专利名称：一种HBV病毒rtA181V突变的荧光扩增检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种快速而且方便的HBV病毒rtA181V突变的双色荧光PCR扩增检测 试剂盒。
背景技术：
乙型肝炎病毒(HBV)流行世界各地，估计全球有20亿人感染，其中慢性感染者3. 5 亿，我国约占半数，全球每年约有120万人死于HBV感染。此种感染最终可发展为肝硬化、肝 癌，是当前WH0公布的人类疾病死亡原因中居第9位的疾病。因此针对HBV的抗病毒治疗 受到广泛重视。随着对HBV聚合酶的结构和功能的深入认识，一些有效抑制HBV DNA复制 的核苷类药物(如拉米夫定LAM、阿德福韦ADV)逐步成为抗HBV治疗的新选择。由于HBV 聚合酶如同其他逆转录病毒的逆转录酶一样具有较高的错配倾向且缺乏校对能力，因此随 着感染的持续病毒准种逐年增多，在核苷类药物的选择压力下，耐药变异株将逐渐增多，最 终替代野生株成为优势株，从而导致临床耐药现象的出现。 拉米夫定是L-核苷类似物，曾经是治疗乙型肝炎的最有效的药物，已在全球广泛 使用，在中国已成为销量最大的处方药。但拉米夫定的药发生率非常高，在治疗l年时，耐 药发生率约为14% 32%，治疗时间延长耐药发生率升高，治疗5年时耐药发生率达到 60% 70%。而阿德福韦耐药变异位点集中于P基因D区rtN236T和(或)B区rtA181V， 与拉米夫定无交叉耐药现象。阿德福韦耐药发生率相对拉米夫定耐药要低得多，阿德福韦 治疗HBeAg阴性慢性乙肝的III期临床试验结果显示，治疗1、2、3、4、5年时累积的基因型 耐药发生率约为0、 3 % 、 11 % 、 18 %和29 % 。因此，阿德福韦已越来越多的被应用于HBV的 抗病毒治疗中，通常与其他药物进行联合用药。 目前，国内外尚无快速、灵敏的检测阿德福韦耐药突变的技术和产品，通常使用基 因测序的方法进行突变检测，但一方面，测序反应灵敏度低导致假阴性率较高。另一方面， 由于HBV耐药株与敏感株常共存于患者血清中，对于HBV耐药突变基因的检测，该方法有致 命的缺陷。椐了解，当耐药株低于50%时，随耐药毒株比例的下降，基因测序的假阴性率迅 猛增高，通常不能对低于20%的突变基因进行检测。 国内外，均有人使用ntPCR-RFLP的技术对rtA181V位点突变进行检测，但该技术 操作复杂、耗时长且价格昂贵又容易造成PCR产物污染，无法进行推广和临床应用。
T叫Man PCR技术作为一种快速诊断技术，具有特异性高、灵敏度高、操作简便且价 格较便宜等优点，已在科研和临床上得到广泛的应用。使用特异性探针杂交的方法结合常 规T叫Man技术进行rtl81基因突变检测设计，由于rtl81位点除发生A — V (即GCT — GTT) 变异外，还发现有A — T ( S卩GCT — ACT)变异，很难避免假阳性，不利于设计引物或探针，并 且与测序技术一样无法对病毒的共生关系进行准确判断。 本发明对传统TaqMan PCR技术进行了巧妙改进，不仅可对rtl81V变异的病毒DNA 进行定量分析，同时，在同一个PCR管内完成了 HBV DNA的定量检测。
发明内容
本发明的目的是提供一种快速、简便的HBV病毒rtA181V突变的荧光定量PCR扩 增检测技术。 为达到上述目的，本发明采用的技术方案是使用一对特异性引物和一对特异性
探针，扩增目标片段长度为94bp，引物序列为 引物1 :5—-GGCTTTCGCAAGATTCCTA-3— (Seq No. 1) 引物2 :5— -GGAAAGCCCTACGAACCA-3— (Seq No. 2) 或者上述弓I物序列的互补序列，或者上述序列同源性大于75 %的序列。 设计的两条探针方向相反，除突变检测位点和3'端外(突变检测位点序列可互
补，也可不互补，根据检测要求决定)其余区域互补；探针1和探针2的Tm值相近，同时也
与两条引物的Tm值相近(相互间的差异均小于3tO，两条探针的3'端除互补序列外均
