突变的慢病毒env蛋白及其用作药物的用途
【专利摘要】本发明涉及药物组合物，其包含与药学上可接受的载体结合的、作为活性物质的大体上不具有免疫抑制性质的突变的慢病毒ENV蛋白、或所述突变的慢病毒ENV蛋白的变体或上述蛋白的片段。
【专利说明】突变的慢病毒ENV蛋白及其用作药物的用途
[0001]本发明涉及突变的慢病毒ENV蛋白以及它们用作药物的用途。
[0002]慢病毒属(Lentivirus)是逆转录病毒科(Retroviridae)的慢病毒的属，其特征在长潜伏期。慢病毒可将大量的遗传信息递送入宿主细胞的DNA，并且在逆转录病毒中具有能够在非分裂细胞中复制的独特能力，因此它们是最有效的基因递送载体的方法之一。HIV, SIV和FIV全都是慢病毒的实例。
[0003]根据WH0，人免疫缺陷病毒(HIV)是目前世界面临的最严重健康危机之一。AIDS自1981年来已造成超过2500万人死亡。在受到最严重影响的国家中，平均寿命期望现下降至49岁-比在AIDS不存在的情况下减少13岁。根据UNAIDS，估计在2006年3950万人携带有HIV病毒，并且430万人在2006年被感染。在许多地区，新的感染主要集中在年轻一代(15-24岁)。治疗和护理的获得途径近年来已大大增加。测定HIV发病率的实时趋势和特别地预防程序的影响理想地需要大量人的长期研究。鉴于进行这样的研究的实际困难，已将焦点置于年轻妇女及其婴儿上。携带HIV的儿童通常通过母婴传播(MTCT)获得感染，这在怀孕、分娩过程中或在母乳喂养过程中发生。现在迫切需要更新的努力来增加用于预防婴儿和幼儿的HIV感染的广泛整合的程序的获得途径，这将为实现无HIV世代指出途径。
[0004]存在两种已知类型的感染人的HIV5HIV-1和HIV-2。它们属于称为慢病毒的一组逆转录病毒，并且在非洲猴子中已发现与HIV相似的病毒。逆转录病毒将它们的基因以基因组RNA转录物的形式从生产者细胞转移至靶细胞，该转录物在感染后被反转录并整合进入靶细胞的DNA基因组。
[0005]第一个具有记录的HIV感染的人死于1959年。在20世纪80年代早期，美国的医生开始意识到，越来越多的患者遭受异常感染并且显示免疫衰竭的体征。该综合征称为获得性免疫缺陷综合征(AIDS)，不久后发现HIV是观察到的免疫系统的破坏的致病因子。最初仅基于疼痛缓解给患者提供治疗，且患者几乎全部不可避免地死亡。在20世纪90年代中期，在治疗上取得了两个重大突破。首先，一组新的抗逆转录病毒剂被发现，其次开始能够测量血液中的HIV病毒的量。这两个进步使得能够利用不同试剂的组合来治疗患者，并且医生能够检查治疗实际上是否起作用。结果是受感染的患者的免疫系统逐渐变得正常并且患者活得更长。目前西方国家受感染的患者具有与未感染的人相同水平的生活质量，并且他们能够拥有孩子，尽管患有HIV的经济和生理后果是巨大的。然而，情况在发展中国家甚至更严重，在发展中国家超过95%的感染有HIV/AIDS的人活着。世界上超过2500万人在最近25年中死于AIDS。
[0006]约95%的感染的人目前生活在发展中国家，在发展中国家中昂贵的抗病毒药物是不可获得的。因此，迫切需要有效的疫苗一这是对不受控制的HIV流行的唯一有效解决方案。在过去几年中，研究已带来了关于HIV-病毒的基础生物学的新知识，这导致新的抗病毒药物和疫苗设计策略。尽管获得了这些重大进步，但仍然不存在有效的疫苗。仅减毒的(即，活的但被弱化的)HIV-菌株能够在灵长类动物研究中提供免疫，然而它们从未达到适合于大规模预防接种所需的安全特性。
[0007]HIV-1的复制过程具有约1/10，000个碱基对的错误率。
[0008]由于全病毒基因组正好在10，000个碱基对以下，因此，据估计在每一个病毒复制周期中，平均I个错误被引入Hiv-1基因组。
[0009]该高突变率促成了任何一个人中的病毒的广泛变异性和甚至群体间的更广泛的变异性。
[0010]该变异性已导致描述了 3个Hiv-1变体，称为〃进化枝〃的病毒的亚种。区别基于包膜蛋白的结构，其是特别可变的。M(主要)变体迄今为止在世界范围内最流行。在M变体内有进化枝A、B、C、D、E、F、G、H、1、J和K，进化枝A至E代表全球的绝大部分的感染。进化枝A、C和D在非洲占主导,然而进化枝B在欧洲、北美洲和南美洲以及东南亚最流行。进化枝E和C在亚洲占主导。这些进化枝相异多达35%。另一个变体为进化枝0，其在HIV-1的咔麦隆分离株中被观察到。在包膜蛋白gpl20和gp41中看到结构的最大变化。
[0011]Hiv-1的极高突变率导致了两个重要结果，其对于流行病具有深远后果。第一，高突变率是允许病毒逃避药物疗法的控制的机制之一。这些新的病毒代表抗性株。高突变率还允许病毒通过改变被免疫组分识别的结构来逃避患者的免疫系统。该广泛的变异性的另外的后果是病毒还可逃避疫苗的控制，从而使得难以发现有效的基于包膜蛋白的疫苗。
[0012]此外，该病毒产生具有免疫抑制性质的蛋白质，从而允许逃避患者的免疫系统监督(survey)。因此，表达此类蛋白质的细胞变成免疫系统“不可看见的”。
[0013]因此，对于疫苗，需要提供已丧失或大体上丧失它们的免疫抑制功能的蛋白质作为抗原，以产生有效应答 。这将使得个体在被病毒感染后能够允许免疫系统破坏感染的细胞和预防/治愈感染。
[0014]现有技术已尝试提供这样的蛋白质。
[0015]例如，国际申请W02005/095, 442 (发明人:Renard, Mangeney&Heidmann)公开了内源逆转录病毒(ERV)或致癌逆转录病毒例如HTLV或FeLV的ENV蛋白的免疫抑制结构域的突变。该文献显示，特定位置上的突变消除ERV或致癌逆转录病毒的ENV蛋白的免疫抑制性质。然而，国际申请W02005/095，442从未提及或暗示，ERV-或致癌逆转录病毒的ENV蛋白的免疫抑制结构域中产生的突变可转用至慢病毒的ENV蛋白。
