一种新的贝壳烯酸-13α-羟化酶、其编码基因及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子生物学与生物工程领域，提供了一种新的甜叶菊来源的贝壳烯 酸-13 α-羟化酶（KAH)基因及在甜菊糖苷生物合成中的应用。
【背景技术】
[0002] 随着肥胖和高血压等心血管疾病对人类健康的威胁加剧，人类对新型甜味剂的需 求越来越迫切。甜菊糖苷是一种产自菊科植物甜叶菊（Stevia RebaudianaBertoni)中的 二萜类糖苷化合物，具有高甜度、低热能的特点，其甜度是蔗糖的200-300倍，热值仅为蔗 糖的1/300。甜菊糖在南美和东亚地区被广泛地作为药草和代糖已经有几百年历史，经常食 用甜菊糖可预防高血压、糖尿病、肥胖症、心脏病、龋齿等病症。随着欧美等国对甜菊糖安全 性的逐渐认可，甜叶菊作为新型甜味剂和功能性食品添加剂将具有越来越大的市场。
[0003] 目前有关甜菊糖苷生物合成途径研究相对比较清楚。作为典型的二萜类化合物， 甜菊糖苷主要由廠类的通用前体-3个异戊烯焦磷酸（Isopentyl diphosphate, ΙΡΡ) 和1个二甲基丙烯基焦磷酸（Dimethylallyl diphosphate, DMAPP)单元经栊牛儿基栊牛 儿基焦憐酸合成酶（Geranylgeranyl diphosphate synthase，GGPPS)，ent_ 柯巴基焦憐酸 合成酶（ent-copalyl diphosphate synthase，CDPS)，贝壳烯合成酶（Kaurene synthase， KS)形成二萜骨架贝壳烯。随后贝壳烯烃两步细胞色素 P450酶，即贝壳烯氧化酶（Kaurene oxidase，K0)和贝壳烯酸-13 α-轻化酶（13 a-kaurenoic acid hydroxylase，KAH)，分别 在二萜骨架的C19和C13位形成羧基和羟基，形成重要中间体甜菊糖醇。最后甜菊醇经四 步糖基化反应，最终形成甜菊糖莱鲍迪式A(Rebaudioside A)，如图1所示。
[0004] 目前甜菊糖合成途径中所有酶的基因均已经获得了报道，并为植物细胞遗传改造 提高甜菊糖产量和微生物异源合成甜菊糖苷的研究打下了基础。作为催化贝壳烯酸到甜菊 醇的第二个细胞色素 P450酶KAH，虽已经有多个甜叶菊来源的序列被报道，而且部分序列 已经在植物中过表达以改善甜菊糖苷合成或酵母细胞中进行生物转化研究，但其目前仍是 甜菊糖生物合成的限速步骤，而且仍然未有能够在原核宿主中活性表达KAH的报道。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种新的贝壳烯酸-13 α -羟化酶、其编码基因及其应用。
[0006] 在本发明的第一方面，提供一种分离的贝壳烯酸-13 α -羟化酶，其选自下组：
[0007] (a)如SEQ ID NO:2氨基酸序列的多肽；
[0008] (b)将SEQ ID NO: 2氨基酸序列经过一个或多个（如1-20个，较佳地1-10个；更 佳地1-5个；更佳地1-3个）氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有（a)多肽功 能的由（a)衍生的多肽；
[0009] (C)具有（a)多肽功能的SEQ ID NO:2的蛋白片段；或
[0010] ⑷具有（a)多肽功能的且与（a)多肽具有90%以上（较佳地95%以上；更佳地 98%以上；更佳地99%以上）氨基酸序列相同性的多肽。
[0011] 在一个优选例中，所述的贝壳烯酸-13 α -羟化酶来源于甜叶菊。
[0012] 在本发明的第一方面，提供一种分离的多核苷酸，其编码如所述的贝壳烯 酸-13 α -轻化酶。
[0013] 在一个优选例中，提供该多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
[0014] 在另一优选例中，所述多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID N0:5所示（密码子优化 序列）。
[0015] 在本发明的第一方面，提供一种重组载体，它含有前面任一所述的多核苷酸。
[0016] 在本发明的第一方面，提供一种宿主细胞，它含有所述的重组载体，或其基因组中 整合有所述的多核苷酸。