延伸2-4个碱基；探针1在rtl81密码子位点对应位置使用了 "GTT"，由于已经证实G与T
在PCR反应中，能形成稳定的2价氢离子键(A = G)，因而GTT与野生株(rtl81A)和变异
株(rtl81V)相应互补序列均能进行杂交配对，产生荧光扩增信号，可用于检测总的HBV病
毒DNA，探针2能与变异株(rtl81V)相应序列特异性杂交配对，产生荧光扩增信号，用于检
测rtA181V变异(即GCT — GTT)。探针序列为 探针1 :5—-TTTCTCCTGGTTCAGTTTACTAGT-3— (Seq No. 3) 探针2 :5—-TAAACTGAACCAGGAGAAACG-3— (Seq No. 4) 或者上述弓I物序列的互补序列，或者上述序列同源性大于75 %的序列。 上述的HBV病毒rtA181V突变的荧光定量PCR扩增检测试剂盒，探针的荧光发光
基团为可标记为丽、TET、 J0E、 Cy3、 Cy5、 Cy5. 5、 Fluorescein、 Rhodamine、 RhodamineRed、
Rhodamine Green、 Rhodamine 6G、 Oregon Green 488、 Oregon Green 500、 Oregon Green
514、 Texas Red、 TAMRA、 Inosine、 HEX、 FITC、 Acridine orange、或ROX中的任意两禾中组合；
荧光淬灭基团为DABCYL、 DABSYL、 TAMRA、 BHQ-1、 BHQ-2或BHQ-3中的任意一种或一种以上
的组合。 上述的HBV病毒rtA181V突变的荧光定量PCR扩增检测试剂盒，采用多色荧光PCR 定量检测技术，在一个反应管内同时对总HBV病毒DNA和发生rtA181V突变的HBV病毒DNA 进行定量分析。 上述的HBV病毒rtA181V突变的荧光定量PCR扩增检测试剂盒，使用人工设计的 寡核苷酸片段进行适当稀释作为HBV总DNA和rtA181V突变的DNA病毒定量标准品，寡核 苷酸的序列如下
突变型模板seq-M:
TGTTCAGTGGTTCGTAGGGCTTTCC(94bp)(Seq No. 5) 上述的HBV病毒rtA181V突变的荧光定量PCR扩增检测试剂盒，使用的反应组分 包括10mM Tris-HCl(Ph 8.3)、50mM KCl、300iiM d (AGC) TP、300 ii M dUTP、5薩gC12、200nM 引物1、200nM引物2、200nM探针1和200nM探针2、1U Taq酶、0. 05UUNG酶，另外，试剂盒还 包括人工合成突变型模板seq-M的稀释产物。按如下程序进行实时荧光PCR检测反应管 先在5Q。C反应2分钟，然后95。C保温5分钟，再按94°C 20秒一60°C 35秒循环40次(60°C退火条件下同时采集相应探针标记通道的荧光)。 本发明与现有HBV病毒DNA rtA181V突变检测方法及传统的T叫Man技术相比，具 有以下有益的技术效果 (1)与传统的T叫Man技术相比縮短探针的长度，使Tm值下降至与引物相近，以 增强探针对突变位点的特异性，同时保证了灵敏性。传统的T叫Man技术要求探针的Tm值 相对引物高6-l(TC，是为了保证探针比引物优先与模板退火杂交，以防止引物快速延伸至 探针结合部位而阻止探针的结合，从而降低灵敏度，但这种设计使得探针对模板的选择特 异性较低，根本不能鉴别单个碱基的突变。本发明通过探针浓度的调节保证了较高的灵敏 度，可实现对1000copies/ml的突变DNA进行检测，另外，本发明设计的两条探针为反向序 列，分别与模板的正反链结合，不存在竞争关系，不会降低灵敏度。由于探针的Tm值与引物 相近，通过优化退火温度和提高反应条件的特异性，探针能与完全配对的模板进行杂交，通 过引物的延伸的酶切产生荧光扩增信号，而不能与发生变异的模板杂交，从而不产生荧光 扩增信号。 (2)与其他技术相比本发明在一个反应管内实行了全部的检测，从HBV病毒核酸 提取到检测完毕，仅需要2个小时，操作非常简单，且产物不开盖，不会发生PCR产物的污 染。并且本发明通过设计人工模板制作标准曲线，可以对突变病毒的核酸进行定量分析， ntPCR-RFLP和测序技术均不能得到定量的结果。另外，本发明还可同时完成HBV病毒含量 的测定，而其他技术不能满足要求，需要另外重新对HBV病毒进行定量分析。通过HBV病毒 总量和rtA181V突变病毒的定量检测，还可以检测出rtA181V突变病毒的含量。
