专利名称：具有预防治疗动脉粥样硬化作用的重组蛋白表达与纯化的制作方法
技术领域：
本发明涉及人源重组蛋白的表达和纯化，具体涉及到一种可抑制动脉粥样硬化发
生机理的人源糖蛋白其中一个功能域的原核表达、纯化及应用。
背景技术：
抗磷脂综合症(antiphospholipid syndrome ;APS)是1986年新确立的一种隶属 于系统性红斑狼疮症(systemic lupus erythematosus ;SLE)的一种难治性自身免疫性疾 病，临床表现为动静脉血栓和习惯性流产以及血小板减少等症状。抗心磷脂抗体由于与血 栓形成、血小板减少、系统性红斑狼疮、习惯性流产等凝血系统改变等密切相关，所以抗心 磷脂抗体可作为抗磷脂综合症诊断依据之一，也可作为临床上预测血栓形成趋势的标志。
抗心磷脂抗体(aCL)的真正抗原并不是心磷脂Cardiolipin，而是存在于血清中 的一种糖蛋白^-glycoprotein I(P2-GPI))。所以抗心磷脂抗体也被称为抗P 2_糖蛋 白I(P2-glycoproteinI ; P 2_GPI)抗体。P 2_GPI又称为载脂蛋白H(即olipoprotein H， 即oH)，是血浆中的一种糖蛋白，由含有326个氨基酸残基的一条多肽链组成，13 2-GPI分子 中存在5个特殊功能的结构域[Q. Liu， K. Kobayashi， J. Furukawa， J. Inagaki， N. Sakairi， A. Iwado， T. Yasuda， T.Koike， D. R. Voelker， andE. Matsuura， Omega—carboxyl variants of 7_ketocholesteryl esters are ligands forbeta(2)-glycoprotein I and mediate antibody—dependent uptake of oxidized U)L by macrophages.几ipid Res 43 : 1486-95,2002]。 在体内P2-GPI通过oxLDL上的配体同oxLDL结合形成复合物，在此情况下 13 2-GPI上潜藏的抗原决定簇凸现出来，并被人自身抗13 2_GPI抗体识别。13 2-GPI-oxLDL 的复合体与抗P2-GPI抗体特异性结合进而导致巨噬细胞的胆固醇的吞噬摄取和泡 沫化是抗磷脂综合症动脉硬化和血栓形成过程中的一个关键事件和环节。目前认为 P2-GPI的第五结构域参与其与oxLDL存在的配体(oxLig-1)结合，而抗P 2_GPI抗体识 别P2-GPI的抗原决定簇在其第四结构域，并且，此隐藏的抗原决定簇需要在P2-GPI与 oxLDL结合后才被展现并被识别，因此，把P2-GPI的第五结构域单独表达出来，作为药 物竞争性的与oxLDL结合，但不能被自身抗P2-GPI抗体识别，从而可达到预防减缓甚至 治疗动脉硬化[K. Kobayashi， E. Mats皿ra， Q. Liu， J. Furukawa， K. Kaihara， J. Inagaki， T. Ats咖i， N. Sakairi， T. Yasuda， D. R. Voelker， and T. Koike， Aspecific ligand for beta (2)-glycoprotein I mediates autoantibody-d印endent uptake of oxidized lowdensity lipoprotein by macrophages. J Lipid Res 42(2001)697-709]。
|3 2-GPI的第五结构域的获得须通过体外表达的方式，而要得到大量的并且具有 活性的P2-GPI Domain V，那么原核表达为最佳选择表达方法之一。
发明内容