[0017] 在另一优选例中，所述的宿主细胞是细菌细胞、真菌细胞或植物细胞；所述的真 菌细胞包括酵母细胞（Yeast)，如毕赤酵母（Pichiapastoris)、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)、乳酸克鲁维酵母（Saccharomyces cerecisiae)等。所述的原核细胞包括： 肠杆菌属（Enterobacter)，如大肠杆菌（Escherichia coli)，芽抱杆菌属（Bacillus)， 如枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis)，链霉菌属（Streptomyces)，天蓝色链霉菌 (Streptomyces coelicolor)、变铅青链霉菌（Streptomyces Iividans)、阿维链霉菌 (Streptomyces avermitilis)、委内瑞拉链霉菌（Streptomyces venezuelae)等，糖多胞菌 属（Saccharopolyspora)，如红霉糖多胞菌（Saccharopolyspora erythraea) 〇
[0018] 在本发明的第一方面，提供一种所述的贝壳烯酸-13 α -羟化酶的制备方法，该方 法包含：(a)培养所述的宿主细胞；(b)从培养物中分离出所述的贝壳烯酸-13 α -羟化酶。
[0019] 在本发明的第一方面，提供所述的贝壳烯酸-13 α-羟化酶的用途，用于将贝壳烯 酸转化为甜菊糖醇；较佳地，在存在细胞色素 Ρ450氧化还原蛋白的情况下贝壳烯酸转化为 甜菊糖醇。
[0020] 在一个优选例中，所述的将贝壳烯酸转化为甜菊糖醇在植物细胞或非植物细胞 中进行；较佳地，所述的非植物细胞包括细菌细胞、真菌细胞；所述的真菌细胞包括酵母 细胞（Yeast)，如毕赤酵母（Pichiapastoris)、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)、 乳酸克鲁维酵母（Saccharomyces cerecisiae)等。所述的原核细胞包括：肠杆菌属 (Enterobacter)，如大肠杆菌（Escherichia coli)，芽抱杆菌属（Bacillus)，如枯草芽 抱杆菌（Bacillus subtilis)，链霉菌属（Streptomyces)，天蓝色链霉菌（Streptomyces coelicolor)、变铅青链霉菌（Streptomyces Iividans)、阿维链霉菌（Streptomyces avermitilis)、委内瑞拉链霉菌（Streptomyces venezuelae)等，糖多胞菌属 (Saccharopolyspora)，如红霉糖多胞菌（Saccharopolyspora erythraea) 〇
[0021] 在本发明的第一方面，提供一种制备甜菊糖醇的方法，该方法包含：利用所述的贝 壳烯酸-13 α -羟化酶将贝壳烯酸转化为甜菊糖醇。
[0022] 在一个优选例中，所述方法包括：
[0023] (1)培养所述的宿主细胞，从而表达所述的贝壳烯酸-13 α-羟化酶；
[0024] (2)在存在细胞色素 Ρ450氧化还原蛋白（CPR)的情况下，利用步骤（1)所述的贝 壳烯酸-13 α -羟化酶将贝壳烯酸转化为甜菊糖醇。
[0025] 在另一优选例中，所述的细胞色素 Ρ450氧化还原蛋白由步骤（1)所述的宿主细胞 表达。
[0026] 在另一优选例中，步骤（1)所述的宿主细胞中包含的重组载体中还包括：细胞色 素 P450氧化还原蛋白的编码基因。
[0027] 在本发明的另一方面，提供一种组合物，它含有安全有效量的所述的贝壳烯 酸-13 α -羟化酶以及食品学或工业上可接受的载体。
[0028] 本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见 的。
【附图说明】
[0029] 图1、甜菊糖苷类化合物的生物合成途径。
[0030] 图2、ΚΑΗ基因片段的PCR扩增。泳道1-4分别是应用引物对8-40-3US/8-40-4DS， 8-40-2DS/8-40-3US，8-40-lUS/8-40-4DS，8-40-lUS/8-40-2D 进行 PCR 扩增获得的扩增产 物的电泳图。
[0031] 图3、KAH全长DNA的PCR扩增。
[0032] 图4、质粒pSY183图谱。
[0033] 图 5、质粒 pET21a-srcpr 图谱。
[0034] 图6、质粒pSY198图谱。
[0035] 图7、KAH S2蛋白表达SDS-PAGE分析。M :蛋白分子量标记；1 :未诱导全菌蛋白； 2 :未诱导上清蛋白；3 :16°C诱导5h全菌蛋白；4 :16°C诱导5h上清蛋白；5