本发明提供一种准确快速对HBV病毒rtA181V突变进行荧光定量检测的技术。同 时本发明还可用于其他基因突变的检测。
具体实施例方式
设计和制备引物、探针序列(针对HBV DNA P基因相关序列设计，GeneBank序列 号为AF182802，下同) 引物1 :5—-GGCTTTCGCAAGATTCCTA-3— (Seq No. 1) 引物2 :5—-GGAAAGCCCTACGAACCA-3— (Seq No. 2) 探针1 :5 — FAM-TTTCTCCTGGTTCAGTTTACTAGT-BHQ13 — (Seq No. 3)
探针2 :5—TET-TAAACTGAACCAGGAGAAACG-BHQ13— (Seq No. 4)
合成突变型模板seq-M:
TGTTCAGTGGTTCGTAGGGCTTTCC(94bp)(Seq No. 5) 上述引物和探针均在宝生物工程(大连)有限公司合成。 HBV病毒rtA181V突变的荧光扩增检测试剂盒的组成为(20人份) 组成成份名称 体积 提取液A 1ml 提取液B 1ml PCR反应缓冲液460 ii 1 PCR反应酶 40 ii 1
阳性标准品 20 ill 阳性对照品 50 ill 阴性对照品 50 ill 其中，PCR反应缓冲液(使用终浓度)包括10mM Tris-HCl (PH 8. 3) 、50mM KCl、 300 iiM d(AGC)TP、300iiM dUTP、5mM MgCl2、200nM引物1、200nM引物2、200nM探针1和 200nM探针2 ;PCR反应酶(终浓度)包括1U Taq酶、0. 05U UNG酶；阳性标准品含适当浓度 的合成突变型模板seq-M，阳性对照品为A181V突变阳性的临床血清，阴性对照品为HBVDNA 阴性的血清。 试剂盒的操作步骤如下
(1)标准曲线标准点的制备 使用ddH20将阳性标准品梯度稀释至10、100、1000倍，此时，总HBV DNA(即 rtl81V突变型DNA)论浓度依次为107copies/ml、 106copies/ml、 105copies/ml和 104copies/ml，作为HBV病毒总DNA和rtl81V突变型DNA的定量标准品。 [OO48] (2)病毒核酸提取 取待测血清样本50iil，加入50iU核酸提取液A。振荡混匀15s。 13， OOOrpm 离心10min，弃上清。加入充分混匀的核酸提取液B 50iil，振荡混匀，10(TC水浴lOmin， 13， OOOrpm离心3min。取上清供PCR扩增用。
(3)荧光PCR反应液的配制 按每人份PCR反应缓冲液23ul 、PCR反应酶2ul的配方配制PCR反应液，并按25ul/ 管分装到O. 2ml PCR管中，然后加入5ul待检的核酸提取产物以及稀释好的定量标准品，按 如下程序进行实时荧光PCR检测反应管先在5(TC反应2分钟，然后95t:保温5分钟，再按 94°C 20秒一60°C 35秒循环40次(6(TC退火条件下同时采集FAM和TET通道荧光)。
(4)质量监控与结果分析 根据仪器分析的结果，在如下情况视实验有效标准品稀释产物的Ct值均< 35， 且呈较好的线性(r > 0. 9);阳性对照品Ct值均< 35 ;阴性对照品Ct值均< 35 ;。
读取FAM通道的定量值即为HBV DNA的定量值。
读取TET通道的定量值即为rtl81V突变型DNA的定量值。 当定量值< 100copies/ml时，判断为阴性；当100copies/ml《定量值 < 1000copies/ml时，判断为检测灰区，建议重新检测。