本发明的目的在于提供一种重组蛋白13 2_GPI Domain V的原核表达方法；并验证重组蛋白P2-GPI Domain V在动脉硬化致病机理与人自身P 2_GPI竞争性结合oxLig-l (存 在与oxLDL上并可结合e厂GPI的一个配体)的应用，以及重组蛋白P2-GPI Domain V作 为预防治疗动脉粥样硬化疾病药物的应用。
为达到上述目的，本发明的技术方案是 通过设计一对上下游引物在已保存有P厂GPI基因片段的T载体上进行 Polymerase ChainReaction (PCR)反应扩增得到P 2_GPI Domain V基因片段，并克隆到表 达载体pET-32a-c (+)上，构建表达载体pET32a_DV，并将其转化至大肠杆菌rosetta-gami 表达菌，然后经过异丙基-P-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组蛋白表达，并通过镍离子亲 和层析柱纯化重组蛋白，western blot方法验证重组蛋白P 2_GPI Domain V表达，TLC-配 体实验验证重组表达P2-GPI Domain V蛋白活性，ELISA竞争性抑制试验验证重组表达 13厂GPIdomain V蛋白可作为预防治疗动脉粥样硬化药物的可行性。
上下游引物如下
上游引物 5' -CGG GGTACC GACGACGACGAC AAAGCATCTTGTAAAGTACCTGTG-3'
45bp
下游引物 5' -CG GAATTC TTAGCATGGCTTTACATCGGATGC-3，
32bp 其中上游引物中5'端含有Kpnl酶切位点、保护碱基、EK酶切位点以及P 2_GPI
Domain V5'端部分氨基酸编码基因序列；下游引物中5'端含有EcoRI酶切位点、保护碱基
以及P厂GPIDomain V 3'端部分氨基酸编码基因的互补序列。 具有预防治疗动脉粥样硬化作用的重组蛋白表达与纯化的过程如下 (1)重组人P2-GPI Domain V基因片段扩增 选用上游引物和下游引物，以已保存有P2-GPI基因片段的T载体重组质粒为模
板，PCR反应扩增P2-GPI Domain V目的基因； (2) P 2-GPI Domain V表达载体pET32a-DV的构建 1) P 2-GPI Domain V目的基因T载体构建 将步骤(1)中获得的P2-GPI Domain V目的基因PCR产物纯化回收并将其与 PMD19-Tsimple连接，获得含有P2-GPI Domain V目的基因的T载体，并将其转化至JM 109 大肠杆菌中，通过抗性筛选阳性克隆挑选连接正确的T载体克隆，并通过菌体PCR、酶切、T 载体测序手段鉴定载体构建正确性； 2) P 2-GPI Domain V目的基因与表达载体pET-32a-c (+)的连接构建
根据上游引物和下游引物设计的酶切位点分别对含有P2-GPI Domain V目的基 因的T载体和pET-32a-c (+)载体分别进行双酶切，通过对酶切得到的DNA片段进行凝胶纯 化回收，采用连接试剂盒对目的基因P2-GPI Domain V和酶切后的线性pET-32a-c (+)载体 进行连接，构建P2-GPI Domain V表达载体pET32a_DV，通过转化JM109菌，进行抗性筛选 挑选连接成功的菌株，并通过菌体PCR，双酶切实验手段对表达载体pET32a-DV进行鉴定， 其结果表明表达载体pET32a-DV构建完成。 (3)将表达载体pET32a-DV转化至表达菌株rosetta-gami (DE3):
取已经确认的100 ii g/ ii L表达载体pET32a-DV 0. 1 ii L_5 ii L转化氯化钙制备的 表达菌株rosetta-gami (DE3)感受态细胞中，涂布到特定抗性的LB平板上。挑选阳性克隆 低温冰箱内甘油保存此菌种。 (4)重组P2-GPI Domain V诱导表达以及纯化
1)重组P 2-GPI Domain V IPTG诱导表达 对重组P 2-GPI Domain V蛋白的0_2mM不同浓度IPTG诱导表达，在诱导3-6小
