c.)扩增仪上进行，反应程序为：94°C 4 min ;94°C 30 sec， 55°〇30 86(：，721：30 86(3,34个循环；721：延伸5 1^11。？〇?产物用8%聚丙烯酰胺凝胶电 泳检测（200V恒定电压，1.5小时)。在F2群体中选取14个突变体表型单株，提取14单株 的DNA构建DNA混池，利用两亲本间具有多态性的标记，对混池的基因型进行分析，筛选与 位点连锁的标记。结果在第6染色体长臂上筛选到MlO和M16两个Indel连锁标记 (图 2)。
[0035] 选取1440 AF2群体中的隐性单株，提取DNA，用MlO和Μ16两个标记筛选交换单 株。根据http://www. gramene. org/网站SSR标记图谱，选取位于MlO和Μ16之间的SSR 标记和开发的Indel标记对亲本进行多态性分析。将有多态性的引物鉴定前面筛选到的交 换单株，最终将你6^5基因精细定位于标记M72和M31之间21 kb范围内（图3)。
[0036] 表1. 基因定位标记引物序列
4.候选基因预测及测序分析 根据网站预测（http://www. gramene. org),在M72和M31标记限制区间内，包括3个 候选基因。根据预测结果，我们设计了每个基因的测序引物，分别从材料和N22等其 它有毛状体结构的品种中扩增候选基因进行测序分析。发现ORFl (0S06T0595800)基因在 354处发生1个碱基的替换，由C突变为Α，形成一个终止密码子，导致提前终止。根据网 站注释（http://rice, plantbiology. msu. edu)，该基因属于转移酶家族基因，全长1671 bp (SEQ ID N0:1)，包括2个外显子和2个内含子。基因编码序列1296 bp(SEQ ID N0:2)，编 码431个氨基酸（SEQ ID N0:3)。
[0037] 表2. 基因测序引物序列
实施例3: AsffilS转基因验证 1.干扰载体的构建 在我们进行转基因互补验证基因功能时，发现材料愈伤很不好做，而且 转化愈伤容易发生褐化，所以转化互补载体有一定的难度。所以我们利用PLHRNAi干扰载 体(授权公告号：CN102191262B ;【申请号】201110055864.Χ ;发明名称：一种RNA干扰载体及 其应用）做为骨架构建干扰你6^5基因的双元表达载体进行转基因验证。选取你從堪 因 ⑶S 723-976区间254 bp基因的保守序列作为特异干扰区，用cDNA做为模板扩增。连 入左侧多克隆位点片段扩增引物为：5' TTCTGCACTAGGTACCAGGCCTGGAGGTTCCTGGAGCAGAC GG 3'（该引物序列中1-23位为载体序列，24-43位为基因序列）和5' CTGACGTAGGGGCGAT AGAGCTCTCAGCCTCACCACGTCGTTC 3'（该引物序列中1-23位为载体序列，24-43位为基因序 列）。连入右侧多克隆位点片段扩增引物5' CGGGGATCCGTCGACTACGAGGTTCCTGGAGCAGACGG 3'（该引物序列中1-18位为载体序列，19-38位为基因序列）和5' AGGTGGAAGACGCGTTAC TCAGCCTCACCACGTCGTTC 3'（该引物序列中1_18位为载体序列，19-38位为基因序列)。 pLHRNAi-〇sGL3干扰载体具体构建方法详见上述专利所述。
[0038] 2. pLHRNAi-〇sGL3干扰载体的遗传转化 将pLHRNAi_0sGL3载体转入EHA105农杆菌ittwe/acieflAWu et al·， 2007 ;公众可以从中国农业科学院作物科学研究所获得）中，得到转化子。将转化子提取 质粒并测序，确认质粒为pLHRNAi-〇sGL3,从而获得农杆菌菌株EHA105-pLHRNAi-0sGL3。 采用农杆菌介导的遗传转化方法将菌株EHA105-pLHRNAi-0sGL3导入Kitaake胚的愈伤 组织，经过预培养、侵染、共培养、筛选等步骤，得到转基因植株(农杆菌介导的遗传转化方 法和步骤详见专利：一种RNA干扰载体及其应用；授权公告号：CN102191262B ;【申请号】 201110055864. X)。按照前述专利介绍的方法将空载体pLHRNAi导入Kitaake的愈伤组织， 得到的转基因植株为阴性对照。
