专利名称：狗鱼幼鱼弹状病毒实时荧光rt-pcr检测法和试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及病毒的检测方法和检测试剂盒，特别是涉及狗鱼幼鱼弹状病毒实时荧 光RT-PCR检测法和试剂盒。
背景技术：
根据国际病毒学分类委员会(International comittee on taxonomy ofviruses, ICTV)第8次报告，弹状病毒科(lihabdoviridae)分为6个属，包括感染植物的质型弹状 病毒属(Cytorhabdovirus)和核型弹状病毒属(Nucleorhabdovirus),以及感染脊椎动 物的水疱性口膜炎病毒属(Vesiculovirus)、狂犬病毒属(Lyssavirus)、短晳热病毒属 (Ephemerovirus)和粒外弹状病毒属(也称非毒粒蛋白弹状病毒属)(Novirhabdovirus)， 还有部分弹状病毒尚未分类，如Sigma virus, Flanders virus等。迄今报道感染鱼类的 弹状病毒已有十几种，包括传染性造血器官坏死病毒(Infetioushematopoietic necrosis virus, IHNV)、__个生(Viralhaemorrhagic septicemia virus, VHSV) >
(Hirame rhabdovirus, HRV) >(Snakehead rhabdovirus, SHRV)、鲤春病毒血症病毒(Spring viraemia of carp virus, SVCV)、狗鱼幼鱼弹状病 毒(Pike fryrhabdovirus，PFRV)、弹状病毒 903/87 (Rhabdovirus 903/87，903/87)、鳜鱼 弹状病毒(Siniperca chuatsi rhabdovirus, SCRV)、胭脂鱼弹状病毒(Chinesesucker rhabdovirus)及海鲑弹状病毒沘/97 (ka trout rhabdovirus 28/97, STRV)等(Granoff and Webster, 1999 ；张奇亚和李正秋，1999 ；Zhang et al.，2000 Johansson et al.，2001， 2002)。在ICTV第6次报告上，SVCV, PFRV被列为水疱性口膜炎病毒属暂定种(Wurmer et al.，1995)。在ICTV第7次报告中，正式把IHNV、VHSV, HRV、SHRV列为粒外弹状病毒属， SVCV、PFRV等仍归为水疱性口膜炎病毒属的暂定种(Walker et al.，2000)。其他鱼类弹状 病毒的分类地位尚未确定。随着鱼类养殖业的快速发展，鱼类病毒病已成为养殖鱼类的最大病害。由于缺乏 有效的治疗方法，鱼类病毒性疾病的控制以预防为主，因而病毒的诊断与检测技术研究成 了鱼类病毒研究中非常活跃的领域。鱼类弹状病毒有很强的致病性，特别是VHSV、IHNV、 HRV, SHRV和SVCV在世界各地广泛流行，给水产养殖业造成重大的经济损失。因而这些病 毒的流行病学备受科研工作者的关注。狗鱼幼鱼弹状病毒(PFRV)是一种与鲤春病毒血症病毒(SVCV)同源性很高的病 毒，目前还未引起人们高度重视。PFRV主要在欧洲狗鱼幼鱼中流行(Wolf，1988)。1972年 该病毒在荷兰感染狗鱼幼鱼，引起大规模死亡，第一株PFRV从此批患病的狗鱼幼鱼中分离 出来(De Kinkelin, 1973) ο PFRV与SVCV亲缘关系最近，G蛋白的同源性> 70%。对PFRV、 SVCV及与它们血清学相关的鱼类弹状病毒G蛋白部分核苷酸序列进行系统进化分析，结果 显示它们形成4个基因型，PFRV和SVCV分别形成一个基因型，分别为基因型III和I，其他 病毒形成基因型II和IV (Stone et al. , 2003) 0 SVC主要感染鲤科鱼类，被世界动物卫生 组织列为必须申报的疾病，中国农业部将SVC列为二级动物疫病。随着对SVC的日益重视，对SVCV监控力度的加大，这些与SVCV亲缘关系高的病毒也将会越来越引起人们的重视。因 而寻找特异、灵敏快速的检测方法，对于防控疾病的发生和发展十分关键。在中国，鱼类病毒SVCV已经引起人们高度的重视，并于每年春秋两季对全国鲤鱼 进行SVCV监测。