专利名称：早幼粒细胞白血病pml蛋白单克隆抗体的制备及应用的制作方法
技术领域：
本发明公开一种可特异性识别人早幼粒细胞白血病蛋白(PML蛋白)的单克隆抗 体的制备方法，该单克隆抗体可用于检测急性早幼粒细胞白血病PML-RARa融合蛋白，属 于生物基因工程和医学领域。
背景技术：
早幼粒细胞白血病基因(PML基因)位于染色体15q22上。其表达产物PML蛋白， 属于锌指类DNA结合转录因子家族成员，主要由富含半胱氨酸的锌指结构区、α -螺旋卷 曲结构区和丝氨酸/脯氨酸富集区组成。其中，锌指结构区由“ring finger”结构和两个 B-box (转录因子结合域)结构组成，是PML结合DNA的重要结构域；α -螺旋卷曲结构区 是形成蛋白二聚体所必需的；丝氨酸/脯氨酸富集区的功能与一些基因的转录活性片段相 似。近年来，大量研究表明PML蛋白与许多肿瘤抑制剂有相似的特征，即PML蛋白控制 着细胞的增殖、肿瘤基因及造血细胞的分化，PML基因及其表达的PML蛋白在许多肿瘤的发 生中起重要作用。在急性早幼粒细胞白血病的发病过程中，PML基因与位于17号染色体的 视黄酸α受体基因(RAR α基因)发生t (15; 17)染色体易位，形成PML-RAR α融合基因。 此融合基因表达的PML-RARa融合蛋白可阻断骨髓干细胞的正常分化和凋亡，导致急性早 幼粒细胞白血病的发生。本发明采用DNA重组技术，在大肠杆菌中表达PML重组蛋白，重组蛋白经酶切和纯 化后免疫BALB/c小鼠，制备抗人PML的单克隆抗体，该单克隆抗体可特异性识别人PML蛋 白，可用于检测PML-RARa融合蛋白，为急性早幼粒细胞白血病的诊断提供帮助，并能指导 其临床预后判断和治疗方案的选择。
发明内容
本发明说明了一种可特异性识别人PML蛋白的单克隆抗体的制备方法。本发明选择了 PML蛋白锌指结构域中“ring finger”结构区的一段氨基酸序列， 通过分子克隆的方法将其在大肠杆菌中表达。本发明涉及从人粒细胞白血病细胞系(HL60)中，通过RT-PCR方法获得一段PML 基因，将其克隆入pET32a载体中，在大肠杆菌中表达PML蛋白，将此重组蛋白经酶切和纯 化后免疫BALB/c小鼠，通过细胞融合技术获得杂交瘤细胞株，将杂交瘤细胞接种至小鼠腹 腔，制备腹水，从腹水中提纯抗人PML单克隆抗体。该单克隆抗体可特异性识别人PML蛋 白，可用于检测PML-RARa融合蛋白，为急性早幼粒细胞白血病的诊断提供帮助，并能指导 其临床预后判断和治疗方案的选择。
图1是经RT-PCR获得的一段PML基因片段及重组载体pET32a_PML的双酶切鉴定结果。1 :PML 基因片段的 PCR 结果；2 =Marker DL2000 ；3 :MarkerDL2000 ；4 :pET32a_PML 双
酶切结果。图2是Trx-PML融合蛋白经IPTG诱导表达的SDS-PAGE电泳(12% )，酶切后PML 蛋白的纯化结果及免疫印迹鉴定结果。1 :pET32a-PML诱导结果；2 :pET32a空载体诱导结 果；3 蛋白Marker ；4 蛋白Marker ；5 :Trx_PML融合蛋白酶切去除Trx后的纯化结果；6 酶 切并纯化后PML蛋白的免疫印迹结果。图3是本发明中的PML单克隆抗体的western-blot鉴定结果。1 :NB4细胞(人 早幼粒细胞白血病细胞系)裂解液检测；2 :HL60细胞裂解液检测。图4是用NB4细胞对本发明中PML单克隆抗体进行间接免疫荧光染色鉴定的结果。图5是用HL60细胞对本发明中PML单克隆抗体进行免疫细胞化学染色鉴定的结果。图6是本发明的实施流程。
具体实施例方式经过深入而广泛的研究，本发明已经成功构建了 PML基因，表达、纯化和鉴定了 PML蛋白，以纯化的PML蛋白免疫BALB/c小鼠，通过细胞融合技术获得杂交瘤细胞株，将杂 交瘤细胞接种至小鼠腹腔，制备腹水，从腹水中提纯抗人PML单克隆抗体。该单克隆抗体可 特异性识别人PML蛋白，可用于检测PML-RAR α融合蛋白，为急性早幼粒细胞白血病的诊断 提供帮助，并能指导其临床预后判断和治疗方案的选择。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发 明，而不用于限制本发明的范围。在不背离本发明的技术解决方案的前提下，对本发明所作 的本领域普通技术人员容易实现的任何改动都将落入本发明的权利要求范围之内。