专利名称：红法夫酵母菌株的复合诱变方法
技术领域：
本发明涉及一种红法夫酵母菌株的诱变方法，尤其涉及通过低温复合诱变获得红 法夫酵母诱变高产菌株的方法。
背景技术：
虾青素(Astaxanthin)为3，3，- 二羟基_4，4，- 二酮基-β，β，胡萝卜素，是一 种酮式类胡萝卜素。色泽为艳丽红色，具有脂溶性。虾青素具有许多其它的生理功能，如具 有高度猝灭单原子氧和清除自由基的作用；抗氧化作用，其抗脂肪氧化的能力比胡萝 卜素高10倍，比维生素高100倍，可有效地防止组织。细胞和DNA被氧化损伤，增强免疫功 能，抗癌作用，保护心血管健康等。虾青素作为功能色素在医药、食品、饲料及化妆品等工业 中具有广阔的应用前景，近年来受国内外研究人员和各行业的关注。目前国际市场的价格为每千克2500美元，全球每年有10亿以上的市场容量。因 此，加紧虾青素产品的开发，特别是天然虾青素产品的生产，具有很高的市场价值和十分广 阔的市场前景。现在，天然虾青素所占的市场份额很小。就目前的生产和市场情况而言，天 然虾青素由于产量低、生产成本高而很难与化学合成的虾青素在价格上进行竞争。但是随 着生产技术的改进和优化以及生产成本的降低及公众文化素质的提高，认可并要求购买含 天然虾青素的水产品或立法上要求使用天然色素添加剂，天然虾青素与合成虾青素相比就 具备了一个特殊的价格优势。红法夫酵母是研究最多的微生物，其具有作为虾青素生物来源的一些必要特征 虾青素是主要的类胡萝卜素，大约占到40-95%，能够利用多种糖作为碳源进行异养代谢； 培养时间短；不需要光照；能够在发酵罐中实现高密度培养。因而红法夫酵母被认为是一 种最具研究价值的虾青素大规模生产的来源。红法夫酵母中虾青素的含量虽然是甲壳类动物虾青素含量的5-50倍，但只有雨 生红球藻中虾青素含量的-10%，要想利用红法夫酵母来进行虾青素的工业化生产，选 育高产菌株是应用的关键。
图1是本发明所采用技术方案流程示意图。
发明内容
本发明的目的旨在通过复合诱变得到一株遗传性状稳定的高产虾青素菌株，为红 法夫酵母发酵生产虾青素的工业化奠定基础。为了达到上述目的，本发明一种红法夫酵母菌株的复合诱变方法，包括如下步 骤Si、取红法夫酵母种子培养液，稀释后涂平板；S2、一次紫外诱变在黑暗环境下，用紫外灯照射平板后，在20_25°C下培养4-5 天；
S3、二次紫外诱变筛选色素产量高且遗传稳定的菌株，重复涂平板及步骤S2 ；S4、低温处理筛选色素产量高且遗传稳定的菌株，制得种子液，保存于1_5°C环 境下2-4天；S5、单线态氧处理将种子液转移到发酵培养基中培养至对数生长中后期，提取菌 株的单细胞状态，分别加入浓度为10-15mmol/L的H2O2，振荡混勻后置于1_5°C环境中培养 10-18小时；S6、单线态氧处理后的菌株，经洗涤、稀释后涂平板在20_25°C下培养7_10天。优选方式下，本发明红法夫酵母菌株的复合诱变方法，在上述步骤S5中，菌株培 养至对数期的方法为将菌株从斜面移到发酵培养基中培养36-60小时，再转入新鲜液体 培养基培养24-48小时，至对数生长中后期。在上述步骤S5中，提取菌株的单细胞状态的 方法为用无菌离心管取1毫升菌液，以3500转/分钟离心5分钟收集菌体，用缓冲液洗涤 两次，再用缓冲液还原到原体积，在漩涡振荡器上振荡20-30秒，使菌体散开成为单细胞状 态。此外，优选方式下，步骤Sl的具体过程为将筛选培养基加热灭菌后，趁热倒平 板，15-20ml/板，凝固待用；取红法夫酵母种子培养液，用灭菌水稀释IO5-IO7倍，量取稀释 液涂平板。而制平板的培养基优先选用葡萄糖10克；蛋白胨5克，酵母膏3克，麦芽汁3 克，琼脂20克，水1升；灭菌冷却至45°C后，加入适量经过过滤除菌浓度为50-80 μ mol/L的 二苯胺溶液。