[0016]国际申请W02010/022，740公开了如下描述的HIV ENV蛋白的区域的极其广泛的共有序列:
[0017]X (1-22) - C (23) - X (24-28) -C (29) - (X30-50)
[0018]其中共有序列的氨基酸残基选自:
[0019]X(I):L、S、R、P、F、A、V、M 和 I ;和
[0020]X (2):Q、R、K、H、L、M 和 P ;和
[0021 ] X (3):A、T、V、H、S、R、Q、G、M 和 E ;和
[0022]X (4):R、K、G、E、T、S、C、M 和 H ;和
[0023]X(5):V、1、L、D、A、S、F、]\^PGjP
[0024]X (6):L、Q、V、Μ、P、W、T 和 I ;和
[0025]X (7):Α、S、Τ、V、L、G、F、D、M 和 E ;和
[0026]X (8):V、L、1、M、A、W、K、G 和 E ;和
[0027]X (9):E、K、G、D、A、V、M 和 F ;和
[0028]X(1):X -M
[0029]X(Il):Y、L、F、H、C、1、T、M 和 N ;和
[0030]X(12):L、1、V、M、Q、P、TMPA;^P
[0031]X(13):1(、1?、0、6、53、!1、胃、1\￥、]\1、队2、￥、六、？和(:；和
[0032]X (14):D、N、G、E、Y、V、S、H、A、M 和 I ;和
[0033]X (15):Q、R、Η、K、P、L、M 和 N ;和
[0034]X (16):Q、K、R、Τ、Η、E、S、P、M 和 L ;和
[0035]X (17):L、F、1、R、V、P、S、M 和 H，和
[0036]X(18):L、M、P、1、H 和 S ;和
[0037]X(19):X -M
[0038]X(20):1、L、M、V、S、F、T、D、A、R、P 和 J ;和
[0039]X(21):W、R、G、F、L、M 和 T ;和
[0040]X (22):G、D、A、R、M 和 C ;和
[0041]X(24):X -M
[0042]X (25):G、R、E、N、A、M 和 D ;和
[0043]X(26):K、R、N、E、Q、T、S、1、M 和 G ;和
[0044]X(27):L、H、1、T、V、F、R、Q、S、P、A、J、M 和 Y ;和
[0045]父(28):1、￥、1\1^、1?、卩和]\1;和
[0046]X(30):T、P、Y、A、N、S、1、V、R、L、M和 H ;和
[0047]X(31):T、S、P、N、M 和 I ;和
[0048]X(32):A、N、T、S、D、R、F、Q、P、1、E、V、M、L、K、H、(^PB;^P
[0049]X (33):V、A、L、M、G、R 和 C ;和
[0050]X(34):X -M
[0051 ]X (35):W、R、G、L、M 和 P ;和
[0052]X (36):N、S、D、B、K、E、R、Q、M 和 G ;和
[0053]X(37):5、1\六、队0、￥、13、丫、1(、1^1?、6、？、]\^、胃、!1、0、8和(:；和
[0054]X(38):S、T、N、1、G、R、L、C、A、W、]\^PE;^P
[0055]X (39):W、G、A、R、E、C、Y、V、S、M 和 H ;和
[0056]X(40):X -M
[0057]X (41):N、G、K、S、D、E、T、R、H、P、A、B、V、Q、Y、M 和 I ;和
[0058]X(42):K、R、N、D、S、T、G、E、1、V、Y、Q、P、H、A、W、]\^PC，^P
[0059]X (43):S、T、N、K、1、R、D、E、P、L、A、W、G、M、H、Y、F、V 和 C,
[0060]X(44)丄、￥、0、卩3、!1、5、￥、1(、]\1、1\1、胃、队0、1?、？、六和6;和
[0061]X(45):03、队5、1\1(、6、1^、六、0、!1、1、￥、8、1?、￥、？、]\^、胃、2和(:；和
[0062]X(46):E、D、Q、Y、K、N、T、S、A、W、H、M、R、1、G、L、V、Z、F、B 和 P ;和
[0063]X(47):1、03、]\1、6、1\0、5、胃、1^、队￥、1(、￥、1?、卩、八、？和！1，和
[0064]X(48):W、1、T、N、D、E、L、G、S、Y、R、V、K、H、A、Q、]\^PF;^P
[0065]X ((49):D、N、E、G、W、Q、K、H、L、B、S、1、Y、T、A、R、M、Z和 V;以和及
[0066]X (50):队0、1\1(、5、!1、1^、63、胃、1、0、]\1、1?、8、￥、？和八。
[0067]该共有序列包含50个氨基酸，其中位置10、19、24、34和40上的特定氨基酸被定义为影响HIV-1包膜多肽的免疫原性性质，并且45个剩余位置被随机地定义，包括野生型HIV ENV蛋白的最常见氨基酸。
[0068]事实上，W02010/022,740 的教导为基于 W02005/095, 442 (发明人:Renard, Mangeney&Heidmann)的教导的从内源逆转录病毒(ERV)或致癌逆转录病毒至慢病毒的转用，但所述转用在慢病毒的情况下是不适当的，如本发明的发明人所显示的。
[0069]简而言之，Heidmann博士为W02005/095，442和本发明的发明人。实际上，本发明的发明人也在慢病毒中测试了 W02005/095，442中描述的突变，但是当将内源逆转录病毒或致癌逆转录病毒中鉴定的突变转用入慢病毒的ENV蛋白时，未观察到效应。
[0070]此外，由于任何氨基酸可被分配至共有序列中的位置10，19，24，34或40，因此，W02010/022, 740教导，使用任何氨基酸残基的此类突变可以是有效的。该教导与本发明相矛盾，本发明显示，HIV-1ENV蛋白的免疫抑制性质仅受特定突变影响，所述突变不仅由它们的位置，而且还由置换的氨基酸残基的性质来定义。
