一种与水稻毛状体发育相关的蛋白gl3及其编码基因与应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物基因工程和生物技术领域，具体涉及一个位于水稻第6染色体长 臂上控制水稻叶片和颖壳毛状体基因(Waforwl5J)的克隆及应用。
【背景技术】
[0002] 毛状体是着生于植物表面的一种细小披针形结构，一般由1-2个细胞构成，具有 抵制非生物胁迫的作用。在拟南芥中，毛状体主要分布于萼片、叶子和茎上。拟南芥的毛状 体由单个细胞发育而来，其发育生长是研究植物细胞分化的经典模型。至今，已经克隆了一 系列控制拟南芥毛状体发育的基因，如675^，7/7?和57?等（Yu et al. 2010)。TTiW和是拟南芥毛状体生长过程中起关键作用的两个基因。TTiW编 码WD40蛋白，突变体不仅无毛状体结构，而且还会影响花青素和种皮黏液的合成以及 根毛的生长（Galway et al. 1994)。编码MYB转录因子，其在毛状体发育的起始阶段 表达量特别高（Larkin et al. 1993)。
[0003] 水稻毛状体主要分布于叶片及颖壳表面。叶片上的毛状体基部膨大凸起，顶端细 小；而颖壳上的毛状体长短不一，越靠近颖壳顶端越长，特别是在顶部，变成长而且粗的刚 毛。在水稻收获季节，手臂接触叶片和籽粒有刺痛感就是由毛状体引起的。水稻叶片和颖 壳表面没有毛状体的称之为"光身稻""光壳稻"或者"光叶稻"等，主要分布于美国、非洲 和我国的云贵高原。由于光身稻叶片较厚、光适应力强和易于收获等特点，越来越被研究者 所重视。在水稻毛状体发育机制研究上，至今报道与之相关的基因有W么份7,份满口 /??，但是大部分只是无毛状体水稻材料的发现和基因的粗定位，还未见基因被克隆的报道。 因此，本领域有必要发掘调控水稻毛状体发育的基因并研究其功能，从而加深人们对水稻 毛状体细胞发育机制的认识，为以后"光身稻"育种奠定理论基础。
【发明内容】
[0004] 针对上述研究背景，本发明目的在于提供一种与水稻毛状体性状相关的蛋白质及 其基因，以及由此获得的转基因水稻细胞，和利用所述基因对水稻叶片和颖壳上毛状体进 行改造的方法。
[0005] 为了解决上述问题，本发明提供一种水稻毛状体基因编码的蛋白，该蛋白 的氨基酸序列如SEQ ID N0:3所示。
[0006] SEQ ID N0:3序列是本发明分离克隆来源于日本晴的0sGL3蛋白的氨基酸序列。 作为本发明你6^5编码蛋白的改进，所述氨基酸序列还包括在SEQ ID NO:3所示序列的任 何位置添加、取代、插入或缺失一个或者多个氨基酸残基而生成的氨基酸序列或衍生物。
[0007] 本发明提供了编码上述蛋白的水稻毛状体基因该基因具有如SEQ ID NO: 1 或SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。
[0008] SEQ ID NO: 1序列是本发明分离克隆来源于水稻品种"日本晴"的因的核 苷酸序列，序列全长1671 bp。
[0009] SEQ ID N0:2序列是本发明分离克隆来源于日本晴的因的蛋白编码核苷 酸序列，序列全长1296 bp。
[0010] 作为本发明因的改进，所述核苷酸序列还包括在SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 2所示序列的任何位置添加、取代、插入或缺失一个或者多个核苷酸而生成突变体、等位 基因或衍生物。
[0011] 本发明提供了构建干扰基因表达的pLHRNAi-〇sGL3载体的干扰特异序列和 特异序列的PCR扩增引物。
[0012] 本发明提供了含有pLHRNAi-〇SGL3载体的大肠杆菌细胞质粒。
[0013] 本发明提供了含有pLHRNAi-〇sGL3载体转化水稻的双元表达载体质粒。
[0014] 本发明提供了含有pLHRNAi-〇sGL3载体的宿主细胞。
[0015] 本发明还提供一种宿主细胞，所述宿细胞为大肠杆菌细胞、农杆菌细胞或水稻细 胞。
[0016] 本发明提供了检测水稻AsffilS基因表达量的Real-time PCR扩增引物序列。
[0017] 本发明提供了改良水稻叶片和颖壳毛状体的方法，包括利用pLHRNAi-〇sGL3载体 转化水稻细胞，再将转化后的水稻细胞培育成植株。
[0018] 本发明提供水稻毛状体基因 Asffi亦勺用途，包括利用pLHRNAi-〇sGL3载体转化水 稻，所述转基因水稻的叶片和颖壳毛状体减少或者消失。