优选方式下，紫外诱变的具体过程为用15w的紫外灯在距离20cm处照射，照射时 间为10-100秒。此外，本发明上述步骤S1-S6过程中，选用无菌水进行稀释；缓冲液优先选 用 pH5. 0 的 0. 2mol/L 磷酸。而上述步骤中的筛选方法，包括如下步骤S31、经诱变培养完后，用肉眼观察，在筛选平板中选取菌落较大颜色较红的单菌 落，用接菌环挑取涂到斜面培养基中培养保存；S32、复筛将初筛的菌种发酵培养，测定其生物量和色素含量，选取其中色素产量 最高的菌种。本发明一种筛选红法夫酵母高产菌株的方法。首先红法夫酵母菌株两次紫外诱 变，得到一株五代内遗传性状稳定的突变株，然后又将此突变株低温处理。经低温处理的突 变株，又经过单线态氧诱变处理，得到一株在10代内有良好的遗传稳定性的突变株。将突 变株发酵培养，测定其生物量和色素含量，均高于原始菌株。本发明通过低温复合诱变得到 一株虾青素产量较高的红法夫酵母诱变菌株，为下一步红法夫酵母工业化生产奠定基础。
具体实施例方式如图1所示本发明所采用技术方案采用重复紫外照射与单线态氧诱变结合的方 式对该酵母进行诱变选育，通过带有二苯胺的筛选培养基对各突变进行筛选，选取最优正 向突变。通过连续传代，考察突变株的稳定性。并用薄层层析的方法对色素进行纯化。实 践证明紫外诱变、经低温处理后和单线态氧(过氧化氢)复合诱变处理后，得到突变菌株， 不仅遗传性状稳定，色素含量和生物量均高于原始菌株。本发明的具体实施工艺如下一、紫外诱变
将筛选培养基加热灭菌后，趁热倒平板，15-20ml/板左右，凝固待用。取种子培养 液，用灭菌水稀释IO5-IO7倍，准确量取稀释液0.2ml涂平板。然后用15w的紫外灯在距离 20cm处照射，照射时间为10-100S。将处理后的平板在20_25°C下培养4_5天，这些操作在 黑暗中进行。 其中，筛选培养基的配置最优方案为葡萄糖IOg;蛋白胨5g，酵母膏3g，麦芽汁 3g，琼脂20g，水1L。灭菌冷却至45°C后，加入适量经过过滤除菌的二苯胺溶液，是二苯胺的 终浓度 50-80 μ mo 1/L。上述紫外诱变过程重复操作两次。此外，上述紫外诱变灯源的选择根据需要设定灯的瓦数、照射距离及时间。本发明 仅提供一中优选方案，其他经过两次紫外诱变的方案均为本发明的等同方案。同理，筛选培 养基的选择也根据需要选择常规筛选培养基或特制筛选培养基均可。二、低温处理将所选突变株的种子液保存于1_5°C环境下，2-4天。将上述种子液转移到发酵培 养基中培养96小时，测色素产量和生物量。三、单线态氧诱变选取经低温处理的紫外诱变的正突变菌株进行单线态氧处理。具体方法为将 菌株从斜面移到液体培养基中培养36-60小时，再转入新鲜液体培养基培养24-48小时到 对数生长中后期，用无菌离心管取Iml菌液3500r/min离心5min收集菌体，用pH5. 0的 0. 2mol/L磷酸缓冲液洗涤两次，再用缓冲液还原到原体积，在漩涡振荡器上振荡20-30s， 使菌体散开而成为单细胞状态。再分别加入3% H2O2 (最终浓度为10-15mmol/L)振荡混勻 后置于4°C冰箱内保存10-18小时，离心弃去上清液再用缓冲液洗涤1-2次还原到原体积， 稀释后涂平板。20-25°C培养7-10天计数。四、诱变菌株色素分析1、经诱变培养完后，用肉眼观察，在筛选平板中选取菌落较大颜色较红的单菌落， 用接菌环挑取涂到斜面培养基中培养保存。2、复筛将初筛的菌种发酵培养，测定其生物量和色素含量，选取其中色素产量最 高的菌种。实施例1A、第一次紫外诱变将筛选培养基加热灭菌后，趁热倒平板，15_20ml/板左右，凝 固待用。取种子培养液，用灭菌水稀释IO5倍，准确量取稀释液0.2ml涂平板。然后用15w 的紫外灯在距离20cm处照射，照射时间为70S。将处理后的平板在20-25°C下培养4-5天， 这些操作在黑暗中进行。