[0071]此外，W02010/022，740公开了，由50个氨基酸共有序列定义的HIV ENV蛋白的免疫抑制结构域内的仅一个特定突变的实验结果。该突变(即，R的置换，如国际申请TO2010/022，740中唯一例证的)，在位置19的氨基酸上发生，这再次等同于国际申请W02005/095, 442中公开的位置，如果简单地比对ENV序列的话(参见W02010/022，740的图3，其为 Benit 等人 2001，Journal of Virology, Vol.75, N0.23, p.11709-11719 中的图 3 的拷贝)(注意，不仅氨基酸的位置，而且置换的性质(精氨酸的置换)与W02005/095，442中描述的相似)。
[0072]更具体地，当比对内源逆转录病毒或致癌逆转录病毒与慢病毒各自的ENV序列时，根据Benit等人的图3:
[0073]内源或致癌逆转录病毒:
[0074]
【权利要求】
1.一种药物组合物，其包含与药学上可接受的载体结合的、作为活性物质的下列物质: a)大体上不具有免疫抑制活性的分离的突变的人或猿猴慢病毒ENV蛋白， 所述突变的人或猿猴慢病毒ENV蛋白因野生型人或猿猴慢病毒ENV蛋白的跨膜(TM)亚基的突变而产生， 所述突变的人或猿猴慢病毒ENV蛋白与选自SEQ ID NO:216, SEQ ID NO:420和SEQID NO:421的一个序列具有至少70%的同一性，优选至少80%的同一性， 所述突变的人或猿猴慢病毒ENV蛋白包含含有下列氨基酸序列的突变的免疫抑制结构域(ISU):
A-[I/V]-E-[K/R]-Xa-Xb-X-D-Q(SEQ ID NO:416)， 其中， X代表任意氨基酸， 并且
Xa 为 A, F，G, L, R 或被删除，并且 Xb 为 C，D, E, H, I, K, L, M, N, P, Q, S，T，V，W 或 Y，或
Xa 为 C，D, E, H, I, K, M, N, P, Q, S，T，V，W 或 Y，并且 Xb 为 A, F，G, R 或被删除，或
Xa为A, F，G, L, R或被删除，并且Xb为A, F，G, R或被删除， 或 b)大体上不具有免疫抑制活性的所述分离的突变的人或猿猴慢病毒ENV蛋白的至少一个片段， 所述片段包含至少40个氨基酸， 所述片段包含含有下列氨基酸序列的突变的免疫抑制结构域(ISU):
A-[I/V]-E-[K/R]-Xa-Xb-X-D-Q(SEQ ID NO:416)， 其中， X代表任意氨基酸， 并且
Xa 为 A, F，G, L, R 或被删除，并且 Xb 为 C，D, E, H, I, K, L, M, N, P, Q, S，T，V，W 或 Y，或
Xa 为 C，D, E, H, I, K, M, N, P, Q, S，T，V，W 或 Y，并且 Xb 为 A, F，G, R 或被删除，或
Xa为A, F，G, L, R或被删除，并且Xb为A, F，G, R或被删除， 上述突变的人或猿猴慢病毒ENV蛋白或如上定义的片段的免疫抑制活性的所述大体上不存在，易于通过这样的事实来评估，即，在牵涉移植的肿瘤细胞排斥的体内测定中， 所述肿瘤细胞被转导以表达所述突变的ENV蛋白或所述片段(突变的ENV肿瘤细胞)， 或所述肿瘤细胞被转导以表达所述野生型ENV蛋白或其片段(野生型ENV肿瘤细胞)， 或所述肿瘤细胞未被转导(正常肿瘤细胞)， 下列比率 所述突变的ENV蛋白或所述片段的免疫抑制指数Qiawenv)/野生型ENV蛋白的免疫抑制指数α 野生型env)小于0.5, i *$Menv被定义为:(突变的ENV肿瘤细胞达到的最大面积-正常肿瘤细胞达到的最大面积)/(正常肿瘤细胞达到的最大面积)，和 iMenv被定义为:(野生型ENV肿瘤细胞达到的最大面积-正常肿瘤细胞达到的最大面积)/(正常肿瘤细胞达到的最大面积)。
2.权利要求1的药物组合物，其包含与药学上可接受的载体结合的、作为活性物质的下列物质: a)大体上不具有免疫抑制活性的分离的突变的人或猿猴慢病毒ENV蛋白， 所述突变的人或猿猴慢病毒ENV蛋白因野生型人或猿猴慢病毒ENV蛋白的跨膜(TM)亚基的突变而产生， 所述突变的人或猿猴慢病毒ENV蛋白包含含有下列氨基酸序列的突变的免疫抑制结构域(ISU):
A-[I/V]-E-[K/R]-Xa-Xb-X-D-Q(SEQ ID NO:416)， 其中， X代表任意氨基酸， 并且
Xa 为 A，F，G，L 或 R，并且 Xb 为 C，D, E, H, I, K, L, M, N, P, Q, S，T，V，W 或 Y，或
Xa 为 C，D, E, H, I, K, M, N, P, Q, S，T，V，W 或 Y，并且 Xb 为 A，F，G 或 R，或
Xa 为 A，F，G，L 或 R，并且 Xb 为 A，F，G 或 R, 或 b)大体上不具有免疫抑制活性的所述分离的突变的人或猿猴慢病毒ENV蛋白的至少一个片段， 所述片段包含至少40个氨基酸， 所述片段包含含有下列氨基酸序列的突变的免疫抑制结构域(ISU):
A-[I/V]-E-[K/R]-Xa-Xb-X-D-Q(SEQ ID NO:416)， 其中， X代表任意氨基酸， 并且
Xa 为 A，F，G，L 或 R，并且 Xb 为 C，D, E, H, I, K, L, M, N, P, Q, S，T，V，W 或 Y，或
Xa 为 C，D, E, H, I, K, M, N, P, Q, S，T，V，W 或 Y，并且 Xb 为 A，F，G 或 R，或
Xa 为 A，F，G，L 或 R，并且 Xb 为 A，F，G 或 R0