试剂盒性能指标
最低检测量 取中检所HBV核酸定量检测标准品，对其进行HBV DNA核酸定量，用HBV阴性血清 分别稀释至lX104IU/ml、lX103IU/ml和1 X 102IU/ml，各稀释产物均使用本发明试剂盒重 复检测10次，统计FAM荧光的检测Ct值，结果表明，试剂盒能稳定检测出1 X 103IU/ml浓 度的HBVDNA (10/10); 将人工合成的突变型模板，用TE缓冲液稀释至适当浓度，测定260波长下 的OD值，根据0D26。的值计算核酸序列的浓度，用TE缓冲液稀释至IX 104COpieS/ml、 lX103copies/ml和1 X 102copies/ml，稀释产物均使用本发明试剂盒重复检测10次，统计 TET荧光的检测Ct值，结果表明，试剂盒能稳定检测出1 X 103COpieS/ml浓度的合成突变型模板seq-M (10/10);
特异性 使用本发明试剂盒对中检所提供的HBV核酸定量特异性参考品进行检测，结果全 部为阴性，特异性为100%。
精密性 使用本发明试剂盒对浓度为2. 4X 105IU/ml的HBV DNA阳性参考品重复10次检 测，统计检测Ct值为CV < 3% ; 使用本发明试剂盒对浓度为7. 2X 105COpieS/ml的合成突变型模板seq-M重复10 次检测，统计检测Ct值为CV < 3% ;
临床标本的检测 对25例长期服用阿德福韦药物治疗的乙肝患者血清进行rtl81位点核酸测序分 析，并使用本试剂盒进行HBV DNA和突变DNA定量检测，HBV DNA的定量值均> 5X 104IU/ ml，突变检出率为32X (8/25)，与测序结果的符合率为96% (24/25)，不符合的1例标本， 基因测序结果为rtl81A，而本发明试剂盒HBV DNA定量值为4. 6X 106IU/ml， rtl81V突变 DNA定量值为3. 3X10、opies/ml，提示野生型HBV DNA为优势株，而突变型DNA只占总HBV DNA的小部分，测序技术不能分辨和检测。 上述实验结果表明，本发明试剂盒操作简单，可在单管内同时完成HBV DNA定量检 测和rtA181V突变DNA的定量检测，具有灵敏度高，特异性强的特点。
SEQUENCE LISTING〈110〉上海复星医药(集团)股份有限公司
上海复星医学科技发展有限公司
剑军，何
懿，夏 〈120〉 一种HBV病毒rtA181V突变的荧光扩增检测试剂盒
〈160>5 〈170>Patentln version 3. 3 〈210>1 〈211>19 〈212>DNA 〈213〉人工序列 〈400〉 1 ggctttcgca agattccta 19 〈210>2 〈211>18 〈212>DNA 〈213〉人工序列 〈400>2 ggaaagccct acgaacca 18
〈210>3
〈211>24
〈212>DNA 〈213〉人工序列
〈400>3
tttctcctgg ttcagtttac tagt 〈210>4 〈211>21 〈212>DNA 〈213〉人工序列 〈400>4 te朋ctg朋c cagg3gaaac g 21 〈210>5 〈211〉94 〈212>DNA 〈213>人工序列 〈400>5 ggctttcgca卿ttcctet gggagtgggc ctcagtccgt ttctcctggt tcagtttect 60 agtgccattt gttcagtggt tcgtagggct ttcc 9权利要求