实施例1 :PML基因的构建和蛋白表达1.PML基因的扩增根据GenBank中所提供的人PML基因mRNA序列(NM_033244)，选择PML蛋白锌指 结构域中“ring finger”结构区的一段序列，设计并合成引物，上游和下游引物分别引入 BamH I和Xho I酶切位点，引物由大连宝生物公司合成。用大连宝生物公司的Catrimox-14K RNA Isolation Kit Ver. 2. 11试剂盒提取 HL60细胞的总RNA，操作过程按说明书进行，总RNA经逆转录后获得HL60细胞的cDNA，以此 cDNA 做为模板进行 PCR 反应:94°C,3min 后，94°C，30s ；55°C, 30s ；72°C，30s ；30 个循环后， 720C，IOmin, PCR产物经琼脂糖凝胶电泳观察。结果应用RT-PCR方法，成功获得了 PML基因片段，片段长度与预期一致(图1)。2. pET32a-PML表达载体的构建载体pET32a以及经琼脂糖凝胶纯化后的PML基因片段，用BamH I和Xho I双酶切 处理，酶切产物经琼脂糖凝胶纯化后连接，得到重组质粒pET32a-PML，重组质粒经双酶切鉴 定，同时由大连宝生物公司测序。将重组质粒pET32a-PML转化大肠杆菌，得到pET32a_PML 的重组克隆菌落。结果，成功获得了重组质粒pET32a_PML，酶切鉴定结果如图1所示。重组质粒的测序结果经计算机分析，表明重组的PML片段与设计序列完全一致，插入位置阅读框正确。3. Trx-PML融合蛋白的表达pET32a-PML的重组克隆菌落在含100 μ g/ml氨苄青霉素的LB培养基中培养，A_ 达到0. 5左右时，加入IPTG诱导，IPTG终浓度为0. 5mmol/L，诱导时间为3h，诱导温度为 37°C，收集菌体后取少量样品12% SDS-PAGE电泳观察。结果，pET32a_PML的重组克隆菌诱导表达产物经12% SDS-PAGE电泳确定，表达的 融合蛋白分子量约为28kD(图2)。将该融合蛋白命名为Trx-PML。4. Trx-PML融合蛋白表达形式的分析诱导后的大肠杆菌经4°C，8000rpm离心lOmin，收集菌体，PBS洗涤一次，8000rpm 离心lOmin，湿菌用PBS重悬，置于冰浴中，超声破菌，12000rpm离心20min，上清和沉淀分别 进行12% SDS-PAGE电泳。结果，12% SDS-PAGE电泳结果显示，Trx-PML融合蛋白为胞浆可溶性表达。实施例2 =PML蛋白的纯化和鉴定
1. Trx-PML融合蛋白的纯化和定量收集诱导后的大肠杆菌，PBS洗涤一次，湿菌沉淀用PBS重悬，置于冰浴中，超声 破碎，12000rpm离心20min，上清经0. 45 μ m的滤膜过滤后作为待纯化的蛋白样品。用Ni Sepharose 6Fast Flow纯化柱(购自GE公司)进行纯化，将纯化柱与Akta纯化仪连接，用 Binding Buffer (0. 02M PB,0. 5M NaCl，30mM 咪唑，pH7. 4)平衡 5 个柱体积，待纯化的蛋白 样品以lml/min速度上样，上样后用Binding Buffer洗至基线，用蛋白洗脱缓冲液(0. 02M PB, 0. 5MNaCl,200mM咪唑，pH7. 4)洗脱，收集蛋白峰，洗脱液在PBS中4°C透析过夜，取小样 12% SDS-PAGE电泳分析纯化效果。透析后的纯化蛋白用Bradford法测定蛋白浓度。结果=Trx-PML融合蛋白经Ni2+亲和纯化后，SDS-PAGE电泳显示，在分子量28kD左 右有单一条带，与预期值相符，凝胶薄层扫描显示蛋白纯度达90%以上，Bradford法测定 蛋白浓度为2mg/ml。2. Trx-PML融合蛋白的酶切与纯化按10U/mg蛋白的浓度向纯化的Trx-PML融合蛋白中加入肠激酶，37°C酶切16h，酶 切产物经M2+柱亲和纯化，收集流出液，流出液进一步纯化去除其中的肠激酶，得到高纯度 的PML蛋白，取小量样品用Tricine-SDS-PAGE电泳进行分析。结果酶切后得到高纯度的PML蛋白，分子量6kD左右(图2)，Bradford法测定蛋 白浓度为lmg/ml。3.酶切后PML蛋白的免疫印迹鉴定参照《分子克隆》中所述方法进行。