3.权利要求1或2的药物组合物，其包含与药学上可接受的载体结合的、作为活性物质的下列物质: a)大体上不具有免疫抑制活性的分离的突变的人或猿猴慢病毒ENV蛋白， 所述突变的人或猿猴慢病毒ENV蛋白因野生型人或猿猴慢病毒ENV蛋白的跨膜(TM)亚基的突变而产生， 所述突变的人或猿猴慢病毒ENV蛋白包含含有下列氨基酸序列的突变的免疫抑制结构域(ISU):
A-[I/V]-E-[K/R]-Xa-Xb-X-D-Q(SEQ ID NO:416)， 其中 X代表任意氨基酸， 并且 Xa 为 A，F，G，L 或 R，并且 Xb 为 L，I，V，M 或 P，或Xa为Y，I，H，C或T，并且Xb为A，F，G或R，或 Xa 为 A，F，G，L 或 R，并且 Xb 为 A，F，G 或 R, 或 b)大体上不具有免疫抑制活性的所述分离的突变的人或猿猴慢病毒ENV蛋白的至少一个片段， 所述片段包含至少40个氨基酸， 所述片段包含含有下列氨基酸序列的突变的免疫抑制结构域(ISU):
A-[I/V]-E-[K/R]-Xa-Xb-X-D-Q(SEQ ID NO:416)， 其中 X代表任意氨基酸， 并且 Xa 为 A，F，G，L 或 R，并且 Xb 为 L，I，V，M 或 P，或 Xa为Y，I，H，C或T，并且Xb为A，F，G或R，或 Xa 为 A，F，G，L 或 R，并且 Xb 为 A，F，G 或 R0
4.权利要求1或2的药物组合物，其包含与药学上可接受的载体结合的、作为活性物质的下列物质: a)大体上不具有免疫抑制活性的分离的突变的人或猿猴慢病毒ENV蛋白， 所述突变的人或猿猴慢病毒ENV蛋白因野生型人或猿猴慢病毒ENV蛋白的跨膜(TM)亚基的突变而产生， 所述突变的人或猿猴慢病毒ENV蛋白包含含有下列氨基酸序列的突变的免疫抑制结构域(ISU):
A-[I/V]-E-[K/R]-Xa-Xb-X-D-Q(SEQ ID NO:416)， 其中 X代表任意氨基酸， 并且
Xa 为 A，G，或 R，并且 Xb 为 C，D, E, H, I, K, L, M, N, P, Q, S，T，V，W 或 Y，或
Xa 为 C，D, E, H, I, K, M, N, P, Q, S，T，V，W 或 Y，并且 Xb 为 F，G 或 R, 或 Xa为F或L，并且Xb为F，G或R， 或 Xa为A, G或R，并且Xb为A, 或 Xa为A，G或R，并且Xb为F，G或R, 或 b)大体上不具有免疫抑制活性的所述分离的突变的人或猿猴慢病毒ENV蛋白的至少一个片段， 所述片段包含至少40个氨基酸， 所述片段包含含有下列氨基酸序列的突变的免疫抑制结构域(ISU):
A-[I/V]-E-[K/R]-Xa-Xb-X-D-Q(SEQ ID NO:416)，其中 X代表任意氨基酸， 并且
Xa 为 A，G，或 R，并且 Xb 为 C，D, E, H, I, K, L, M, N, P, Q, S，T，V，W 或 Y, 或
Xa 为 C，D, E, H, I, K, M, N, P, Q, S，T，V，W 或 Y，并且 Xb 为 F，G 或 R, 或 Xa为F或L，并且Xb为F，G或R， 或 Xa为A, G或R，并且Xb为A, 或 Xa为A，G或R，并且Xb为F，G, R0
5.权利要求1至4的药物组合物，其包含与药学上可接受的载体结合的、作为活性物质的下列物质: a)大体上不具有免疫抑制活性的分离的突变的人或猿猴慢病毒ENV蛋白， 所述突变的人或猿猴慢病毒ENV蛋白因野生型人或猿猴慢病毒ENV蛋白的跨膜(TM)亚基的突变而产生， 所述突变的人或猿猴慢病毒ENV蛋白包含含有下列氨基酸序列的突变的免疫抑制结构域(ISU):
A-[I/V]-E-[K/R]-Xa-Xb-X-D-Q(SEQ ID NO:416)， 其中 X代表任意氨基酸， 并且
Xa 为 A，G，或 R，并且 Xb 为 L，I，V，M 或 P, 或 Xa为Y，I，H，C或T，并且Xb为F，G或R, 或 Xa为F或L，并且Xb为F，G或R， 或 Xa为A, G或R，并且Xb为A, 或 Xa为A，G或R，并且Xb为F，G或R, 或 b)大体上不具有免疫抑制活性的所述分离的突变的人或猿猴慢病毒ENV蛋白的至少一个片段， 所述片段包含至少40个氨基酸， 所述片段包含含有下列氨基酸序列的突变的免疫抑制结构域(ISU):
A-[I/V]-E-[K/R]-Xa-Xb-X-D-Q(SEQ ID NO:416)， 其中X代表任意氨基酸， 并且 Xa 为 A，G，或 R，并且 Xb 为 L，I，V，M 或 P, 或 Xa为Y，I，H，C或T，并且Xb为F，G或R, 或 Xa为F或L，并且Xb为F，G或R， 或 Xa为A, G或R，并且Xb为A, 或 Xa为A，G或R，并且Xb为F，G或R0
6.权利要求1、 2或4的药物组合物，其包含与药学上可接受的载体结合的、作为活性物质的下列物质: a)大体上不具有免疫抑制活性的分离的突变的人或猿猴慢病毒ENV蛋白， 所述突变的人或猿猴慢病毒ENV蛋白因野生型人或猿猴慢病毒ENV蛋白的跨膜(TM)亚基的突变而产生， 所述突变的人或猿猴慢病毒ENV蛋白包含含有下列氨基酸序列的突变的免疫抑制结构域(ISU):
A-[I/V]-E-[K/R]-Xa-Xb-X-D-Q(SEQ ID NO:416)， 其中， X代表任意氨基酸， 并且
Xa 为 A，G，或 R，并且 Xb 为 C，D, E, H, I, K, L, M, N, P, Q, S，T，V，W 或 Y, 或
Xa 为 C，D, E, H, I, K, M, N, P, Q, S，T，V，W 或 Y，并且 Xb 为 F，G 或 R, 或 b)大体上不具有免疫抑制活性的所述分离的突变的人或猿猴慢病毒ENV蛋白的至少一个片段， 所述片段包含至少40个氨基酸， 所述片段包含含有下列氨基酸序列的突变的免疫抑制结构域(ISU):
A-[I/V]-E-[K/R]-Xa-Xb-X-D-Q(SEQ ID NO:416)， 其中， X代表任意氨基酸， 并且