一种HBV病毒rtA181V突变的荧光扩增检测试剂盒，其特征在于包含一对特异性引物和一对特异性探针，扩增目标片段长度为94bp，引物序列为引物15`-GGCTTTCGCAAGATTCCTA-3`(Seq No.1)引物25`-GGAAAGCCCTACGAACCA-3`(Seq No.2)或者上述引物序列的互补序列，或者上述序列同源性大于75％的序列。设计的两条探针方向相反，除突变检测位点和3’端外(突变检测位点序列可互补，也可不互补，根据检测要求决定)其余区域互补；探针1和探针2的Tm值相近，同时也与两条引物的Tm值相近(相互间的差异均小于3℃)，两条探针的3’端除互补序列外均延伸2-4个碱基；探针1在rt81密码子位点对应位置使用了“GTT”，在荧光PCR检测中，对野生株(rt81A)和变异株(rt81V)相应序列均能进行杂交配对，产生荧光扩增信号，可用于检测总的HBV病毒DNA，探针2能与变异株(rt81V)相应序列特异性杂交配对，产生荧光扩增信号，用于检测rtA181V变异(即GCT→GTT)。探针序列为探针15`-TTTCTCCTGGTTCAGTTTACTAGT-3`(Seq No.3)探针25`-TAAACTGAACCAGGAGAAACG-3`(Seq No.4)或者上述引物序列的互补序列，或者上述序列同源性大于75％的序列。
2. 根据权利要求1所述的HBV病毒rtA181V突变的荧光扩增检测试剂盒，其特征在于 标记探针的荧光发光基团可以为FAM、TET、J0E、Cy3、Cy5、Cy5. 5、Fluorescein、Rhodamine、 Rhodamine Red、 Rhodamine Green、 Rhodamine 6G、 Oregon Green 488、 OregonGreen 500、 Oregon Green 514、Texas Red、TAMRA、 Inosine、HEX、FITC、Acridineorange、或ROX中的任 意两种组合；荧光淬灭基团为DABCYL、DABSYL、TAMRA、BHQ-l、BHQ-2或BHQ-3中的任意一种 或一种以上的组合。
3. 根据权利要求1所述的HBV病毒rtA181V突变的荧光扩增检测试剂盒，其特征在于 采用多色荧光PCR定量检测技术，在一个反应管内同时对总HBV病毒DNA和发生rtA181V 突变的HBV病毒DNA进行定量分析。
4. 根据权力要求1所述的HBV病毒rtA181V突变的荧光扩增检测试剂盒，其特征在于 使用人工设计的寡核苷酸片段进行适当稀释作为HBV总DNA和rtA181V突变的DNA病毒定 量标准品，寡核苷酸的序列如下突变型模板seq-M:CAGTGGTTCGTAGGGCTTTCC(94bp)(Seq No. 5)。
5. 根据权利要求1所述的HBV病毒rtA181V突变的荧光扩增检测试剂盒，其特征在 于，PCR反应体系包括10mMTris-HCl(PH8. 3)、50mM KCl、300iiM d (AGC) TP、300 ii M dUTP、 5mMMgCl2、200nM引物1、200nM引物2、200nM探针1和200nM探针2、1U Taq酶、0. 05U UNG 酶，另外，试剂盒还包括使用突变型模板seq-M制备的定量标准品。
6. 根据权利要求1所述的HBV病毒rtA181V突变的荧光扩增检测试剂盒，其特征在于， 按如下程序进行实时荧光PCR检测反应管先在5(TC反应2分钟，然后95t:保温5分钟， 再按94°C 20秒一60°C 35秒循环40次(6(TC退火条件下同时采集相应探针标记通道的荧 光)。
全文摘要
本发明涉及一种HBV病毒rtA181V突变的荧光扩增检测试剂盒。本发明针对rtA181V变异(即181GCT→GTT突变)设计了一对引物和分别用两种荧光染料标记的一对特异性探针，在单管内使用双色荧光定量PCR技术实现了分别对总HBV病毒DNA和发生rtA181V变异的HBV病毒DNA进行定量检测。本发明还人工设计了rtA181V变异型DNA模板用于制作HBV总DNA和突变型DNA的定量标准曲线。本发明技术能快速、简便的对HBV DNA和rtA181V变异的HBV DNA同时进行定量检测，具有较高的特异性和灵敏性。
文档编号G01N21/64GK101760559SQ20081020164
公开日2010年6月30日 申请日期2008年10月23日 优先权日2008年10月23日
发明者何剑军, 夏懿 申请人:上海复星医药(集团)股份有限公司;上海复星医学科技发展有限公司