys-77、Gln-78、Arg-81、Lys-84、Arg-85、Arg-88和Asn-89。从结构上看，相互作用的关键中心似乎由残基Glu-9、Arg-88和Asn-89组成，当其中一个从分子的这一部分移去时，所观察到的丙氨酸影响通常会降低。因此，这一分析说明了IL-4与IL-4Rα作用的结合表面。
实施例6．选定位置上的取代突变蛋白质。前面一个生长激素的分析中，发现了能够改善生长激素对其受体亲和性的残基取代，这些残基在被丙氨酸取代时对亲和性起着中等作用(Lowman HB,et al.，“通过单价噬菌体显示选择高亲和性结合蛋白质”，Biochemistry30(45)p10832-8(1991))。此外还发现，一个可改善亲和性的特定残基的取代性质是不可预测的。因此，在本分析中向各靶位置引入了所有无内在结构影响(即除Cys、Gly、Pro以外)或容易进行氧化反应(即除Met以外)的取代。
表Ⅱ．靶残基以及其取代。*
*所有突变均附加于IL-4[R121D/Y124D]主链。因此，在进一步取代分析中排除了半胱氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸和脯氨酸。如果残基在被丙氨酸取代时显示的亲和性下降在5至80倍，或者显示任何亲和性的提高，它们则被选择用于进一步分析。这一范围是根据Lowman等(出处同前)所得结果选择的。此外，鉴于所观察到的丙氨酸取代引起的亲和性的提高，Ser-16被选择用于进一步分析，因为这表明了该位置的其它取代也可能导致亲和性的改善。
实施例7．引起对IL-4Rα亲和性改善的取代。在A-和C-螺旋中单独位置上包含取代的突变蛋白质与IL-4[R121D/Y124D]主链组合而生成。竞争性结合测定同时将每一突变蛋白质与IL-4[R121D/Y124D]进行了平行比较，从而得到了每一取代对于某特定突变蛋白质与IL-4Rα亲和性的影响的直接比较和结论。
所有引起亲和性改善的取代如表Ⅲ所示。“KdIL-4[R121D/Y124D]/Kd突变蛋白质”比率表示每一取代引起的亲和性的相对提高。
表Ⅲ．
大多数取代是有害的，或者对IL-4Rα亲和性没有影响(数据未示出)。但是，有几个取代确实改善了亲和性，其中最明显的是Asp对Thr-13的取代，该取代对IL-4Rα亲和性的改善高达18倍，令人惊奇(图2)。氨基酸Ser-16在本分析中非常特殊，大多数的取代在此位置上都引起了亲和性适度的提高。在其它突变蛋白质以及其相关亲和性上也获得了类似的竞争性结合曲线(数据未示出)。
亲和性的改善是相对亲本蛋白质IL-4[R121D/Y124D]而言的。可以预见，将这些取代结合在一个蛋白质中可能会引起亲和性的综合提高。例如，[T13D/N89I]-IL-4[R121D/Y124D]可能生成一种比IL-4[R121D/Y124D]亲和性高出36倍的突变蛋白质。
在适当的取代被确定时，残基Thr-13和Ser-16对亲和性产生最佳改善。这可能表明，其它在丙氨酸取代时产生与突变蛋白质T13A或S16相似作用(分别为降低6.4倍和提高2.5倍)的残基，在取代适当时也很可能产生较高亲和性的IL-4变异体。在当前一系列被丙氨酸取代的残基中，它们包括Ile-11、Lys-77、Gln-78、Lys-84和Arg-85。
在已有广泛研究的生长激素中，引起亲和性提高的单一取代在1.5-5倍之间(Lowman HB；Wells JA，“通过单价噬菌体显示产生的人体生长激素的亲和性成熟”。J.Mol.Biol.234(3)p564-78(1993))。但是，大幅改善活性(人体IL-3(Olins PO,et al.，人体白细胞介素-3的饱和诱变，J.Biol.Chem.270(40):23754-60(1995))或亲和性(人体睫状神经营养因子(CNTF)(SaggioⅠ,et al.,具有提高的生物效价及受体选择性的CNTF变异体表明了受体相互作用的功能位点，EMBO J.14(13):3045-54(1995)))的取代最近已被确认。对于IL-3，一个变异在体外增加生物活性近26倍；对于CNTF，单一取代提高亲和性近32倍。对于文献中的其它细胞因子，大多数取代一般对亲和性/活性无影响或导致其丧失。因此，任何特定取代对亲和性和/或活性的绝对影响是不可预测的。
实施例8．T13D取代对生物活性的影响。IL-4拮抗物突变蛋白质IL-4[R121D/Y124D]是IL-4的拮抗物(Tony,HP,Shen BJ,ReuschP和Sebald W，“用于高度有效地抑制T细胞和B细胞中白细胞介素-4依赖性和白细胞介素-13依赖性反应的人体白细胞介素-4拮抗物的设计”，Eur.J.Biochem.,225(2):659-65(1994))，由于它对IL-4活性无刺激能力，故在本研究中用作“基线”肽。由于它能与IL-4Rα结合，但又不以信号反应方式涉及gc，从而能够阻止IL-4与其同源受体复合体的结合，所以，该拮抗物突变蛋白质被认为是一种拮抗物。因此，IL-4[R121D/Y124D](IL-4拮抗物)的生物学效应和它与IL-4Rα的相互作用是独立的，该相互作用以亲和性测量。