Xa 为 A，G，或 R，并且 Xb 为 C，D, E, H, I, K, L, M, N, P, Q, S，T，V，W 或 Y, 或
Xa 为 C，D, E, H, I, K, M, N, P, Q, S，T，V，W 或 Y，并且 Xb 为 F，G 或 R0
7.权利要求1至6的药物组合物，其包含与药学上可接受的载体结合的、作为活性物质的下列物质:a)大体上不具有免疫抑制活性的分离的突变的人或猿猴慢病毒ENV蛋白， 所述突变的人或猿猴慢病毒ENV蛋白因野生型人或猿猴慢病毒ENV蛋白的跨膜(TM)亚基的突变而产生， 所述突变的人或猿猴慢病毒ENV蛋白包含含有下列氨基酸序列的突变的免疫抑制结构域(ISU):
A-[I/V]-E-[K/R]-Xa-Xb-X-D-Q(SEQ ID NO:416)， 其中， X代表任意氨基酸， 并且
Xa 为 A，G ，或 R，并且 Xb 为 L，I，V，M 或 P, 或 Xa为Y，I，H，C或T，并且Xb为F，G或R, 或 b)大体上不具有免疫抑制活性的所述分离的突变的人或猿猴慢病毒ENV蛋白的至少一个片段， 所述片段包含至少40个氨基酸， 所述片段包含含有下列氨基酸序列的突变的免疫抑制结构域(ISU):
A-[I/V]-E-[K/R]-Xa-Xb-X-D-Q(SEQ ID NO:416)， 其中， X代表任意氨基酸， 并且
Xa 为 A，G，或 R，并且 Xb 为 L，I，V，M 或 P, 或 Xa为Y，I，H，C或T，并且Xb为F，G或R0
8.权利要求1、2、4或6的任一项的药物组合物，其中
Xa 为 R，并且 Xb 为 C，D, E, H, I, K, L, M, N, P, Q, S，T，V，W 或 Y，或
Xa 为 C，D, E, H, I, K, M, N, P, Q, S，T，V，W 或 Y，并且 Xb 为 R，或 Xa为R，并且Xb为R。
9.权利要求1至8的任一项的药物组合物，其中所述分离的突变的人或猿猴慢病毒ENV蛋白或所述分离的突变的人或猿猴慢病毒ENV蛋白的所述片段包含下列氨基酸序列之
A-1-E-K-Xa-Xb-X-DQ(SEQ ID NO:422)，
A-1-E-R-Xa-Xb-X-DQ(SEQ ID NO:423),
A-V-E-K-Xa-Xb-X-DQ(SEQ ID NO:424)，
A-V-E-R-Xa-Xb-X-DQ(SEQ ID NO:425)。
10.权利要求1至9的任一项的药物组合物，其中所述分离的突变的人或猿猴慢病毒ENV蛋白或所述分离的突变的人或猿猴慢病毒ENV蛋白的所述片段包含下列氨基酸序列之
SEQ ID NO:13,SEQ ID NO:42,SEQ ID NO:71，SEQ ID NO:9 至 12，
SEQ ID NO:14 至 41，
SEQ ID NO:43 至 70，和
SEQ ID NO:72 至 95。
11.权利要求1至9的任一项的药物组合物，其中所述分离的突变的人或猿猴慢病毒ENV蛋白或所述分离的突变的人或猿猴慢病毒ENV蛋白的所述片段包含下列氨基酸序列之
SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO:42,SEQ ID NO:71,
SEQ ID NO:9、11、15 至 21、23 至 29、31 至 38、40、44 至 50、52 至 58、60 至 67、69、73 至79,81 至 87,89 至 95。
12.权利要求1至9的任一项的药物组合物，其中所述分离的突变的人或猿猴慢病毒ENV蛋白或所述分离的突变的人或猿猴慢病毒ENV蛋白的所述片段包含下列氨基酸序列之一:SEQ ID NO:96 至 211。
13.权利要求1至9的任一项的药物组合物，其中所述分离的突变的人或猿猴慢病毒ENV蛋白或所述分离的突变的人或猿猴慢病毒ENV蛋白的所述片段包含下列氨基酸序列之一:SEQ ID NO:96、98、100、102 至 108,110 至 116,118 至 125、127、129、131 至 137,139 至145,147 至 154、156、158、160 至 166,168 至 174,176 至 183、185、187、189 至 195,197 至203,205 至 211。
14.权利要求1至9的任一项的药物组合物，其中所述分离的突变的人或猿猴慢病毒ENV蛋白由下列氨基酸序列之一组成:SEQ ID NO:212至269。
15.权利要求1至9的任一项的药物组合物，其中所述分离的突变的人或猿猴慢病毒ENV蛋白由下列氨基酸序列之一组成:SEQ ID NO:212、214、216、218至224,226至232,234至 241、243、245、247 至 253,255 至 261,263 至 269。
16.权利要求1至15的任一项的药物组合物，其中所述突变的蛋白在SEQID NO:426的位置29、36和37上的至少一个氨基酸中包含另外的突变:
A [I/V] E [K/R] XaXbX1DQX2X3LX4X5WGC [A/S] [F/G] X6X7CVX8TX9VPXcX10Z1Z2Z3Z4Z5XdXe [S/T](SEQ ID NO:426) 其中 Xa和Xb如权利要求1至15的任一项中所定义， X1至Xltl代表任意氨基酸， Z1至Z5彼此独立地代表无氨基酸或代表任意氨基酸 以便
?Xc 为 A，C，D, E, F，G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S，T, V, Y 或被删除，优选为 A, D，或 N,
?Xd 为 A，C，D, E, F，G, H, I, L, M, N, P, Q, R, S，T, V, Y, W 或被删除，优选为 A，G，S 或 Y,