但是与SVCV亲缘关系很高的鱼类病毒PFRV目前还没有引起人们的重视， 没有纳入检测的范围。随着与这2种病毒血清学相关的病毒相继分离(Ahne，1975 ;Ahne et al. ,1982 ；Fijan et al. ,1984 ；Ahne and Thomsen,1986 ；Haenen and Davidse,1989 ； Jorgensen et al. ,1989；Rowley et al. ,2001 ；Stone et al. ,2003 ；Way et al. ,2003), 人们对这些病毒的关注会越来越多。因而需要建立切实可行的检测方法。目前，鉴定PFRV及与其血清学相关的病毒一般采取先用敏感细胞分离，然后用血 清学方法鉴定的方式(De Kinkelin, 1973 ；Ahne, 1975 ；Ahne etal. , 1982 ；Fijan et al.， 1984 ；Ahne and Thomsen, 1986 ；Haenen and Davidse,1989 ；Jorgensen et al. , 1989 ； Rowley et al.，2001 ；Stone et al.，2003 ；Way et al. ,2003) 采用这种检测方式不仅周 期长，而且使用免疫学方法，如间接荧光抗体试验或酶联免疫吸附试验，PFRV与SVCV之间 存在交叉反应(J0gensen et al.，1989 ；Way，1991)，检测结果不准确。实时荧光技术，是近年来新问世的一种高敏感性的检测技术，它融合了 PCR技术 的核酸高效扩增，探针技术的高特异性，光谱技术的高敏感性和高精确定量等优点，直接 探测PCR过程中荧光信号的变化以获得定量的结果，它可以做到每循环一次就收集一个数 据，建立实时扩增曲线，做到真正意义上的定量。同时该技术在密闭系统内完成检测，不需 要常规PCR的电泳观察环节，减少了对工作环境的污染，降低假阳性结果发生。因此，自从 该技术建立以来，迅速、广泛地应用于植物、动物和人类的寄生虫，病毒和细菌等病原的检 测研究中。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种能够快速、高灵敏度的狗鱼幼鱼 弹状病毒实时荧光RT-PCR检测方法。本发明的另一目的在于提供一种狗鱼幼鱼弹状病毒的检测试剂盒。为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案本发明公开了狗鱼幼鱼弹状病毒(Pike fry rhabdovirus，PFRV)的实时荧光 RT-PCR检测方法，所述方法包括利用特异性探针和引物对，以病毒基因组RNA为模板进行 实时荧光RT-PCR反应，所述引物对为能扩增出狗鱼幼鱼弹状病毒G基因的基因片段的引物对，并且分别 含有kq ID No. 1和kq ID No. 2所示的序列；Seq ID No. 1 :5，-AGGCAATCATTCAATTTGGCTAAC-3，Seq ID No. 2 5' -CATTTCCATACATGGTCCCTGTTG-3’所述探针为能与狗鱼幼鱼弹状病毒G基因位于所述引物对之间的序列相同或互 补、且长度为20 40bp的寡核苷酸序列，并且所述探针的5’端和3’端分别标记有荧光报
告基团和荧光淬灭基团。在本发明优选的实施方式中，所述探针含有kq ID No. 3所示的序列，Seq ID No. 3 5' -CCTAAAAGAGGAATGCGACCAACACATCG-3，。
优选的，所述探针5’端标记的荧光报告基团为HEX，3’端标记的荧光淬灭基团为 TAMRA0本发明的检测方法中，RT-PCR反应的引物终浓度优选为0. 9 1. 1 μ mol/L，更优 选1 μ mol/L,探针终浓度优选为0. 4 0. 6 μ mol/L,更优选0. 5 μ mol/L。所述RT-PCR的反应的退火温度优选为55°C 60°C，更优选60°C。本发明具体的实施方式中，所述RT-PCR的反应条件包括50°C反转录30min，94°C 预变性％iin，40个循环94°C变性15s，60°C退火及收集荧光信号lmin。本发明开公开了一种狗鱼幼鱼弹状病毒(Pike fry rhabdovirus,PFRV)的检测试 剂盒，所述试剂盒含有能扩增出狗鱼幼鱼弹状病毒G基因的基因片段的引物对，所述引物 对分别含有ID No. 1和kq ID No. 2所示的序列。