为了证明受体亲和性与生物效价相关，我们对突变蛋白质T13D-IL-4[R121D/Y124D]抑制IL-4诱导的PHA-母细胞增殖的能力进行了评价(图3)。观察到的相对于IL-4[R121D/Y124D]的IC50(50％抑制时的浓度)大致与观察到的受体亲和性相对变化成比例。
总之，尽管T13D-IL-4[R121D/Y124D]以较高的亲和性与IL-4Rα结合，它仍是一种IL-4拮抗物。T13D-IL-4[R121D/Y124D]相对于IL-4[R121D/Y124D]的IC50大致与这两种蛋白质的相对Kd值成比例(如同固相结合测定中所测量的):T13D-IL-4[R121D/Y124D]的Kd值比IL-4[121D/Y124D]的Kd值约低18倍(分别为0.28nM对5.0nM)；T13D-IL-4[R121D/Y124D]的IC50值比IL-4[R121D/Y124D]的IC50值约低5-10倍(分别为2nM对13nM)。相对影响中特定的数值差别可能是每一测定的特殊条件的结果固相结合测定中20℃下培养1.5小时对增殖测定中37℃下培养48小时。本研究中评价的、在生物测定中与IL-4竞争的其它突变蛋白质的能力也与其相对IL-4[R121D/Y124D]的Kd值成比例(数据未示出)。这些结果表明，与IL-4Rα的结合是一个与IL-4受体活化分开的独立过程，受体的活化需要IL-4Rα的异源双体化以及至少一个其它亚基(如gc)。因此，对IL-4A-和C-螺旋的修饰调节着IL-4对IL-4Rα的亲和性，同时也均衡地调节着所述突变蛋白质在生物环境中拮抗IL-4的能力。鉴于IL-4与其受体相互作用的机制，这种亲和性影响也能表示为从IL-4衍生出的激动肽的能力的提高。
本发明的理论也可适用于其它细胞因子。最明确的目标为IL-13，因为IL-13受体复合体也利用IL-4Rα(Zurawski S.M.,et al.，人体白细胞介素-4受体的主要结合亚基也是白细胞介素-13受体的组分，J.Biol.Chem.270:13869-78(1995))。因此，通过引起IL-13A-和C-螺旋的突变使其更接近IL-4，应会带来对IL-4Rα亲和性的提高。
这两种白细胞介素的序列对比，能够确认类似于靶变异位点的位置，如IL-4中的Thr13。这两种白细胞介素的结合表面在以下表Ⅳ中进行了比较。
表ⅣIL-4A-和C-螺旋与IL-13序列的比较*
*序列对比摘自Bamborough,P.,Duncan,D.，和Richards,W.G.，“白细胞介素-13三维结构的预想模型”，Protein Engineering,7,pp.1007-82(1994)
根据该序列对比，丙氨酸扫描所确认的、介导与IL-4Rα相互作用的最关键的IL-4残基Glu-9和Arg-88与IL-13中相应残基同样以黑体字表示。如同前面所提到的，IL-13在其受体复合体中使用IL-4Rα链(Zurawski S.M.,et al.，同上)。因此，通过改变IL-13A-和C-螺旋使其更接近IL-4，应会带来对IL-4Rα结合亲和性的提高。此外，用已知能够提高IL-4对IL-4Rα亲和性的残基取代等效位置上的IL-13残基(以双下线标记所示IL-4和IL-13的位置)也应带来IL-13对其受体复合体亲和性的提高，以及相应效价的提高。
序列。本发明包括以下生物序列SEQ ID NO:1氨基酸序列，成熟人体IL-4；SEQ ID NO:2核苷酸序列，PCR引物；SEQ ID NO:3核苷酸序列，PCR引物；SEQ ID NO:4核苷酸序列，PCR引物；SEQ ID NO:5核苷酸序列，PCR引物；SEQ ID NO:6结合链霉亲和素的肽标记的氨基酸序列；SEQ ID NO:7sIL-4Rα-STX的氨基酸序列；SEQ ID NO:8T13D-IL-4的氨基酸、核苷酸序列；以及SEQ ID NO:9T13D-IL-4[R121D/Y124D]的氨基酸、核苷酸序列。
本发明的其它实施方案对于该领域的技术人员是显而易见的。在此说明的概念及实验方法适用于其它利用异源多体受体系统的细胞因子，尤其是IL-2及其相关细胞因子(如IL-7、IL-9、IL-10、IL-13和IL-15)、α干扰素和γ干扰素。