时后，SDS-PAGE全蛋白电泳，确定P2-GPI DomainV蛋白是否成功表达。 2)重组P 2_GPI Domain V AKATA仪镍离子亲和层析柱纯化 收集100-lOOOml的经过IPTG诱导表达后的rosetta-gami菌体，用PH :5-8，
10-lOOmM的Tris-HCL超声裂解液重悬菌体，50-300W功率进行超声破碎，lOOOOrpm以上速
度离心后，取全部上清液用AKATA仪通过镍离子亲和层析柱纯化蛋白，最后通过对纯化的
蛋白进行SDS-PAGE电泳，测定纯度。 (5)用western blot方法检测目的蛋白: 选取10-lOOml经过IPTG诱导表达后的rosetta-gami菌体进行超声破碎后，取 1-30 L上清液，进行SDS-PAGE电泳，并将蛋白转移到硝酸纤维素膜上，孵育小鼠抗His抗 体，HRP山羊抗鼠二抗，最后通过ECL显色液显色，底片曝光显示结果。 [OO34] (6) TLC-配体实验验证重组表达P 2-GPI Domain V蛋白活性
将心磷脂和oxLig-1各按1-50 y g量分别点样TLC板，展开剂氯仿甲醇体 积比为8 : 1-10 : 1， 3 % (w/v)的gelatin封闭，分别孵育P 2_GPI/ P 2_GPI Domain V，并分别孵育WB-Cal-l抗体/Anti-His Antibody。孵育HRP标记山羊抗鼠抗体，经 4-methoxy-l-n即hto1显色成像，重组P 2_GPI Domain V同P 2_GPI均可与CL， oxlig-1结 合。 (7) P 2-GPI Domain V， P 2_GPI竞争性结合oxLig-1实验: 将0. l-50ii g的oxLig-1包被到96孔板上，通过加入0. 5ii g-3ii g P 2_GPI和 0. 5 ii g-10. 5 ii g的相应浓度梯度的重组P 2-GPI Domain V，从而实现P 2_GPI Domain V， P 2_GPI竞争性结合oxLig-1 ，通过孵育WB-Cal-l抗体，HRP标记的山羊抗鼠二抗，最后用酶 标仪在400-600nm波长下检测0D并记录其结果。 本发明通过获得oxLDL上的一个介导oxLDL与P 2_GPI结合的配体oxLig-l，用其 代替oxLDL，构建通过与P2-GPI抑制性酶联免疫实验，验证了本实验原核表达的P2-GPI Domain V的生物活性，同时也证实了 P 2_GPI Domain V可以有效的竞争性抑制P 2_GPI与 oxLig-1 (oxLDL)的结合作用，从而抑制了人自身抗P2-GPI抗体识别1^-GPI，进而抑制 oxLDL被巨噬细胞所吞噬发生泡沫化。起到预防并预防治疗动脉硬化的作用。
本发明获得的蛋白，包括一个Trx融合标签与目的蛋白序列融合表达，在29KD左 右，其中Trx标签与目的蛋白之间含有EK酶切位点，在必要时可对其进行切除。本发明还 对菌体表达的蛋白进行纯化回收，通过AKATA仪镍离子亲和层析柱对其纯化，最后目的蛋 白纯度可在85%以上。 本发明的有益效果是表达重组蛋白P2-GPI Domain V能够有效竞争性抑制 oxLig-l与P 2-GPI的结合，也就是P 2-GPI Domain V间接的消耗了抗P2-GPI抗体，减少 巨噬细胞对P厂GPI/oxLDL/抗P厂GPI抗体三体复合物的摄入从而使动脉粥样硬化的预防
6治疗成为可能。
图1为重组|3 2-GPI Domain V基因片段PCR琼脂糖电泳图。 泳道1 :DL2000marker ;泳道2 : P 2_GPI Domain V基因(287bp)PCR结果; 图2为目的基因13 2_GPI Domain V与T载体连接的PCR鉴定结果图。 泳道1 :DL2000marker ;泳道2 :1号菌PCR结果；泳道3 :2号菌PCR结果 图3为T载体目的基因13 2_GPI DomainV片段测序结果图。 图4为目的基因P 2_GPI DomainV表达载体pET32a_DV菌体PCR电泳图。 泳道1 :DL2000marker ;泳道2 :1号菌PCR结果；泳道3 :2号菌PCR结果；泳道4 :3