B、选择这期间所得的深红色菌株，作为目的菌株，进行培养，测其生物量、色产量 和遗传稳定性。选择色素产量高且遗传稳定的菌株进行第二次紫外诱变。C、将所选突变株的种子液保存于4°C环境下，3天。D、选取经过低温处理的紫外诱变的正突变菌株进行单线态氧处理。具体方法为 将次菌株从斜面移到液体培养基中培养48小时，再转入新鲜液体培养基培养24小时到 对数生长中后期，用无菌离心管取Iml菌液3500r/min离心5min收集菌体，用pH5. 0的 0. 2mol/L磷酸缓冲液洗涤两次，再用缓冲液还原到原体积，在漩涡振荡器上振荡20-30s，使菌体散开而成为单细胞状态。再分别加入3% H2O2(最终浓度为lOmmol/L)振荡混勻后 置于4°C冰箱内保存过夜，离心弃去上清液再用缓冲液洗涤1-2次还原到原体积，稀释后涂 平板，20-25°C培养7-10天计数。E、初筛经诱变培养完后，用肉眼观察，在筛选平板中选取菌落较大颜色较红的单 菌落，用接菌环挑取涂到斜面培养基中培养保存。复筛将初筛的菌种发酵培养，测定其生 物量和色素含量。经过两次紫外诱变、低温处理和H2O2处理，得到一株在10代内有 良好的遗传稳定 性的突变株，此突变株的色素产量为5. llmg/L，生物量为10. 7g/L，分别比出发菌株红法夫 酵母 AS2. 1557(2. 63mg/L，9. 4g/L)提高了 94. 2%和 13. 8% 0实施例2与例1的不同之处在于A、B两次紫外诱变的时间为80秒；C、将所选突变株的种子液保存于3°C环境下，3天。D、单线态氧诱变处理时，H2O2最终浓度为15mmol/L ；其他均与例1相同。经过两次紫外诱变、低温处理和H2O2处理，得到一株在10代内有良好的遗传稳定 性的突变株，此突变株的色素产量为5. 56mg/L，生物量为12g/L，分别比出发菌株红法夫酵 母 AS2. 1557(2. 63mg/L，9. 4g/L)提高了 111%和 28% 0实施例3.A、B两次紫外诱变的时间为75秒；C、将所选突变株的种子液保存于5°C环境下，4天。D、单线态氧诱变处理时，H2O2最终浓度为lOmmol/L ；其他均与例1相同。经过两次紫外诱变、低温处理和H2O2处理，得到一株在10代内有良好的遗传稳定 性的突变株，此突变株的色素产量为5. 47mg/L，生物量为10. 2g/L，分别比出发菌株红法夫 酵母 AS2. 1557(2. 63mg/L，9. 4g/L)提高了 108%和 8.5%。实施例4.Si、筛选培养基加热灭菌后，趁热倒平板，18ml/板，凝固待用；取红法夫酵母种子 培养液，用灭菌水稀释IO6倍，量取稀释液涂平板。在黑暗环境下，用紫外灯照射平板后，在 23°C下培养4天；S2、筛选色素产量高且遗传稳定的菌株，重复涂平板及上述步骤；S3、筛选色素产量高且遗传稳定的菌株，制得种子液，保存于4°C环境下4天；S4、将种子液转移到发酵培养基中培养至对数生长中后期，提取菌株的单细胞状 态，分别加入浓度为12mmol/L的H2O2，振荡混勻后置于4°C环境中培养12小时；S5、选取经低温处理的紫外诱变的正突变菌株进行单线态氧处理。具体方法为 将菌株从斜面移到液体培养基中培养55小时，再转入新鲜液体培养基培养45小时到对 数生长中后期，用无菌离心管取2ml菌液3000转/分钟离心7分钟收集菌体，用pH5. 0的 0. 2mol/L磷酸缓冲液洗涤两次，再用缓冲液还原到原体积，在漩涡振荡器上振荡20-30秒， 使菌体散开而成为单细胞状态。再分别加入3% H2O2振荡混勻后置于1°C冰箱内保存11小时，离心弃去上清液再用缓冲液洗涤2次还原到原体积，稀释后涂平板，20°C培养9天计数。经过两次紫外诱变、低温处理和H2O2处理，得到一株在10代内有良好的遗传稳定 性的突变株，此突变株的色素产量为5. lmg/L，生物量为10. 9g/L，分别比出发菌株红法夫 酵母 AS2. 1557(2. 63mg/L，9. 4g/L)提高了 93. 9%和 20%。以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式