电转移条件为100V电泳lh，封闭液为含5% 脱脂奶粉的TBST，一抗为商品化的鼠抗人PML的单克隆抗体，二抗为辣根过氧化物酶标记 的羊抗鼠IgG抗体，通过ECL显色系统进行免疫印迹分析。结果酶切后的PML蛋白能与鼠抗人PML的单克隆抗体发生免疫反应(图2)。实施例3 鼠抗人PML单克隆抗体的制备1.动物免疫 取酶切并纯化的PML蛋白300 μ 1(300 μ g)与等量弗氏完全佐剂充分乳化，背部皮 下多点注射BALB/c小鼠，共免疫3只小鼠，每只小鼠免疫抗原剂量为lOOyg，两周后每只小鼠以50 μ g抗原剂量加等量弗氏不完全佐剂充分乳化后背部皮下多点注射，以后隔两周免 疫一次，每只小鼠免疫剂量为50 μ g，不用佐剂，免疫途径为腹腔注射，从第二次免疫开始， 每次免疫后的第七天尾静脉采集小鼠血，间接ELISA方法检测血清效价(包被抗原为酶切 并纯化的PML蛋白)，效价达到1 5万以上后准备融合，融合前3天，尾静脉注射加强免疫 一次，抗原剂量50 μ g。2.杂交瘤细胞株的建立2. 1细胞融合免疫小鼠经摘除眼球放血后，无菌摘取小鼠的脾脏，分离脾细胞，经台盼兰染色计 数，取约1 X IO8个脾细胞，约3 X IO7个SP2/0骨髓瘤细胞，将两种细胞混合于50ml无菌离 心管中，IOOOrpm离心5min，弃上清，轻弹管底，使沉淀细胞松散成均勻糊状。于37°C水浴 中，一手轻轻转动离心管，另一手用滴管在Imin内勻速缓慢滴入Iml 50%的PEG4000 (PBS 配制)，然后依次在Imin内勻速滴入Iml RPMI-1640无血清培养基，2min内勻速滴入 2mlRPMI-1640无血清培养基，5min内勻速滴入IOml RPMI-1640无血清培养基，终止 PEG4000的作用。细胞悬液于800rpm离心8min，弃上清，用HAT选择培养轻柔重悬细胞沉 淀并混勻。将细胞悬液加入96孔细胞培养板中，100 μ 1/孔，于37°C，含5% C02的细胞培 养箱中培养。第10天换HT选择培养基，第14天换含20%胎牛血清的RPMI-1640完全培养 基。结果，细胞融合后第7天可见融合的细胞克隆，融合率达90%以上。 2. 2阳性克隆的筛选与克隆化细胞融合后2 3周，当杂交瘤细胞长至孔底面积1/5以上时，用酶切并纯化的 PML蛋白作为检测抗原，通过间接ELISA方法进行筛选，筛选出能与PML蛋白反应的杂交瘤 细胞(以与阴性血清A45tl的比值大于2. 1判为阳性)，用有限稀释法连续亚克隆3次(第1 次亚克隆用HT选择培养液，第2和第3次改用普通RPMI-1640完全培养基)，每次亚克隆 后7-10天进行筛选，直至单克隆细胞阳性孔率为100%时，挑取单克隆进行扩大培养后液 氮冻存。结果，共获得一株能稳定分泌抗人PML蛋白的杂交瘤细胞株，命名为3E3。2. 3单抗亚型的鉴定应用小鼠单克隆抗体亚型鉴定试剂盒(购自Hycult Biotechnology公司)鉴定 单抗亚型，按操作说明将杂交瘤培养上清用PBS (pH 7. 4)适当稀释，至抗体浓度1-50 μ g/ ml，加500μ 1试剂盒中提供的稀释液至含一条κ型试纸条的检测管中，再加500μ 1稀释 好的待检样品至检测管中，将试纸条完全浸入并轻轻搅动，再向检测管中加入Iml试剂盒 中提供的RAM-kappa，使试纸条打印面朝下，室温振荡30min左右，观察结果。结果，杂交瘤上清的单抗亚型均鉴定为IgG2a类，轻链亚型均为κ链。3.腹水制备与纯化弗氏不完全佐剂致敏BALB/c小鼠，500 μ 1/只。致敏一周后腹腔注射杂交瘤细胞 悬液(细胞数5X IO6 IX IO7)，7 10天后采集小鼠腹水，12000rpm，离心5min收集上 清。二氧化硅吸附法对腹水进行预处理，采用辛酸_饱和硫酸铵沉淀法进行纯化将预处 理过的腹水与醋酸缓冲液(0. 06mol/L, pH 5. 0)按体积比1 2混合，用lmol/L的HCl调 PH至4. 8 ；按每毫升混合液加11 μ 1辛酸的比例，室温搅拌下逐滴加入辛酸，于30min内加完，4°C静置2h，12000rpm离心30min，上清经125 μ m尼龙筛过滤后加入1/10体积的PBS， 用lmol/L的NaOH调pH至7. 2 ；在4°C下加入饱和硫酸铵，静置Ih ； 12000rpm离心30min, 弃上清，沉淀溶于适量PBS (含 137mmol/L NaCl, 2. 