序列表(1)一般信息(ⅰ)申请人Shanafelt,Armen；Greve,Jeffrey；Roczniak,Steven(ⅱ)发明题目高亲和性IL-4突变蛋白质(ⅲ)序列数9(ⅳ)通信地址(A)收件人Bayer Corporation,Pharmaceutical Division(B)街道400Morgan Lane(C)城市West Haven(D)州CT(E)国家美国(F)邮政编码06516-4175(ⅴ)计算机可读形式(A)介质类型3.5英寸软盘，1.44Mb储存容量(B)电脑IBM PC兼容机(C)操作系统PC-DOS v.6.30(D)软件Word用于Windows6.0(ⅵ)当前申请资料(A)申请号08/687,803(B)申请日1996年7月19日(ⅶ)律师/代理人信息(A)姓名Huw R.Jones(B)注册号33,916(C)参考/案卷号WH5020(ⅷ)电信信息(A)电话(203)812-2317(B)传真(203)812-5492(2)SEQ ID NO:1信息(ⅰ)序列特征(A)长度129(B)类型氨基酸
(C)链型单链(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型蛋白质(A)说明人体白细胞介素-4蛋白质(ⅲ)假设无(ⅳ)反义链无(ⅹⅰ)序列说明SEQ ID NO:1:His Lys Cys Asp Ile Thr Leu Gln Glu Ile Ile Lys Thr Leu Asn1 5 10 15Ser Leu Thr Glu Gln Lys Thr Leu Cys Thr Glu Leu Thr Val Thr20 25 30Asp Ile Phe Ala Ala Ser Lys Asn Thr Thr Glu Lys Glu Thr Phe35 40 45Cys Arg Ala Ala Thr Val Leu Arg Gln Phe Tyr Ser His His Glu50 55 60Lys Asp Thr Arg Cys Leu Gly Ala Thr Ala Gln Gln Phe His Arg65 70 75His Lys Gln Leu Ile Arg Phe Leu Lys Arg Leu Asp Arg Asn Leu80 85 90Trp Gly Leu Ala Gly Leu Asn Ser Cys Pro Val Lys Glu Ala Asn95 100 105Gln Ser Thr Leu Glu Asn Phe Leu Glu Arg Leu Lys Thr Ile Met110 115 120Arg Glu Lys Tyr Ser Lys Cys Ser Ser125(2)SEQ ID NO:2信息(ⅰ)序列特征(A)长度24(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型cDNA(A)说明5′PCR引物，IL-4(ⅲ)假设无(ⅳ)反义链无(ⅹⅰ)序列说明SEQ ID NO:2:
CGCGGATCCA TGGGTCTCAC CTCC24(2)SEQ ID NO:3信息(ⅰ)序列特征(A)长度29(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型cDNA(A)说明3′PCR引物，IL-4(ⅲ)假设无(ⅳ)反义链无(ⅹⅰ)序列说明SEQ ID NO:3:
CGCTCTAGAC TAGCTCGAAC ACTTTGAAT29(2)SEQ ID NO:4信息(ⅰ)序列特征(A)长度31(B)类型核酸(C)链型单链
(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型cDNA(A)说明5′PCR引物，IL-4Rα(ED)(ⅲ)假设无(ⅳ)反义链无(ⅹⅰ)序列说明SEQ ID NO:4:
GGCATGGATC CATGGGGTGG CTTTGCTCTG G31(2)SEQ ID NO:5信息(ⅰ)序列特征(A)长度30(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型cDNA(A)说明3′PCR引物，IL-4Rα(ED)(ⅲ)假设无(ⅳ)反义链无(ⅹⅰ)序列说明SEQ ID NO:5:
AAGCCGCTAG CGCTGTGCTG CTCGAAGGGC30(2)SEQ ID NO:6信息(ⅰ)序列特征(A)长度10(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型肽(A)说明结合链霉亲和素的标记(ⅲ)假设无(ⅳ)反义链无
(ⅹⅰ)序列说明SEQ ID NO:6:
Ser Ala Trp Arg His Pro Gln Phe Gly Gly101 5 10(2)SEQ ID NO:7信息(ⅰ)序列特征(A)长度197(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型蛋白质(A)说明sIL-4Rα-STX(ⅲ)假设无(ⅳ)反义链无(ⅹⅰ)序列说明SEQ ID NO:7:Met Lys Val Leu Gln Glu Pro Thr Cys Val Ser Asp Tyr Met Ser1 5 10 15Ile Ser Thr Cys Glu Trp Lys Met Asn Gly Pro Thr Asn Cys Ser20 25 30Thr Glu Leu Arg Leu Gly Ala Gly Cys Val Cys His Leu Leu Met35 40 45Asp Asp Val Val Ser Ala Asp Asn Tyr Thr Leu Asp Leu Trp Ala50 55 60Gly Gln Gln Leu Leu Trp Lys Gly Ser Phe Lys Pro Ser Glu His65 70 75Val Lys Pro Arg Ala Pro Gly Asn Leu Thr Val His Thr Asn Val80 85 90Ser Asp Thr Leu Leu Leu Thr Trp Ser Asn Pro Tyr Pro Pro Asp95 100 105Asn Tyr Leu Tyr Asn His Leu Thr Tyr Ala Val Asn Ile Trp Ser110 115 120Glu Asn Asp Pro Ala Asp Phe Arg Ile Tyr Asn Val Thr Tyr Leu125 130 135Glu Pro Ser Leu Arg Ile Ala Ala Ser Thr Leu Lys Ser Gly Ile140 145 150Ser Tyr Arg Ala Arg Val Arg Ala Trp Ala Gln Cys Tyr Asn Thr155 160 165Thr Trp Ser Glu Trp Ser Pro Ser Thr Lys Trp His Asn Ser Tyr170 175 180Arg Glu Pro Phe Glu Gln His Ser Ala Trp Arg His Pro Gln Phe185 190 195G1y Gly 197(2)SEQ ID NO:8信息(ⅰ)序列特征(A)长度462(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型cDNA(A)说明IL-4/T13D(ⅲ)假设无(ⅳ)反义链无(ⅹⅰ)序列说明SEQ ID NO:8:ATG GGT CTC ACC TCC CAA CTG CTT CCC CCT CTG TTC TTC CTG CTA 45Met Gly Leu Thr Ser Gln Leu Leu Pro Pro Leu Phe Phe Leu Leu1 5 10 15GCA TGT GCC GGC AAC TTT GTC CAC GGA CAC AAG TGC GAT ATC ACC 90Ala Cys Ala Gly Asn Phe Val His Gly His Lys Cys Asp Ile Thr20 25 30TTA CAG GAG ATC ATC AAA GAT TTG AAC AGC CTC ACA GAG CAG AAG 135Leu Gln Glu Ile Ile Lys Asp Leu Asn Ser Leu Thr Glu Gln Lys35 40 45ACT CTG TGC ACC GAG TTG ACC GTA ACA GAC ATC TTT GCT GCC TCC 180Thr Leu Cys Thr Glu Leu Thr Val Thr Asp Ile Phe Ala Ala Ser50 55 60AAG AAC ACA ACT GAG AAG GAA ACC TTC TGC AGG GCT GCG ACT GTG 225Lys Asn Thr Thr Glu Lys Glu Thr Phe Cys Arg Ala Ala Thr Val65 70 75CTC CGG CAG TTC TAC AGC CAC CAT GAG AAG GAC ACT CGC TGC CTG 270Leu Arg Gln Phe Tyr Ser His His Glu Lys Asp Thr Arg Cys Leu80 85 90GGT GCG ACT GCA CAG CAG TTC CAC AGG CAC AAG CAG CTG ATC CGA 315Gly Ala Thr