桑树过氧化物酶MmPOD.12及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物基因工程领域，涉及到一种桑树过氧化物酶12基因克隆和其在 胁迫条件下的表达应用。
【背景技术】
[0002] 氧化物和抗氧化物在细胞内的平衡对于细胞的功能、调节和适应各种生长条件是 极为重要的。活性氧（reactive oxygen species, R0S)是机体有氧代谢的一个有毒产物， 但也是细胞内信号连接的介体，过量产生的活性氧可能会导致氧胁迫，使细胞发生不可修 复的损伤，最终导致细胞凋亡。已知各种逆境胁迫都可诱发细胞内活性氧浓度的增加而导 致氧化胁迫所以植物抗逆性的形成常常与抗氧化系统活性的增强密切相关。
[0003] 植物在生长的过程中，会受到各种环境的胁迫（如干旱，水害，热害，冷害，病虫 害和重金属离子等），这些逆境将导致植物体内产生大量的活性氧（reactive oxygen species，ROS)，ROS可以通过破坏核酸，氧化蛋白来影响细胞的功能，从而影响植物的正常 生长。环境胁迫引起的ROS的积累可以通过抗氧化酶系统来消除，植物体内的抗氧化酶系 统主要由超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，S0D)、过氧化氢酶（catalase，CAT)、过 氧化物酶（peroxidase，POD)、抗坏血酸（ascorbicAcid，AsA)、谷脫甘肽（glu.tathione， GH)、抗坏血酸过氧化物酶（ascorbate perox. idase，APx)等构成，植物抗胁迫能力的提高 可能与体内的抗氧化酶系统有关。
[0004] 植物为保证其代谢机能的正常进行对本身ROS的伤害，具有适应调节和抵御的能 力，具体表现为在体内存在着一套精细而又复杂的抗氧化系统，其主要特征是降低或破坏 抗氧化酶的活性或抗氧化物质的含量，使ROS的代谢失衡。在正常条件下ROS在植物体内 的产生和清除处于一种动态平衡，其浓度也维持在一个较低的水平，此时ROS不会损伤植 物体而显示出独特的生理作用。但在逆境条件下这种动态平衡遭到破坏，植物抗氧化系统 清除ROS的能力下降，大量积累的ROS对植物造成伤害。这种伤害一方面使ROS的产生加 快，另一方面破坏了以SOD为主的抗氧化系统，导致ROS进一步积累，使植物正常代谢遭到 破坏。为了清除R0S。植物会应激地产生有效的抗氧化酶和抗氧化物质。因此，逆境胁迫下 清除ROS的能力也会发生变化。
[0005] 过氧化物酶（POD)广泛存在于植物体内不同组织中，它作为活性较高的适应性 酶，能够反映植物生长发育的特点、体内代谢状况以及对外界环境的适应性。POD的作用具 有双重性，一方面，POD可在逆境或衰老初期表达，可清除H202,表现为保护效应，为细胞活 性氧保护酶系统的成员之一；另一方面，POD也可在逆境或衰老后期表达，参与活性氧的 生成、叶绿素的降解，并能引发膜脂过氧化作用，表现为伤害效应，是植物体衰老到一定阶 段的产物，甚至可作为衰老指标。
[0006] 过氧化物酶（peroxidases. POD ;EC1. 11. I. X)是一大类催化各种底物发生氧化的 生物体保护酶类家族。其最佳底物为过氧化氢（H2O2),催化过氧化氢（H2O 2)转变成水.解 除H2O2的毒害。它对H2O2的要求是非常专一的而对供氢体的要求则较为广泛；酚类、胺类 化合物、某些杂环化合物和一些无机离子等都可以作为过氧化物酶的供氢体。根据结构上 是否含有哑铁血红素.POD可以分为2种类型，含有砸铁血红素的POX是由单一肽链与1个 铁卟啉辅基结合构成的血红蛋白。
[0007] IAA是植物体内一种垂要的激素，早在1965年人们已经发现POD参与了 IAA代谢 的过程。研宄表明POD具有催化IAA氧化脱羧的能力，但并不是所有的POD同工酶都具有 催化IAA氧化脱羧的能力。在众多参与IAA氧化作用的POD中，对烟草的阴离子POD有着 比较深入的研宄。该酶足烟草中的一个主要POD的同工酶，它能在体外氧化IAA。