[0039] 本发明结果显示，将干扰载体pLHRNAi_0sGL3通过农杆菌介导的方法导入 Kitaake的愈伤组织，共获得独立转化苗24株，其中18株阳性植株表现为无毛状体 的表型。获得的空载体转化苗10株，全部表现正常（图4)。我们选取干扰表型比较突出的 3、11、15三个家系和阴性对照，用Real-time实验分析了 AsffilS基因的表达情况（图4)，三 个家系基因表达都明显下调。Real-time PCR引物序列为：5' ATCGAGTCCCTCCATGTCTTCA 3' 和5' TCCACCATGAGCGGGTACTC 3'以上结果表明材料无毛状体的表型是由于 基因突变造成的。
[0040] 主要参考文献： 1. Yu Nj Cai WJj Wang SC, et al. Temporal control of trichome distribution by microRNA156-Targeted SPL genes in Arabidopsis thaliana. Plant Cell 2010， 22:2322 - 2335. 2. Galway ME, Masucci JDj Lloyd AM, et al. The ttg^ene is required to specify epidermal cell fate and cell patterning in the Arabidopsis root. Dev Biol 1994， 166:740 - 754. 3. Larkin JC，Oppenheimer DG，Pollock S，et al. Arabidopsis GLABROUS? gene requires downstream sequences for function. Plant Cell 1993，5:1739 - 1748. 4. Ma Xj Cheng Zj Wu Fj Jin M et al. BEAK LIKE SPIKELET1 is required for lateral development of lemma and palea in rice, Plant Mol Biol Rep 2013， 31:98 - 108。
【主权项】
1. 一种与水稻毛状体发育相关的蛋白质GL3,其氨基酸序列如SEQIDNO:3所示。2. 如权利要求1所述蛋白质的编码基因ffiJ，优选地，其核苷酸序列如SEQIDNO: 1 或SEQIDNO:2 所示。3. -种干扰载体，其特征在于：选取权利要求2所述基因的保守序列作为特异干 扰区。4. 如权利要求3所述的干扰载体，其特征在于：其利用pLHRNAi干扰载体做为骨架构 建得到。5. 如权利要求3-5任一项所述的干扰载体，其特征在于：其选取权利要求2所述從堪 因⑶S723-976区间254bp的保守序列作为特异干扰区。6. 包含权利要求2所述基因序列或者部分基因序列的质粒以及基因的植物表达载体。7. 宿主细胞，其特征在于：该宿主细胞含有权利要求2所述的基因。8. 如权利要求8所述的宿主细胞，其特征在于：该细胞为大肠杆菌细胞、农杆菌细胞或 植物细胞。9. 一种培育转基因植物的方法：其特征在于包括使用SEQIDNO: 1或SEQIDNO: 2所 示的核苷酸序列的基因转化水稻，以及由此所获得的水稻植株。10. 如权利要求2所述的基因或权利要求3-6任一项所述干扰载体的用途，其特征 在于：将其用于转化水稻，所获得的转基因水稻的叶片和/或颖壳毛状体减少或者消失。
【专利摘要】本发明公开了一种与水稻毛状体发育相关的蛋白GL3及其编码基因与应用，所述的蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，或者与SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列具有相同功能的衍生蛋白。本发明还公开了所述蛋白的编码基因，含有所述编码基因的载体和宿主细胞，所述基因其核苷酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示。本发明的水稻毛状体发育相关蛋白可用于调节水稻叶片和颖壳表面的毛状体数量。本发明的水稻毛状体发育相关蛋白在水稻无毛状体“光身稻”育种中具有广泛的应用前景。
【IPC分类】C12N5/10, C12N15/54, C12N9/10, C12N1/21, A01H5/00, C12N15/82
【公开号】CN104928267
【申请号】CN201410691908
【发明人】马小定, 韩龙植, 马建, 程治军, 曹桂兰
【申请人】中国农业科学院作物科学研究所
【公开日】2015年9月23日
【申请日】2014年11月27日