进一步地，所述检测试剂盒用于实时荧光RT-PCR检测，并且所述试剂盒还含有能 与狗鱼幼鱼弹状病毒G基因位于所述引物对之间的序列相同或互补、且长度为20 40bp 的寡核苷酸探针，并且所述探针的5’端和3’端分别标记有荧光报告基团和荧光淬灭基团。优选的，所述探针含有kq ID No. 3所示的序列。进一步优选的，所述探针5’端标记的荧光报告基团为HEX，3’端标记的荧光淬灭 基团为TAMRA。由于采用了以上技术方案，使本发明具备的有益效果在于本发明的实时荧光RT-PCR检测方法和试剂盒用于检测PFRV时，比RT-PCR/PCR及 细胞培养(TCID5tl)检测方法的灵敏度高；其中所用的特异性的引物对和探针，能够在PFRV、 HRV、IHNV, VHSV, SVCV, IPNV和VNNV病毒中特异性地检测出PFRV病毒；重复性好，可稳定 地进行检测；灵敏度高，相应的灵敏度为101· 5TCID5qij
图1为不同引物和探针浓度对扩增曲线的影响结果图；图2为实时荧光RT-PCR检测PFRV的特异性实验结果图；图3为PFRV实时荧光RT-PCR检测的重复性实验结果图；图4为PFRV实时荧光RT-PCR检测的灵敏度实验结果图。
具体实施例方式实时荧光技术，是近年来新问世的一种高敏感性的检测技术，它融合了 PCR技术 的核酸高效扩增，探针技术的高特异性，光谱技术的高敏感性和高精确定量等优点，直接 探测PCR过程中荧光信号的变化以获得定量的结果，它可以做到每循环一次就收集一个数 据，建立实时扩增曲线，做到真正意义上的定量。同时该技术在密闭系统内完成检测，不 需要常规PCR的电泳观察环节，减少了对工作环境的污染，降低假阳性结果发生。因此， 自从该技术建立以来，迅速、广泛地应用于植物、动物和人类的寄生虫，病毒和细菌等病原 的检测研究中。目前已经进行该项研究的鱼类病毒有ISAV(Munir and Kibenge，2004)、 KHV (Gilad et al. ,2004), Betanodavirus (ValIe et al. ,2005), SVCV (张利峰等，2005 ； Yue et al. ,2007)、VHSV (Chico et al.，2006)、IHNV(Dhar et al.，2008)、IPNV(Bowers et al. ,2008)和VNNV(罗卫等，2008)。而本发明则建立了实时荧光RT-PCR方法检测PFRV。
实施例11材料与方法1. 1病毒及细胞PFRV为F4株，由中国科学院水生生物研究所赠送，SVCV和IHNV参考株由英国 CEFAS的OIE参考实验室B. Hill教授惠赠；VHSV参考株由挪威国家兽医研究所OIE参考实 验室Roar Gudding博士惠赠、IPNV、HRV、VNNV由本室分离。IHNV、SVCV、VHSV、VNNV、IPNV、HRV 和 PFRV 分别用 EPC、CO、RTG-2、SSN-1、CHSE-214、 FHM和BF-2细胞扩增。SSN-I细胞购自泰国Kasetsart大学水生动物健康研究所，RTG-2 细胞由水生生物研究所赠送，BF-2细胞由检疫研究所(布雷西亚)细胞保藏中心赠送， CHSE-214细胞、EPC细胞由英国环境、渔业和水产养殖科学研究中心赠送、FHM细胞由德国 慕尼黑大学和中国科学院水生生物研究所赠送，CO细胞由中国科学院水生生物研究所赠 送。EPC、C0、CHSE-214、FHM、BF-2和RTG-2细胞均用含10%胎牛血清的199培养液培 养，SSN-I细胞用含10% FBS的L-15培养液培养。接种病毒后，用加抗生素(100IU/mL青 霉素；100 μ g/mL链霉素)的相应培养液培养。1. 2设备与试剂ABI7500 荧光定量 PCR 仪；试剂盒 TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNAExtraction Kit、TaKaRa One Step RNA PCR Kit均购于大连宝生物工程有限公司。1. 3引物和探针的设计与合成根据Genbank 中 PFRV G 基因(AJ538069)，使用 Primer Express 3. 0 (Applied Biosystems,Foster City,CA)和 Primer Premier 5. 0 软件设计引物和 Taqman 荧光探针。 并通过NCBI数据库进行BLAST验证特异性后，由上海生工生物工程技术服务有限公司合 成。引物和探针序列见表1。表IPFRV实时荧光RT-PCR检测的引物和探针