，但本发明的保护范围并不局限于此， 任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其 发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
权利要求
一种红法夫酵母菌株的复合诱变方法，其特征在于，包括如下步骤S1、取红法夫酵母种子培养液，稀释后涂平板；S2、一次紫外诱变在黑暗环境下，用紫外灯照射平板后，在20-25℃下培养4-5天；S3、二次紫外诱变筛选色素产量高且遗传稳定的菌株，重复涂平板及步骤S2；S4、低温处理筛选色素产量高且遗传稳定的菌株，制得种子液，保存于1-5℃环境下2-4天；S5、单线态氧处理将所述种子液转移到发酵培养基中培养至对数生长中后期，提取菌株的单细胞状态，分别加入浓度为10-15mmol/L的H2O2，振荡混匀后置于1-5℃环境中培养10-18小时；S6、单线态氧处理后的菌株，经洗涤、稀释后涂平板在20-25℃下培养7-10天。
2.根据权利要求1所述红法夫酵母菌株的复合诱变方法，其特征在于，步骤S5中，菌株培养至对数期的方法为将菌株从斜面移到发酵培养基中培养36-60 小时，再转入新鲜液体培养基培养24-48小时，至对数生长中后期；步骤S5中，提取菌株的单细胞状态的方法为用无菌离心管取1毫升菌液，以3500转 /分钟离心5分钟收集菌体，用缓冲液洗涤两次，再用缓冲液还原到原体积，在漩涡振荡器 上振荡20-30秒，使菌体散开成为单细胞状态。
3.根据权利要求2所述红法夫酵母菌株的复合诱变方法，其特征在于，步骤Sl的具体过程为将筛选培养基加热灭菌后，趁热倒平板，15-20ml/板，凝固待 用；取红法夫酵母种子培养液，用灭菌水稀释IO5-IO7倍，量取稀释液涂平板。
4.根据权利要求3所述红法夫酵母菌株的复合诱变方法，其特征在于，步骤S2的具体过程为用15w的紫外灯在距离20cm处照射，照射时间为10-100秒。
5.根据权利要求1-4任一所述红法夫酵母菌株的复合诱变方法，其特征在于，步骤 S1-S6过程中，选用无菌水稀释；缓冲液选用pH5. 0的0. 2mol/L磷酸。
6.根据权利要求1-4任一所述红法夫酵母菌株的复合诱变方法，其特征在于，步骤 S1-S6中筛选方法包括531、经诱变培养完后，用肉眼观察，在筛选平板中选取菌落较大颜色较红的单菌落，用 接菌环挑取涂到斜面培养基中培养保存；532、复筛将初筛的菌种发酵培养，测定其生物量和色素含量，选取其中色素产量最高 的菌种。
7.根据权利要求6所述红法夫酵母菌株的复合诱变方法，其特征在于，步骤S1-S3平板所用培养基为葡萄糖10克；蛋白胨5克，酵母膏3克，麦芽汁3克，琼 脂20克，水1升；灭菌冷却至45°C后，加入适量经过过滤除菌浓度为50-80 μ mol/L的二苯 胺溶液。
全文摘要
本发明一种红法夫酵母菌株的复合诱变方法，首先红法夫酵母菌株两次紫外诱变，得到一株五代内遗传性状稳定的突变株，然后又将此突变株低温处理。经低温处理的突变株，又经过单线态氧诱变处理，得到一株在10代内有良好的遗传稳定性的突变株。将突变株发酵培养，测定其生物量和色素含量，均高于原始菌株。本发明通过低温复合诱变得到一株虾青素产量较高的红法夫酵母诱变菌株，为下一步红法夫酵母工业化生产奠定基础。
文档编号C12N15/01GK101818141SQ200910188300
公开日2010年9月1日 申请日期2009年10月30日 优先权日2009年10月30日
发明者侯娟, 叶淑红, 王晗, 王际辉 申请人:大连工业大学