Ala Gln Gln Phe His Arg His Lys Gln Leu Ile Arg95 100 105TTC CTG AAA CGG CTC GAC AGG AAC CTC TGG GGC CTG GCG GGC TTG 360Phe Leu Lys Arg Leu Asp Arg Asn Leu Trp Gly Leu Ala Gly Leu110 115 120AAT TCC TGT CCT GTG AAG GAA GCC AAC CAG AGT ACG TTG GAA AAC 405Asn Ser Cys Pro Val Lys Glu Ala Asn Gln Ser Thr Leu Glu Asn125 130 135TTC TTG GAA AGG CTA AAG ACG ATC ATG AGA GAG AAA TAT TCA AAG 450Phe Leu Glu Arg Leu Lys Thr Ile Met Arg Glu Lys Tyr Ser Lys140 145 150TGT TCG AGC TAG 462Cys Ser Ser End(2)SEQ ID NO:9信息(ⅰ)序列特征(A)长度462(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型cDNA(A)说明IL-4/T13D[R121D/Y124D](ⅲ)假设无(ⅳ)反义链无(ⅹⅰ)序列说明SEQ ID NO:9:ATG GGT CTC ACC TCC CAA CTG CTT CCC CCT CTG TTC TTC CTG CTA 45Met Gly Leu Thr Ser Gln Leu Leu Pro Pro Leu Phe Phe Leu Leu1 5 10 15GCA TGT GCC GGC AAC TTT GTC CAC GGA CAC AAG TGC GAT ATC ACC 90Ala Cys Ala Gly Asn Phe Val His Gly His Lys Cys Asp Ile Thr20 25 30TTA CAG GAG ATC ATC AAA GAT TTG AAC AGC CTC ACA GAG CAG AAG 135Leu Gln Glu Ile Ile Lys Asp Leu Asn Ser Leu Thr Glu Gln Lys35 40 45ACT CTG TGC ACC GAG TTG ACC GTA ACA GAC ATC TTT GCT GCC TCC 180Thr Leu Cys Thr Glu Leu Thr Val Thr Asp Ile Phe Ala Ala Ser50 55 60AAG AAC ACA ACT GAG AAG GAA ACC TTC TGC AGG GCT GCG ACT GTG 225Lys Asn Thr Thr Glu Lys Glu Thr Phe Cys Arg Ala Ala Thr Val65 70 75CTC CGG CAG TTC TAC AGC CAC CAT GAG AAG GAC ACT CGC TGC CTG 270Leu Arg Gln Phe Tyr Ser His His Glu Lys Asp Thr Arg Cys Leu80 85 90GGT GCG ACT GCA CAG CAG TTC CAC AGG CAC AAG CAG CTG ATC CGA 315Gly Ala Thr Ala Gln Gln Phe His Arg His Lys Gln Leu Ile Arg95 100 105TTC CTG AAA CGG CTC GAC AGG AAC CTC TGG GGC CTG GCG GGC TTG 360Phe Leu Lys Arg Leu Asp Arg Asn Leu Trp Gly Leu Ala Gly Leu110 115 120AAT TCC TGT CCT GTG AAG GAA GCC AAC CAG AGT ACG TTG GAA AAC 405Asn Ser Cys Pro Val Lys Glu Ala Asn Gln Ser Thr Leu Glu Asn125 130 135TTC TTG GAA AGG CTA AAG ACG ATC ATG GAC GAG AAA GAC TCA AAG 450Phe Leu Glu Arg Leu Lys Thr Ile Met Asp Glu Lys Asp Ser Lys140 145 150TGT TCG AGC TAG 462Cys Ser Ser End
权利要求