权利要求
1.狗鱼幼鱼弹状病毒(Pikefry rhabdovirus, PFRV)的实时荧光RT-PCR检测方法， 所述方法包括利用特异性探针和引物对，以病毒基因组RNA为模板进行实时荧光RT-PCR反 应，其特征在于所述引物对为能扩增出狗鱼幼鱼弹状病毒G基因的基因片段的引物对，并 且分别含有Seq ID No. 1和Seq ID No. 2所示的序列；Seq ID No. 1 :5’ -AGGCAATCATTCAATTTGGCTAAC-3，Seq ID No.2 5' -CATTTCCATACATGGTCCCTGTTG-3’所述探针为能与狗鱼幼鱼弹状病毒G基因位于所述引物对之间的序列相同或互补、且 长度为20 40bp的寡核苷酸序列，并且所述探针的5’端和3’端分别标记有荧光报告基 团和荧光淬灭基团。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述探针含有^^皿No.3所示的序列，Seq ID No.3 5' -CCTAAAAGAGGAATGCGACCAACACATCG-3，。
3.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于所述探针5’端标记的荧光报告 基团为HEX，3，端标记的荧光淬灭基团为TAMRA。
4.根据权利要求1 3任意一项所述的检测方法，其特征在于所述RT-PCR反应的引 物终浓度为0. 9 1. 1 μ mol/L,探针终浓度为0. 4 0. 6 μ mol/L。
5.根据权利要求1 4任意一项所述的检测方法，其特征在于所述RT-PCR的反应的 退火温度为55°C 60°C。
6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于所述RT-PCR的反应条件包括50°C 反转录30min，94°C预变性％iin，40个循环94°C变性15s，60°C退火及收集荧光信号lmin。
7.狗鱼幼鱼弹状病毒(Pikefry rhabdovirus, PFRV)的检测试剂盒，其特征在于所 述试剂盒含有能扩增出狗鱼幼鱼弹状病毒G基因的基因片段的引物对，所述引物对分别含 有kq ID No. 1和kq ID No. 2所示的序列，Seq ID No. 1 :5’ -AGGCAATCATTCAATTTGGCTAAC-3，Seq ID No. 2 5' -CATTTCCATACATGGTCCCTGTTG-3，。
8.根据权利要求7所述的检测试剂盒，其特征在于所述检测试剂盒用于实时荧光 RT-PCR检测，并且所述试剂盒还含有能与狗鱼幼鱼弹状病毒G基因位于所述引物对之间的 序列相同或互补、且长度为20 40bp的寡核苷酸探针，并且所述探针的5’端和3’端分别 标记有荧光报告基团和荧光淬灭基团。
9.根据权利要求8所述的检测试剂盒，其特征在于所述探针含有％(1ID No. 3所示 的序列，Seq ID No.3 5' -CCTAAAAGAGGAATGCGACCAACACATCG-3，。
10.根据权利要求9所述的检测试剂盒，其特征在于所述探针5’端标记的荧光报告 基团为HEX，3，端标记的荧光淬灭基团为TAMRA。
全文摘要
本发明公开了狗鱼幼鱼弹状病毒(PFRV)的实时荧光RT-PCR检测方法和试剂盒。本发明的方法和试剂盒利用特异性的引物对和探针，能够特异性地检测出PFRV病毒；重复性好，可稳定地进行检测；灵敏度高，相应的灵敏度为101.5TCID50。
文档编号C12Q1/70GK102108414SQ200910189339
公开日2011年6月29日 申请日期2009年12月24日 优先权日2009年12月24日
发明者何俊强, 刘荭, 卢体康, 郑晓聪, 陈红莲 申请人:深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心