?Xe 为 A，C，D, E, F，G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, V, Y, W 或被删除，优选为 A，D 或 N。
17.权利要求1至16的任一项的药物组合物，其中所述突变的蛋白由由SEQID NO:271至SEQ ID NO:283组成的组中的氨基酸序列之一组成。
18.—种药物组合物，其包含作为活性物质的编码权利要求1至17的任一项中定义的突变的人或猿猴慢病毒ENV蛋白或所述突变的人或猿猴慢病毒ENV蛋白的片段的核酸分子。
19.权利要求18的药物组合物，其中所述核酸分子包含在载体中，所述载体包含允许如权利要求1至17的任一项中定义的突变的人或猿猴慢病毒ENV蛋白或所述突变的人或猿猴慢病毒ENV蛋白的片段表达的工具。
20.权利要求19的药物组合物，其中所述载体选自麻疹病毒载体、金丝雀痘载体、痘病毒载体、禽痘载体、腺病毒载体、慢病毒载体、仙台病毒载体、巨细胞病毒载体或修饰的痘苗病毒Ankara载体。
21.权利要求18至20的任一项的药物组合物，其包含至少一个核酸分子，所述核酸分子编码人或猿猴慢病毒，优选与突变的慢病毒ENV蛋白相同来源的慢病毒的GAG蛋白和/或PRO蛋白和/或POL蛋白和/或突变的NEF蛋白，其中所述突变的NEF蛋白大体上不具有免疫抑制性质。
22.权利要求19至21的任一项的药物组合物，其中编码突变的人或猿猴慢病毒ENV蛋白或所述突变的人或猿猴慢病毒ENV蛋白的片段的所述核酸分子，包含于与还包含所述至少一个编码GAG蛋白和/或PRO蛋白和/或POL蛋白和/或突变的NEF蛋白的核酸分子的载体相同的载体中，其中所述突变的NEF蛋白大体上不具有免疫抑制性质。
23.权利要求19至22的任一项的药物组合物，其中编码突变的人或猿猴慢病毒ENV蛋白或所述突变的人或猿猴慢病毒ENV蛋白的片段的所述核酸分子，包含于与还包含所有所述至少一个编码GAG蛋白和/或PRO蛋白和/或POL蛋白和/或突变的NEF蛋白的核酸分子的载体相同的载体中，其中所述突变的NEF蛋白大体上不具有免疫抑制性质。
24.权利要求19至21的任一项的药物组合物，其中编码突变的人或猿猴慢病毒ENV蛋白或所述突变的人或猿猴慢病毒ENV蛋白的片段的所述核酸分子，包含于与至少一个包含所述至少一个编码GAG蛋白和/或PRO蛋白和/或POL蛋白和/或突变的NEF蛋白的核酸分子的载体不同的载体中，其中所述突变的NEF蛋白大体上不具有免疫抑制性质。
25.权利要求19至21或24的任一项的药物组合物，其中编码突变的人或猿猴慢病毒ENV蛋白或所述突变的人或猿猴慢病毒ENV蛋白的片段的所述核酸分子、编码GAG蛋白的所述核酸分子、编码PRO蛋白的所述核酸分子、编码POL蛋白的所述核酸分子和编码大体上不具有免疫抑制性质的突变的NEF蛋白的所述核酸分子全都包含于彼此不同的载体中。
26.权利要求18至21的任一项的药物组合物，其包含至少一个编码人或猿猴慢病毒的GAG蛋白和/或突变的NEF蛋白的核酸分子，其中所述突变的NEF蛋白大体上不具有免疫抑制性质，所述慢病毒优选具有与突变的慢病毒ENV蛋白相同的来源。
27.权利要求18至21或26的任一项的药物组合物，其中编码突变的人或猿猴慢病毒ENV蛋白或所述突变的人或猿猴慢病毒ENV蛋白的片段的所述核酸分子，包含于与还包含所述至少一个编码GAG蛋白和/或突变的NEF蛋白的核酸分子的载体相同的载体中，其中所述突变的NEF蛋白大体上不具有免疫抑制性质。
28.权利要求18至21或26至27的任一项的药物组合物，其中编码突变的人或猿猴慢病毒ENV蛋白或所述突变的人或猿猴慢病毒ENV蛋白的片段的所述核酸分子，包含于与还包含编码GAG蛋白和突变的NEF蛋白的核酸分子的载体相同的载体中，其中所述突变的NEF蛋白大体上不具有免疫抑制性质。
29.权利要求18至21或26至28的任一项的药物组合物，其中编码突变的人或猿猴慢病毒ENV蛋白或所述突变的人或猿猴慢病毒ENV蛋白的片段的所述核酸分子，包含于与还包含编码GAG蛋白和突变的NEF蛋白的核酸分子的载体相同的载体中，其中所述突变的NEF蛋白大体上不具有免疫抑制性质，所述载体是麻疹病毒载体或金丝雀痘载体。
30.权利要求18至21或26的任一项的药物组合物，其中编码突变的人或猿猴慢病毒ENV蛋白或所述突变的人或猿猴慢病毒ENV蛋白的片段的所述核酸分子，包含于与至少一个包含所述至少一个编码GAG蛋白和/或突变的NEF蛋白的核酸分子的载体不同的载体中，其中所述突变的NEF蛋白大体上不具有免疫抑制性质。
31.权利要求18至21、26或30的任一项的药物组合物，其中编码突变的人或猿猴慢病毒ENV蛋白或所述突变的人或猿猴慢病毒ENV蛋白的片段的所述核酸分子、编码GAG蛋白的所述核酸分子和编码大体上不具有免疫抑制性质的突变的NEF蛋白的所述核酸分子，全都包含在彼此不同的载体中。
32.权利要求1至31的任一项的药物组合物，其与至少一种抗病毒化合物组合，优选用于同时、分开或相继的使用。
33.权利要求1至32的 任一项的药物组合物，其用于刺激宿主生物的免疫应答。
34.权利要求1至33的任一项的药物组合物，其用于预防或治疗慢病毒感染，优选HIV-1感染、HIV-2感染或SIV感染。
35.权利要求1至34的任一项的药物组合物，其用作疫苗，特别地抗HIV-1感染、HIV-2感染或SIV感染的疫苗。
36.一种用于获得如权利要求1至35的任一项中定义的药物组合物的活性物质的方法,其由改变如下物质的免疫抑制性质组成: 野生型人或猿猴慢病毒ENV蛋白， 或所述野生型人或猿猴慢病毒ENV蛋白的片段，所述片段包含至少40个氨基酸， 所述ENV蛋白或其片段提供包含含有下列氨基酸序列的免疫抑制结构域(ISU)的跨膜亚基(TM):
A-[I/V]_E-[K/R]-X’ a-X’ b-X-D-Q(SEQ ID NO:427), 其中 X代表任意氨基酸，