号菌PCR结果；泳道5 :4号菌PCR结果；泳道6 :5号菌PCR结果；泳道7 :6号菌PCR结果； 泳道8 :7号菌PCR结果；泳道9 :8号菌PCR结果；泳道10 :9号菌PCR结果。 图5为目的基因P 2-GPI Domain V表达载体pET32a_DV酶切鉴定图。
泳道1 :DL2000marker ;泳道2 :pET32a+表达载体酶切结果。
图6为DV全蛋白IPTG诱导SDS-PAGE电泳。 泳道1 :蛋白marker ;泳道2 :无IPTG诱导；泳道3 :0. OlmM IPTG诱导；泳道4 :
0. 05mM IPTG诱导；泳道5 :0. lmM IPTG诱导；泳道6 :0. 5mM IPTG诱导；泳道7 :lmMIPTG诱 导；泳道8 :2mM IPTG诱导。 图7为P 2-GPIDomainV蛋白可溶表达与纯化SDS-PAGE电泳图。 泳道1 :蛋白marker ;泳道2 :纯化后P 2_GPI Domain V重组蛋白。 图8为P 2-GPI Domain V的Western Blot方法检测结果图。 图9为TLC板P 2-GPI Domain V/oxLig_l， CL结合活性验证图。 1 :CL点样，孵育P2-GPI，WB-Cal-1抗体;2 :CL点样，孵育P 2_GPI，抗His-taq抗
体；3 :oxLig-l点样，孵育P2-GPI， WB-Cal-1抗体；4 :孵育P2-GPI，抗His-taq抗体。 图10为P 2-GPI Domain V， P 2_GPI竞争性结合oxLig-1实验结果图(oxLig-1包
被板)。 纵坐标为492nm波长0D值，横坐标依次为1 P 2_GPI (1. 5 y g) DV (0 y g); 2 P 2_GPI (1. 5 ii g) ， DV(l. 5 ii g) ;3 P 2_GPI (1. 5 ii g)DV(4. 5 ii g) ;4 P 2_GPI (1. 5 ii g) DV(9 ii g) ;5 P 2-GPI (1. 5 ii g)DV(15 y g) ;6阴性对照组Control 1 (无P 2_GPI，力口 DV
1. 5ii g) ，7Contro1 2(1.5iig P 2-GPI，无oxLig-1包被)。
具体实施方式
实施例1 具有预防治疗动脉粥样硬化作用的重组蛋白表达与纯化的过程如下
(1)重组P 2-GPI Domain V基因片段扩增 该扩增体系选用上游引物和下游引物，以本实验室保存CTA727-1重组质粒为模 板，反应条件如下
94°C lmin ; (98°C 10s ;57。C 30s ;72。C 30s) X30 ;
72 °C 10min。 重组|3 2-GPI Domain V基因PCR产物大小为287bp，如图1所示经过1%琼脂糖
凝胶电泳，可见目的片段大小与预期一致。 (2) P 2-GPI Domain V表达载体pET32a_DV的构建 1) P 2-GPI Domain V目的基因T载体构建 (a)将50ii L Domain V目的基因PCR产物上样，1. 5%胶琼脂糖电泳，用胶回收试
剂盒将目的基因回收； 连接反应体系 PMD19-T simple vector : 1u L (50u g)
P 2-GPI Domain V : 3 ii L (150 ii g) dH20 : 1 ii L 用TaKaRa连接试剂盒，加入solution I， 16。C连接45min。 (b) PCR鉴定T载体与|3 2-GPI Domain V目的基因是否连接成功 将带有|3 2-GPI Domain V目的基因的T_载体转入JM109菌中，随机挑去3个单
菌落进行菌体PCR鉴定，鉴定目的基因P2-GPI Domain V是否连接或正确连接到T载体。 I)分别用枪头随机挑取l，2，3号单菌于5iiL dH20中，置于PCR管中，标号1， 2， 3