[0008] 过氧化物酶可以清除植物体内尤其是叶绿体中的H2O2，从而提高植物对氧化胁迫 的耐受性。过氧化物酶在植物生长发育和逆境胁迫响应等生理过程中都发挥着非常重要的 作用，尤其是植物受到逆境胁迫时，过氧化物酶可以快速清除细胞中产生的过量H2O2，使细 胞免受活性氧毒害。
[0009] 逆境是指对植物生存与发育不利的各种环境因素的总称。植物对逆境的抵抗和忍 耐能力叫植物抗逆性。研宄表明过氧化物酶在多种逆境中发挥重要作用，研宄发现在干旱 胁迫、空气污染、微量元素缺乏、离子胁迫、过度光强、紫外照射以及盐胁迫等逆境下，过氧 化物酶活性迅速增加，过氧化物酶的表达起到消除逆境胁迫产生的自由基的作用。
[0010] 我国是桑树的起源中心，种质资源极为丰富。经过桑树种质资源及育种工作者几 十年的努力，现在全国已收集保存有近3000份桑树种质资源，其中不少资源都具有果用价 值、药用价值、经济价值等。我们用已克隆得到的鲁桑品种（Morus multicaulis)育MP0D12 基因部分mRNA序列。通过生物信息学分析其序列特征。同时，利用荧光定量PCR的方法检 测了 MP0D12在干旱、盐、ABA、SA胁迫条件下的转录水平的变化规律。通过对该基因的研宄， 使我们从分子水平了解到桑树P0D12基因在不同胁迫条件下的表达情况
【发明内容】
[0011] 解决的技术问题：本发明提供一种桑树过氧化物酶MmPOD. 12及其应用，可以用于 桑树中的过氧化物酶基因在环境胁迫下的表达调控。
[0012] 技术方案：桑树过氧化物酶MmPOD. 12,序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0013] 编码桑树过氧化物酶MmPOD. 12的基因，序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0014] 上述桑树过氧化物酶MmPOD. 12在作为植物非生物胁迫表达标志物中的应用。
[0015] 所述非生物胁迫为干旱、高盐ABA、或SA胁迫。
[0016] 所述植物为桑树（Morus multicaulis)。
[0017] 上述编码桑树过氧化物酶MmPOD. 12的基因在作为植物非生物胁迫表达标志物中 的应用。
[0018] 有益效果：过氧化物酶可以清除植物体内尤其是叶绿体中的H2O2，从而提高植物 对氧化胁迫的耐受性。过氧化物酶在植物生长发育和逆境胁迫响应等生理过程中都发挥着 非常重要的作用，尤其是植物受到逆境胁迫时，过氧化物酶可以快速清除细胞中产生的过 量H2O2，使细胞免受活性氧毒害。逆境是指对植物生存与发育不利的各种环境因素的总称。 植物对逆境的抵抗和忍耐能力叫植物抗逆性。研宄表明过氧化物酶在多种逆境中发挥重要 作用，研宄发现在干旱胁迫、空气污染、微量元素缺乏、离子胁迫、过度光强、紫外照射以及 盐胁迫等逆境下，过氧化物酶活性迅速增加，过氧化物酶的表达起到消除逆境胁迫产生的 自由基的作用。
[0019] 本发明所述桑树过氧化物酶MmPOD. 12,完善桑树基因组同时提供了桑树过氧化物 酶在非生物胁迫条件的表达分析和应用。
【附图说明】
[0020] 图1为桑树过氧化物酶MmPOD. 12基因的3' -RACE扩增结果图：M. 2000bp DNA分 子标记I. RT-PCR产物；
[0021] 图2为桑树过氧化物酶MmPOD. 12基因的5' RACE扩增结果图：M. 2000bp DNA分子 标记；IPCR扩增产物；
[0022] 图3为桑树过氧化物酶MmPOD. 12基因推导的氨基酸序列保守区预测软件截图；
[0023] 图4为定量RT-PCR检测MmPOD. 12基因在盐胁迫下桑苗嫩叶中的相对表达量图； 1.对照，2.盐处理6小时，3.盐处理12小时，4.盐处理1天，5.盐处理2天，6.盐处理4 天，7.盐处理16天；每组数据左侧为盐实验处理结果，右侧为对照组；