1．一种根据野生型IL-4编号的重组人体IL-4突变蛋白质，该突变蛋白质在所说的野生型IL-4的A或Cα-螺旋链的结合表面至少包含一个氨基酸取代，从而使该突变蛋白质以至少比天然IL-4更高的亲和力与IL-4Rα受体结合。
2．权利要求1所述的重组人体IL-4突变蛋白质，其中所述取代选自A-螺旋上的位置13和16、以及C-螺旋上的位置81和89。
3．权利要求2所述的重组人体IL-4突变蛋白质，其中所述的位置13上的取代为Thr成为Asp。
4．一种药用组合物，该组合物包含权利要求1所述的重组人体IL-4突变蛋白质与一种可药用的载剂。
5．一个为权利要求1所述的重组人体IL-4突变蛋白质编码的氨基酸序列。
6．权利要求1所述的重组人体IL-4突变蛋白质，该突变蛋白质由氨基酸序列SEQ ID NO:8编码。
7．一种经纯化、分离的多核苷酸序列，该多核苷酸序列为权利要求1所述的重组人体IL-4突变蛋白质编码。
8．一种被权利要求7所述的经纯化、分离的多核苷酸序列转化的宿主细胞。
9．权利要求3所述的重组人体IL-4突变蛋白质，该突变蛋白质由DNA序列SEQ ID NO:9或其可稳定杂交的相关变异体编码。
10．一种能够表达权利要求9所述的重组人体IL-4突变蛋白质的转化宿主细胞。
11．一种为所需人体提供治疗的方法，该方法包括给予药学有效量的权利要求4所述的组合物。
12．一种确定某种突变蛋白质与其受体结合能力的测定方法，该方法包括如下步骤(a)向包被有链霉亲和素的FlashPlate引入一个受体链的结合部分，该受体链的结合部分具有一个能够被链霉亲和素结合的标记肽；(b)向所述FlashPlate引入一个对所述受体链的结合部分具有亲和性的放射性标记天然配体；(c)向所述FlashPlate引入一个对所述受体链的结合部分具有亲和性的突变蛋白质配体；(d)达到平衡后测量FlashPlate发出的信号量；以及(e)计算突变蛋白质配体相对于天然配体的相对亲和性。
13．权利要求12所述的方法，其中所述受体链为IL-4Rα。
14．权利要求12所述的方法，其中所述肽标记包括SEQ ID NO:6或其相关简并变异体。
15．权利要求12所述的方法，其中所述肽标记已从受体链中除去，且受体链已被生物素化。
16．权利要求12所述的方法，其中所述受体链的结合部分由SEQ IDNO:7或其相关简并变异体编码。
17．一种根据野生型IL-4编号的重组人体IL-4拮抗物突变蛋白质，其中所述突变蛋白质包括(a)在所述野生型IL-4的D-螺旋上具有取代R121D和Y124D；和(b)在所述野生型IL-4的A-或C-α螺旋结合表面上具有至少一个氨基酸取代，从而使所述突变蛋白质以至少比天然IL-4更高的亲和性与IL-4Rα受体结合。
18．权利要求17所述的重组人体IL-4拮抗物突变蛋白质，其中所述取代选自A-螺旋上的位置13和16、以及C-螺旋上的位置81和89。
19．权利要求18所述的重组人体IL-4拮抗物突变蛋白质，其中所述位置13上的取代为Thr成为Asp。
20．一种药用组合物，该组合物包含权利要求17所述的重组人体IL-4拮抗物突变蛋白质与一种可药用的载剂。
21．一个为权利要求17所述的重组人体IL-4拮抗物突变蛋白质编码的氨基酸序列。
22．权利要求17所述的重组人体IL-4拮抗物突变蛋白质，该突变蛋白质由氨基酸序列SEQ ID NO:9编码。
23．一种经纯化、分离的多核苷酸序列，该多核苷酸序列为权利要求17所述的重组人体IL-4拮抗物突变蛋白质编码。
24．一种被权利要求23所述的经纯化、分离的多核苷酸序列转化的宿主细胞。
25．权利要求19所述的重组人体IL-4突变蛋白质，该突变蛋白质由DNA序列SEQ ID NO:9或其可稳定杂交的相关变异体编码。
26．一种能够表达权利要求26所述的重组人体IL-4突变蛋白质的转化宿主细胞。
27．一种为所需人体提供治疗的方法，该方法包括给予药学有效量的权利要求20所述的组合物。
全文摘要
一种根据野生型IL－4编号的重组人体IL－4突变蛋白质,该突变蛋白质在野生型IL－4的A或Cα－螺旋链的结合表面至少包含一个氨基酸取代,从而使该突变蛋白质以至少比天然IL－4更高的亲和力与IL－4Rα受体结合。取代更优选选自由A－螺旋上的位置13和16、以及C－螺旋上的位置81和89组成的位置。更优选的实施方案是位置13上Thr被取代为Asp的重组人体IL－4突变蛋白质。本发明中也对药用组合物、为突变蛋白质编码的氨基酸和多核苷酸序列、转化宿主细胞、突变蛋白质的抗体、以及治疗方法等进行了说明。
文档编号C12N1/19GK1230223SQ97197959
公开日1999年9月29日 申请日期1997年7月9日 优先权日1996年7月19日
发明者J·格雷维, A·B·沙纳菲尔特, S·洛克兹尼尔克 申请人:美国拜尔公司