号管； II)建立PCR反应体系 实验结果如图2，在287bp左右，1， 2， 3号菌中均有特异性目的条带，说明在T载体 中存在Domain V目的基因，选3号特异性条带最强菌落进行后续实验。
(c)T载体测序鉴定 T载体质粒由大连宝生物公司测序，用Bioedit软件将测定基因的核苷酸序列以 及推导的氨基酸序列与GenBank发表的序列进行对比分析。 GGCTTTTTGGAAAACTGATGCATCCGATGTAAAGCCATGCTAAGAATTCCG
如图3，经过比对与NCBI给出的序列完全吻合。 2) P2-GPI Domain V目的基因与表达载体pET-32a-c (+)的连接构建 通过对酶切得到的DNA片段进行凝胶纯化回收，采用连接试剂盒对目的基因
P2-GPIDomain V和酶切后的线性pET-32a-c (+)载体进行连接，构建P 2_GPI Domain V
表达载体pET32a-DV，通过转化JM109菌，进行抗性筛选挑选连接成功的菌株，并通过菌体
PCR，双酶切实验手段对表达载体pET32a-DV进行鉴定，其结果表明表达载体pET32a-DV构
建完成。 (a)用BBI公司的质粒提取试剂盒提取T载体质粒。并对T载体以及pET-32a-c (+) 载体进行双酶切，采用限制性内切酶EcoR 1、Kpn I。双酶切体系如下(50iU)
pET-32a-c (+)双酶切 T载体 10 XM buffer: 5 ii L 5 ii L
8
EcoRI : Kpnl :2ii 1 pET32a+表达载体/ T载体/ dH20 :11 ii L11 ii L 反应条件37°C，4h。 酶切结束后分别上样跑1. 5%琼脂糖凝胶并用胶回收试剂盒回收目的基因。并按照载体目的基因=1 : 3 10的比例进行定:直； (b)连接表达载体，采用Takara 1igation kit，取3yL pET32a_DV转化大肠杆菌JM109中。 (c)PCR鉴定目的基因P 2-GPI Domain V表达载体pET32a_DV : 用菌体PCR方法对转入JM109菌中P 2_GPI Domain V连接表达载体进行鉴定目
的基因是否与表达载体连接。 a)随机用枪头挑取单菌落l，2，3，4，5，6，7，8，9号于含有5iiL c^0的PCR管中， 并在PCR管上标相应序列号。
0104]b)建立PCR反应体系
0105]94°C lmin ; (98°C 10s ;57。C 30s 72°C 30s) X30 ;72。C lOmin。0106]结果如图4， 3， 4， 5， 6， 7， 8， 9号菌中均有特异性条带。0107]3)酶切鉴定目的基因132-GPI Domain V表达载体pET32a_DV :
0108]酶切体系(50 y L)
0109]10XMbuffer :5 li L
0110]EcoRI :
0111 ]Kpnl :
0112]pET32a+表达载体
0113]dH20 : 21iiL
0114]结果如图5，酶切后结果存在287bp条带，说明目的基因已经正确连接表达载体。0115](3)将表达载体pET32a--DV转化至表达菌株rosetta-gami (DE3):
0116]用BBI质粒提取试剂盒提取转化阳性菌株质粒。取2 L质粒转化氯化钙制备的表达菌株rosetta-gami (DE3)感受态细胞100iiL。涂布到LB (氨节青霉素、四环素、卡那霉 素抗性)平板上，37t:倒置培养。挑选阳性克隆体积比20%甘油保存。将菌种-8(TC保存。