[0024] 图5为定量RT-PCR检测MmPOD. 12基因在干旱胁迫下桑苗嫩叶中的相对表达量 图；1.对照，2.干旱处理2d，3.干旱处理4d，4.干旱处理8d，5.干旱处理10d，6.干旱处理 16d ;每组数据左侧为干旱实验处理组，右侧为对照组；
[0025] 图6为定量RT-PCR检测MmPOD. 12基因在ABA胁迫下桑苗嫩叶中的相对表达量图； 1.对照，2. ABA处理1小时，3. ABA处理2小时，4. ABA处理4小时，5. ABA处理6小时，6. ABA 处理8小时，7. ABA处理10小时，8. ABA处理1天，9. ABA处理2天，10. ABA处理3天；每组 数据左侧为ABA实验处理组，右侧为对照组；
[0026] 图7为定量RT-PCR检测MmPOD. 12基因在SA胁迫下桑苗嫩叶中的相对表达量图； 1.对照，2. SA处理1小时，3. SA处理2小时，4. SA处理4小时，5. SA处理6小时，6. SA处理 8小时，7. SA处理10小时，8. SA处理1天，9. SA处理2天，10. SA处理3天；每组数据左侧 为SA实验处理组，右侧为对照组。
【具体实施方式】
[0027] 实施例1桑树过氧化物酶MmPOD. 12基因的克隆
[0028] 供试桑树品种为保存于中国农业科学院蚕业研宄所国家种质镇江桑树圃的育 71-1。利用已获得的包含桑树过氧化物酶MmPOD. 12基因 cDNA片段的ESTs序列，设计引物， 并加以验证，引物序列如下：
[0029] MmPOD. 12-F:5,-TAGATGCCACCGACACGGT-3，；
[0030] MmPOD. 12-R:5'-ACTTGGATTCCTAGCAGAGC-3' ；
[0031] 根据已克隆并验证的基因中间片段结果，设计3'RACE扩增所需目的基因的上游 特异性引物，引物序列如下：
[0032] GSPl:5'-ACAAGAGCAGTAACTATAGCCAACC-3'
[0033] 根据已克隆3' RACE产物验证序列结果，设计5RACE扩增所需目的基因的下游特异 性引物，引物序列如下：
[0034] GSP2 :5'-ATGACAGGGTCTTGGGTGGGATAGAG-3'
[0035] 根据已获得的基因全长序列设计进行荧光定量分析的引物，引物序列如下：
[0036] qMmPOD. 12-F:5,-CCCCACGAACATCACGGTTGCCACTA-3'
[0037] qMmPOD. 12-R:5,-GCACGTATCTCACCTTGGCTGCCTGT-3'
[0038] 根据NCBI上查找的在桑树中稳定表达的β -actin基因 （GeneBank 登录号：DQ785808)序列设计内参基因的上下游引物，上游引物序列 β -actin-F 为 5'-AGCAACTGGGATGACATGGAGA-3' ，下游引物序列 β -actin-R 为 5,-CGACCACTGGCGTAAAGGGA-3, 。
[0039] 桑树过氧化物酶MmPOD. 12基因中间cDNA片段的克隆
[0040] 以合成的cDNA第1链为模板，利用上述设计的RPS3a - F和RPS3a - R为引物进行 RT-PCR扩增。PCR扩增程序为：94°C预变性 5min ;94°C30s，56°C40s，72°C lmin，循环 35 次； 72°C延伸IOmin ;保存4°C。取3 μ L的RT-PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测目的片段的 大小，检测目的片段大小与预测大小是否相符（图1)。符合后取45 μ L RT-PCR产物用TAE 缓冲液制作的1 %琼脂糖凝胶进行电泳，采用TaKaRa公司Agarose Gel DNA Purification Kit试剂盒进行目的片段的胶回收和纯化。目的片段用DNA连接酶与pMD?18-T载体连接。 连接产物转化到宿主菌E. co