X，a 为 C，D, E, H, I, K, Μ, N, P, Q, S，T，V，W 或 Y，和
X，b 为 C，D, E, H, I, K, L, Μ, N, P, Q, S, T，V，W 或 Y, 所述方法包括引入至少一个X’ a和/或X’ b的突变的步骤， 以获得: 大体上不具有免疫抑制活性的分离的突变的人或猿猴慢病毒ENV蛋白， 所述突变的人或猿猴慢病毒ENV蛋白与选自SEQ ID NO:216, SEQ ID NO:420和SEQID NO:421的一个序列具有至少70%的同一性，优选至少80%的同一性， 或大体上不具有免疫抑制活性的所述分离的突变的人或猿猴慢病毒ENV蛋白的片段，所述片段包含至少40个氨基酸， 所述突变的ENV蛋白及其片段包含含有下列氨基酸序列的突变的免疫抑制结构域(ISU):
A-[I/V]-E-[K/R]-Xa-Xb-X-D-Q(SEQ ID NO:416)，其中 X代表任意氨基酸， 并且
Xa 为 A, F，G, L, R 或被删除，并且 Xb 为 C，D, E, H, I, K, L, M, N, P, Q, S，T，V，W 或 Y，或
Xa 为 C，D, E, H, I, K, M, N, P, Q, S，T，V，W 或 Y，并且 Xb 为 A, F，G, R 或被删除，或
Xa为A, F，G, L, R或被删除，并且Xb为A, F，G, R或被删除， 上述突变的人或猿猴慢病毒ENV蛋白或如上定义的片段的免疫抑制活性的所述大体上不存在，易于通过这样的事实来评估，即，在牵涉移植的肿瘤细胞排斥的体内测定中，所述肿瘤细胞被转导以表达所述突变的ENV蛋白或所述片段(突变的ENV肿瘤细胞)，或所述肿瘤细胞被转导以表达所述野生型ENV蛋白或其片段(野生型ENV肿瘤细胞)，或所述肿瘤细胞未被转导(正常肿瘤细胞)， 下列比率 所述突变的ENV蛋白或所述片段的免疫抑制指数(i突变的env) /野生型ENV蛋白的免疫抑制指数α 野生型env)小于0.5, i *$Menv被定义为:(突变的ENV肿瘤细胞达到 的最大面积-正常肿瘤细胞达到的最大面积)/(正常肿瘤细胞达到的最大面积)，和 iMenv被定义为:(野生型ENV肿瘤细胞达到的最大面积-正常肿瘤细胞达到的最大面积)/(正常肿瘤细胞达到的最大面积)。
37.权利要求36的用于获得如权利要求1至35的任一项中定义的药物组合物的活性物质的方法，其由改变如下物质的免疫抑制性质组成: 野生型人或猿猴慢病毒ENV蛋白， 或所述野生型人或猿猴慢病毒ENV蛋白的片段，所述片段包含至少40个氨基酸， 所述ENV蛋白或其片段提供包含含有下列氨基酸序列的免疫抑制结构域(ISU)的跨膜亚基(TM):
A-[I/V]-E-[K/R]-Y-L-X-D-Q(SEQ ID NO:1), 其中 X代表任意氨基酸， 所述方法包括在位置5的Y和/或位置6的L上引入至少一个突变的步骤， 以获得: 大体上不具有免疫抑制活性的分离的突变的人或猿猴慢病毒ENV蛋白， 或大体上不具有免疫抑制活性的所述分离的突变的人或猿猴慢病毒ENV蛋白的片段，所述片段包含至少40个氨基酸， 所述突变的ENV蛋白及其片段包含含有下列氨基酸序列的突变的免疫抑制结构域(ISU):
A-[I/V]-E-[K/R]-Xa-Xb-X-D-Q(SEQ ID NO:416)， 其中 X代表任意氨基酸， 并且
Xa 为 A, F，G, L, R 或被删除，并且 Xb 为 C，D, E, H, I, K, L, M, N, P, Q, S，T，V，W 或 Y，或Xa 为 C，D, E, H, I, K, Μ, N, P, Q, S, T，V，W 或 Y，并且 Xb 为 Α, F，G, R 或被删除，或
Xa为Α, F，G, L, R或被删除，并且Xb为Α, F，G, R或被删除。
38.权利要求36或37的用于获得如权利要求1至35的任一项中定义的药物组合物的活性物质的方法， 其中所述分离的突变的人或猿猴慢病毒ENV蛋白大体上不具有免疫抑制活性， 或所述分离的突变的人或猿猴慢病毒ENV蛋白的片段大体上不具有免疫抑制活性，所述片段包含至少40个氨基酸， 所述突变的ENV蛋白及其片段包含含有下列氨基酸序列的突变的免疫抑制结构域(ISU):
A-[I/V]-E-[K/R]-Xa-Xb-X-D-Q(SEQ ID NO:416)， 其中 X代表任意氨基酸， 并且
Xa 为 A，F，G，L 或 R，并且 Xb 为 C，D, E, H, I, K, L, M, N, P, Q, S，T，V，W 或 Y，或
Xa 为 C，D, E, H, I, K, M, N, P, Q, S，T，V，W 或 Y，并且 Xb 为 A，F，G 或 R，或
Xa 为 A，F，G，L 或 R，并且 Xb 为 A，F，G 或 R0
39.权利要求36至38任一项的用于获得如权利要求1至35的任一项中定义的药物组合物的活性物质的方法， 其中所述分离的突变的人或猿猴慢病毒ENV蛋白大体上不具有免疫抑制活性， 或所述分离的突变的人或猿猴慢病毒ENV蛋白的片段大体上不具有免疫抑制活性，所述片段包含至少40个氨基酸， 所述突变的ENV蛋白及其片段包含含有下列氨基酸序列的突变的免疫抑制结构域(ISU):
A-[I/V]-E-[K/R]-Xa-Xb-X-D-Q(SEQ ID NO:416)， 其中 X代表任意氨基酸， 并且 Xa 为 A，F，G，L 或 R，并且 Xb 为 L，I，V，M 或 P，或 Xa为Y，I，H，C或T，并且Xb为A，F，G或R，或 Xa 为 A，F，G，L 或 R，并且 Xb 为 A，F，G 或 R0
40.权利要求36至38任一项的用于获得如权利要求1至35的任一项中定义的药物组合物的活性物质的方法， 其中所述分离的突变的人或猿猴慢病毒ENV蛋白大体上不具有免疫抑制活性， 或所述分离的突变的人或猿猴慢病毒ENV蛋白的片段大体上不具有免疫抑制活性，所述片段包含至少40个氨基酸， 所述突变的ENV蛋白及其片段包含含有下列氨基酸序列的突变的免疫抑制结构域(ISU):