(4)重组P 2-GPI Domain V诱导表达以及纯化 对P2-GPI Domain V蛋白的不同浓度IPTG 6h诱导表达，(目的蛋白前段加Trx 标签后的蛋白约30KD。) 用无IPTG ;0. OlmM IPTG ;0. 05mM IPTG ;0. ImM IPTG ;0. 5mM IPTG ;lmM IPTG ;2mM IPTG ;6小时诱导表达，SDS-PAGE全蛋白电泳，如图6，在30KD左右可以看到清晰特异性蛋 白条带，在25KD到34KD Marker之间，在无IPTG诱导和存在IPTG诱导对比显示，P 2_GPI DomainV蛋白已经成功表达。 1)全蛋白IPTG诱导表达，实验步骤如下a)取4iiL菌液(表达菌甘油保存菌)加入5mLLB(amp抗性)培养基，160rpm 37°C过夜摇菌； b)取lmL菌液，1 : 50比例加LB(amp抗性)培养基至50mL，锥形瓶中170rpm 37°C 摇菌； c)测0D600至0. 5时，分装菌液，5mL每管，共8管并标号0， 1， 2， 3， 4， 5， 6， 7 ; d)并加IPTG浓度按编号依次如为无IPTG ;0. OlmM ;0. 05mM ;0. ImM ;0. 5mM ;lmM ; 2mM ; e) 170rpm 37。C摇菌6小时； f)取出菌液，5000rpm 5min离心去上清； g)力卩入80 ii L TE (1 X) ， 20 ii L 5 X loading buffer ; h) IO(TC煮沸5min ; i)配置12%聚丙烯酰胺凝胶，进行电泳； j)考马斯亮蓝染色，凝胶成像系统成像； 2)重组P2-GPI Domain VAKATA仪经过镍亲和层析柱纯化 在33t:条件下培养6h 2L表达菌，超声破碎后取上清上AKATA仪经过镍亲和层析 柱纯化后，收集纯化Domain V蛋白做15% SDS-PAGE电泳，如图7，经过BAND SCAN软件分 析，用镍亲和层析柱纯化Domain V蛋白后纯度可达85%以上。
(5)用western blot方法检测目的蛋白: 用抗His抗体检测表达蛋白中是否含有P2-GPI Domain V蛋白，实验步骤如下 1)选取20ml经过0. ImM IPTG诱导37。C培养的rosetta-gami菌体进行超声破碎
后，取10iiL破碎后的上清液； 2)体积比12%聚丙烯酰胺胶配制； 3) 10 ii L每孔上样，SDS-PAGE电泳100V 2h ; 4)转膜，冰上100V lh ; 5)5% (w/v) BSA封闭lh ; 6) 1 : 3000稀释his-antibody 4。C摇摆平台过夜； 7) HRP标记山羊抗鼠抗体(1 : 5000稀释)摇摆平台孵育lh ; 8)ECL显色(Amersham ECL Plus western Blotting petction Reagents); 9)暗室中曝光IO分钟在显影液中显影，定影液中定影，取出底片； 10)凝胶成像系统下显影。 用western的方法对菌株表达全蛋白检测是否含有目的蛋白。如图8所示，用抗
his抗体作为一抗，HRP标记山羊抗鼠标记二抗，有目的条带出现。 (6)TLC-配体实验验证重组表达P2-GPI Domain V蛋白活性 镍离子亲和层析柱纯化P2-GPI Domain V蛋白后对85%纯度Domain V蛋白活性
采用TLC-配体结合实验进行鉴定 将心磷脂、oxLig-l各lOiig分别点样TLC板，展开剂氯仿甲醇=8 : 1，3% (w/v) gelatin封闭，分别孵育P 2_GPI/P 2_GPI Domain V，并分别孵育WB-Cal-1抗体/ Anti-His Antibody。孵育HRP标记山羊抗鼠抗体，经4-methoxy-l-n即hto1显色成像，结 果如图9，重组P 2-GPIDomain V同P 2_GPI均可与CL， oxlig-1结合。
(7) P 2-GPI Domain V， P 2_GPI竞争性结合oxLig—1实验:
1)将浓度为50 ii g/mL oxLig-1每孔包被50 P L，包被过夜； 2)1% gelatin-PBS(150ii L)每孔封闭1小时; 3) 180 li L/well PBS-O. 05% Tween-20，洗3次; 4)按梯度加入Domain V并加入1. 5 y g P 2-GPI ， PBS补足180 u L，孵育40分钟 5)加入单克隆抗体anti-p2-GPI抗体WB-CAL-l(50iig/mL)，50uL/well。孵育1 小时。 6) 180 ii L/well PBS-O. 05% Tween-20，洗3次； 7)孵育HRP标记山羊抗小鼠抗体，1小时； 8) 180 li l/well PBS-O. 05% Tween-20，洗3次； 9)0PD显色； 10) 2N浓硫酸，100 ii L/well终止; 11)492nm波长下酶标仪检测数据。 如图10结果所示，重组f3厂GPI Domain V蛋白起到了与oxLig-l结合的作用， 并且在P2-GPI的存在下，重组P2-GPI Domain V起到了显著的与GPI竞争性结合 oxLig-l的作用。
权利要求
具有预防治疗动脉粥样硬化作用的重组蛋白表达与纯化，其特征在于，通过设计一对上下游引物在已保存有β2-GPI基因片段的T载体上进行Polymerase Chain Reaction(PCR)反应扩增得到β2-GPI Domain V基因片段，并克隆到表达载体pET-32a-c(+)上，构建表达载体pET32a-DV，并将其转化至大肠杆菌rosetta-gami表达菌，然后经过异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组蛋白表达，并通过镍离子亲和层析柱纯化重组蛋白，western blot方法验证重组蛋白β2-GPI Domain V表达，TLC-配体实验验证重组表达β2-GPI Domain V蛋白活性，ELISA竞争性抑制试验验证重组表达β2-GPIdomain V蛋白可作为预防治疗动脉粥样硬化药物的可行性；上下游引物如下上游引物5’-CGG GGTACCAAAGCATCTTGTAAAGTACCTGTG-3’45bp下游引物5’-CG GAATTC TTAGCATGGCTTTACATCGGATGC-3’32bp其中上游引物中5’端含有KpnI酶切位点、保护碱基、EK酶切位点以及β2-GPI Domain V5’端部分氨基酸编码基因序列；下游引物中5’端含有EcoRI酶切位点、保护碱基以及β2-GPIDomain V 3’端部分氨基酸编码基因的互补序列；具有预防治疗动脉粥样硬化作用的重组蛋白表达与纯化的步骤如下(1)重组人β2-GPI Domain V基因片段扩增选用上游引物和下游引物，以已保存有β2-GPI基因片段的T载体重组质粒为模板，PCR反应扩增β2-GPI Domain V目的基因；(2)β2-GPI Domain V表达载体pET32a-DV的构建1)β2-GPI Domain V目的基因T载体构建将步骤(1)中获得的β2-GPI Domain V目的基因PCR产物纯化回收并将其与PMD19-Tsimple连接，获得含有β2-GPI Domain V目的基因的T载体，并将其转化至JM 109大肠杆菌中，通过抗性筛选阳性克隆挑选连接正确的T载体克隆，并通过菌体PCR、酶切、T载体测序手段鉴定载体构建正确性；2)β2-GPI Domain V目的基因与表达载体pET-32a-c(+)的连接构建根据上游引物和下游引物设计的酶切位点分别对含有β2-GPI Domain V目的基因的T载体和pET-32a-c(+)载体分别进行双酶切，通过对酶切得到的DNA片段进行凝胶纯化回收，采用连接试剂盒对目的基因β2-GPI Domain V和酶切后的线性pET-32a-c(+)载体进行连接，构建β2-GPI Domain V表达载体pET32a-DV，通过转化JM109菌，进行抗性筛选挑选连接成功的菌株，并通过菌体PCR，双酶切实验手段对表达载体pET32a-DV进行鉴定，其结果表明表达载体pET32a-DV构建完成；(3)将表达载体pET32a-DV转化至表达菌株rosetta-gami(DE3)取已经确认的100μg/μL表达载体pET32a-DV 