[0019] 所述水稻具体为粳稻。
[0020] 实现本发明的具体技术步骤如下： 1.水稻无毛状体材料来源和遗传分析 本发明的水稻料来自中国云南省的地方品种，通过与籼稻N22杂交，证明无毛 状体性状受隐性单基因控制。
[0021] 2. AsffilS基因的精细定位与目的基因预测 通过初步定位和精细定位，将基因定位在M72和M31两个标记之间的21 kb区 间内，该区间包括3个开放阅读框（0RF)。通过测序发现，第一个开放阅读框有个碱基发生 了突变，导致翻译的提前终止。
[0022] 3. AsffilS基因的鉴定和功能分析 通过转基因技术，分析结果表明本发明获得的转基因植株能够产生材料无毛状 体的表型（图4)，证明本发明正确分离克隆了 AsffilS基因。氨基酸序列分析表明0sGL3编码 了一种转移酶。
[0023] 详细的技术发明细节在《【具体实施方式】》中列出。
[0024] 本发明的优点是： 本发明首次分离克隆了水稻毛状体发育相关基因 ffiJ，该基因属于转移酶基因家族， 利用转基因手段得到的基因干扰转基因水稻，结果表明，基因的表达量可以显著影响水 稻叶片和颖壳表面毛状体的数量，表明该基因在水稻毛状体发育中发挥了重要作用。利用 基因在水稻无毛状体"光身稻"育种中具有广泛的应用前景。
【附图说明】
[0025] 图1 :〇5^Λ5和N22颖壳毛状体比较。左为有毛状体的正常水稻品种N22,右为无 毛状体材料05^7J。
[0026] 图2 : AsffilS基因定位图和05^7^5基因突变位点。
[0027] 图3 :构建pLHRNAi-〇sGL3干扰载体所用的载体pLHRNAi结构示意图。
[0028] 图4 :干扰Asffi堪因转基因植株检测，其中A:左为Kitaake转化空干扰 载体PLHRNAiTtlR基因植株种子，颖壳表面布满毛状体；右为Kitaake转化干扰载体 pLHRNAi-〇sGL3 Ttl转基因植株种子，大部分种子颖壳表面比较光滑，只有少数种子表面有 少许毛状体；B :用Real-time PCR方法检测阳性pLHRNAi-〇sGL3转基因植株AsffilS基因的 表达量。
【具体实施方式】
[0029] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所 用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0030] 实施例1 : 和N22颖壳毛状体观察 成熟期收获吧2和种子，太阳光照晒干，用体式显微镜对种子拍照记录（Leica DFC420)(图1)。结果显示，与正常的水稻品种Ν22相比，种子颖壳光滑，没有毛状体 着生。用手顺着颖尖到互颖方向滑动，没有毛刺的感觉；05^5植株叶子也比较光滑，从手 臂上划过没有刺痛的感觉。
[0031] 实施例：2 : AsffilS基因的分离克隆 I. 料来源： 水稻（Oryza sativa L. 料来自中国云南省的地方品种，该材料在中国农业科 学院作物科学研究所获得。
[0032] 2.基因定位群体构建： 通过与籼稻品种N22杂交，构建F2*离群体，进行遗传分析。分析结果为：F i代种 子表型与N22没有差异，均可看见明显的毛状体结构；在F2代群体中随机选择229个单株， 野生型与突变体表型的单株数分别是174和55,卡方测验结果（x21:3= 0. 1179)符合3:1的 分离比，说明无毛状体性状受单隐性核基因控制。
[0033] 灌浆期，利用体式显微镜观察颖壳毛状体的有无，从F2群体中挑选1440株 表型植株作为基因定位群体。每个单株取叶片，用于提取基因组DNA。
[0034] 3. AsffilS基因定位： 采用CTAB法（Ma et al.，2013)提取植株叶片总基因组DNA。选取均匀分布于水稻 12条染色体上的495对SSR标记和Indel标记，对05^7满P N22进行多态性分析，筛选有 多态性的引物。PCR扩增反应体系20 μ 1，包括2 μ I DNA (20 ng/μL)模板，2 μ 1 (2 pmol，F+R)引物，2 μL IOXBuffer (Mg2+Free), 1.2 μL MgCl2 (25 mM)，0.1 μL dNTP (2.5 mM)，0.2 μL rTaq(5 U/yl，TaKaRa)和 12.5 μL ddH20;扩增反应在 Professional Thermocycler (Biometra In