A-[I/V]-E-[K/R]-Xa-Xb-X-D-Q(SEQ ID NO:416)， 其中X代表任意氨基酸， 并且
Xa 为 A，G，或 R，并且 Xb 为 C，D, E, H, I, K, L, M, N, P, Q, S，T，V，W 或 Y，或
Xa 为 C，D, E, H, I, K, M, N, P, Q, S，T，V，W 或 Y，并且 Xb 为 F，G 或 R，或
Xa为F或L,并且Xb为F，G或R,或
Xa为A, G或R,并且Xb为A。
41.权利要求36或40的用于获得如权利要求1至35的任一项中定义的药物组合物的活性物质的方法， 其中所述分离的突变的人或猿猴慢病毒ENV蛋白大体上不具有免疫抑制活性， 或所述分离的突变的人或猿猴慢病毒ENV蛋白的片段大体上不具有免疫抑制活性，所述片段包含至少40个氨基酸， 所述突变的ENV蛋白及其片段包含含有下列氨基酸序列的突变的免疫抑制结构域(ISU):
A-[I/V]-E-[K/R]-Xa-Xb-X-D-Q(SEQ ID NO:416)， 其中 X代表任意氨基酸， 并且 Xa为A，G或R，并且Xb为L，I，V，M或P，或 Xa为Y，I，H，C或T，并且Xb为F，G或R，或 Xa为F或L,并且Xb为F，G或R,或 Xa为A, G或R,并且Xb为A，或 Xa为A，G或R，并且Xb为F，G或R0
42.权利要求36、37、38或40任一项的用于获得如权利要求1至35的任一项中定义的药物组合物的活性物质的方法， 其中所述分离的突变的人或猿猴慢病毒ENV蛋白大体上不具有免疫抑制活性， 或所述分离的突变的人或猿猴慢病毒ENV蛋白的片段大体上不具有免疫抑制活性，所述片段包含至少40个氨基酸， 所述突变的ENV蛋白及其片段包含含有下列氨基酸序列的突变的免疫抑制结构域(ISU):
A-[I/V]-E-[K/R]-Xa-Xb-X-D-Q(SEQ ID NO:416)， 其中， X代表任意氨基酸， 并且
Xa 为 A，G 或 R，并且 Xb 为 C，D, E, H, I, K, L, M, N, P, Q, S，T，V，W 或 Y，或
Xa 为 C，D, E, H, I, K, M, N, P, Q, S，T，V，W 或 Y，并且 Xb 为 F，G 或 R0
43.权利要求36至42任一项的用于获得如权利要求1至35的任一项中定义的药物组合物的活性物质的方法， 其中所述分离的突变的人或猿猴慢病毒ENV蛋白大体上不具有免疫抑制活性， 或所述分离的突变的人或猿猴慢病毒ENV蛋白的片段大体上不具有免疫抑制活性，所述片段包含至少40个氨基酸， 所述突变的ENV蛋白及其片段包含含有下列氨基酸序列的突变的免疫抑制结构域(ISU):
A-[I/V]-E-[K/R]-Xa-Xb-X-D-Q(SEQ ID NO:416)， 其中， X代表任意氨基酸， 并且 Xa为A，G或R，并且Xb为L，I，V，M或P，或 Xa为Y，I，H，C或T，并且Xb为F，G或R0
44.权利要求36、37、38、40或42任一项的用于获得如权利要求1至35的任一项中定义的药物组合物的活性物质的方法， 其中所述分离的突变的人或猿猴慢病毒ENV蛋白大体上不具有免疫抑制活性， 或所述分离的突变的人或猿猴慢病毒ENV蛋白的片段大体上不具有免疫抑制活性，所述片段包含至少40个氨基酸， 所述突变的ENV蛋白及其片段包含含有下列氨基酸序列的突变的免疫抑制结构域(ISU):
A-[I/V]-E-[K/R]-Xa-Xb-X-D-Q(SEQ ID NO:416)， 其中， X代表任意氨基酸， 并且
Xa 为 R，并且 Xb 为 C，D, E, H, I, K, L, M, N, P, Q, S，T，V，W 或 Y，或
Xa 为 C，D, E, H, I, K, M, N, P, Q, S，T，V，W 或 Y，并且 Xb 为 R，或 Xa为R，并且Xb为R。
45.权利要求36至44任一项的用于获得如权利要求1至35的任一项中定义的药物组合物的活性物质的方法， 其中所述分离的突变的人或猿猴慢病毒ENV蛋白大体上不具有免疫抑制活性， 或所述分离的突变的人或猿猴慢病毒ENV蛋白的片段大体上不具有免疫抑制活性，所述片段包含至少40个氨基酸， 所述突变的ENV蛋白及其片段在SEQ ID NO:X的位置29、36和37上的至少一个氨基酸中包含另外的突变:
A [I/V] E [K/R] XaXbX1DQX2X3LX4X5WGC [A/S] [F/G] X6X7CVX8TX9VPXcX10Z1Z2Z3Z4Z5XdXe [S/T](SEQ ID NO:426) 其中 Xa和Xb如权利要求1至15的任一项中所定义， X1至Xltl代表任意氨基酸， Z1至Z5彼此独立地代表无氨基酸或任意氨基酸 以便 ?Xc 为 A，C，D, E, F，G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S，T, V, Y 或被删除，优选为 A, D，或 N,?Xd 为 A，C，D, E, F，G, H, I, L, M, N, P, Q, R, S，T, V, Y, W 或被删除，优选为 A，G，S 或 Y,? Xe 为 A，C，D, E, F，G, H, I, K, L, Μ, N, P, Q, R, Τ, V, Y, W 或被删除，优选为 A，D 或 N。
【文档编号】C07K14/005GK104169295SQ201280060076
【公开日】2014年11月26日 申请日期:2012年12月7日 优先权日:2011年12月7日
【发明者】T·梅德曼 申请人:维洛克塞斯简易股份公司, 国家科研中心, 巴黎第十一大学, 古斯达威罗斯研究所