0.1μL-5μL转化氯化钙制备的表达菌株rosetta-gami(DE3)感受态细胞中，涂布到特定抗性的LB平板上，挑选阳性克隆低温冰箱内甘油保存此菌种；(4)重组β2-GPI Domain V诱导表达以及纯化1)重组β2-GPI Domain V IPTG诱导表达对重组β2-GPI Domain V蛋白的0-2mM不同浓度IPTG诱导表达，在诱导3-6小时后，SDS-PAGE全蛋白电泳，确定β2-GPI DomainV蛋白是否成功表达；2)重组β2-GPI Domain V AKATA仪镍离子亲和层析柱纯化收集100-1000ml的经过IPTG诱导表达后的rosetta-gami菌体，用PH5-8，10-100mM的Tris-HCL超声裂解液重悬菌体，50-300W功率进行超声破碎，10000rpm以上速度离心后，取全部上清液用AKATA仪通过镍离子亲和层析柱纯化蛋白，最后通过对纯化的蛋白进行SDS-PAGE电泳，测定纯度；(5)用western blot方法检测目的蛋白选取10-100ml经过IPTG诱导表达后的rosetta-gami菌体进行超声破碎后，取1-30μL上清液，进行SDS-PAGE电泳，并将蛋白转移到硝酸纤维素膜上，孵育小鼠抗His抗体，HRP山羊抗鼠二抗，最后通过ECL显色液显色，底片曝光显示结果；(6)TLC-配体实验验证重组表达β2-GPI Domain V蛋白活性将心磷脂和oxLig-1各按1-50μg量分别点样TLC板，展开剂氯仿∶甲醇体积比为8∶1-10∶1，3％(w/v)的gelatin封闭，分别孵育β2-GPI/β2-GPI Domain V，并分别孵育WB-Cal-1抗体/Anti-His Antibody。孵育HRP标记山羊抗鼠抗体，经4-methoxy-1-naphtol显色成像，重组β2-GPI Domain V同β2-GPI均可与CL，oxlig-1结合；(7)β2-GPI Domain V，β2-GPI竞争性结合oxLig-1实验将0.1-50μg的oxLig-1包被到96孔板上，通过加入0.5μg-3μg β2-GPI和0.5μg-10.5μg的相应浓度梯度的重组β2-GPI Domain V，从而实现β2-GPI Domain V，β2-GPI竞争性结合oxLig-1，通过孵育WB-Cal-1抗体，HRP标记的山羊抗鼠二抗，最后用酶标仪在400-600nm波长下检测OD并记录其结果。F2009101879439C00011.tif
2.根据权利要求1所述的具有预防治疗动脉粥样硬化作用的重组蛋白表达与纯化，其特征在于，表达重组蛋白P2-GPI Domain V能够有效竞争性抑制oxLig-1与P 2_GPI的结合，减少巨噬细胞对P厂GPI/oxLDL/抗P厂GPI抗体三体复合物的摄入，从而使动脉粥样硬化的预防治疗成为可能。
全文摘要
本发明涉及人源重组蛋白的表达和纯化，具体涉及到一种具有预防治疗动脉粥样硬化作用的重组蛋白表达与纯化。通过设计一对上下游引物在已保存有β2-GPI基因片段的T载体上进行Polymerase Chain Reaction(PCR)反应扩增得到β2-GPI Domain V基因片段，并克隆到表达载体pET-32a-c(+)上，构建表达载体pET32a-DV，并将其转化至大肠杆菌rosetta-gami表达菌，然后经过异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组蛋白表达，并通过镍离子亲和层析柱纯化重组蛋白，western blot方法验证重组蛋白β2-GPI Domain V表达，TLC-配体实验验证重组表达β2-GPI Domain V蛋白活性，ELISA竞争性抑制试验验证重组表达β2-GPIdomain V蛋白可作为预防治疗动脉粥样硬化药物的可行性。
文档编号C12N15/70GK101775406SQ20091018794
公开日2010年7月14日 申请日期2009年10月15日 优先权日2009年10月15日
发明者刘庆平, 张英彪, 李文哲, 迟彦 申请人:大连大学