6mol/L KCl，0. 2mmol/L EDTA)中，用 500 倍以上体积的PBS，4°C透析过夜，最后12000rpm离心30min，收集上清，紫外分光光度计测 定纯化后单克隆抗体含量，0. 22 μ 1滤膜过滤后于-70°C保存。结果，紫外分光光度计测定抗体浓度为10mg/ml。实施例4 =PML单克隆抗体的鉴定1.PML单克隆抗体的间接ELISA鉴定 以酶切并纯化的PML蛋白作为检测抗原，包被酶标板，以1 2000稀释的正常小 鼠血清作为阴性对照，将纯化后的小鼠腹水倍比稀释，应用间接ELISA方法检测，以与阴性 血清的比值大于2. 1判段为阳性，计算单抗效价。结果，纯化的小鼠腹水的效价达到1 20万。2. PML单克隆抗体的Western-Blot鉴定收集HL60细胞或NB4细胞IX IO7个，将其裂解后，裂解液进行10% SDS-PAGE电 泳，参照《分子克隆》中所述的免疫印迹方法，电转移条件为100V电泳lh，封闭液为含5% 脱脂奶粉的TBST，一抗为本发明中的PML单克隆抗体(终浓度0. 5 μ g/ml)，二抗为辣根过 氧化物酶标记的羊抗鼠IgG抗体，通过ECL显色系统进行免疫印迹分析。结果本发明中的PML单克隆抗体可在HL60细胞和NB4细胞裂解液中检测到 106KD大小左右的蛋白条带，与PML-RARa融合蛋白大小相符。(图3)。3. PML单克隆抗体的间接免疫荧光染色鉴定将合适密度的NB4细胞固定在盖玻片上，-20°C下甲醇固定细胞lOmin，TBS洗三 次，每次5min ；用含0. 1 %四氢硼酸钠的TBS淬灭细胞5min，TBS洗三次，每次5min ；用含 10%正常山羊血清和BSA的PBS，常温下封闭45min，TBS洗三次，每次5min ；加入用含 1 % BSA的TBS稀释的本发明中的PML单克隆抗体(终浓度2 μ g/ml)，37°C下孵育30min， TBST洗两次，每次lOmin，再用TBS洗两次，每次5min ；加入用PBS进行1 100稀释的FITC 标记的羊抗鼠IgG，37°C下避光孵育30min，TBS洗三次，每次5min ；用含1 %多聚甲醛的PBS 固定细胞lOmin，PI染核，TBS洗三次，每次5min，在激光共聚焦显微镜下观察。结果本发明中的PML单克隆抗体可识别NB4细胞膜上的PML-RAR α融合蛋白。 (图 4)。4. PML单克隆抗体的免疫细胞化学染色鉴定将合适密度的HL60细胞固定在经赖氨酸处理的载玻片上，-20°C下甲醇固定细胞 lOmin, PBS洗三次，每次5min ；内源性过氧化物酶阻断剂，室温下孵育15min，PBS洗三次， 每次5min ；正常山羊血清室温封闭15min，PBS洗三次，每次5min ；加入用PBS稀释的本发 明中的PML单克隆抗体(终浓度4 μ g/ml)，37°C下孵育2h，PBS洗三次，每次5min ；生物素 标记的羊抗鼠二抗，37°C下孵育30min，PBS洗三次，每次5min ；链霉素抗生物素蛋白-过 氧化物酶，37°C下孵育30min，PBS洗三次，每次5min ；新鲜配制的DAB显色液，室温下显色 5min，流水缓慢清洗20min后，用梯度浓度的乙醇和二甲苯对样品进行脱水和透明，晾干后 中性树脂封片，显微镜下观察。结果本发明中的PML单克隆抗体可识别HL60细胞膜上的PML-RARa融合蛋白。(图 5)。序 列列表SEQUENCE LISTING<110>大连美亿德生物科技有限公司<120>早幼粒细胞白血病PML蛋白单克隆抗体的制备及应用<130>Chromosomal translocation t(15 ；17)in human acute promyelocyticleukemia fuses RAR alpha with a novel putative transcriptionfactor, PML.<160>2<170>PatentIn version 3. 5<210>1<211>168<212>DNA<213>Homo sapiens<400>1gaggaggagt tccagtttct gcgctgccag caatgccagg cggaagccaa gtgcccgaag 60ctgctgcctt gtctgcacac gctgtgctca ggatgcctgg aggcgtcggg catgcagtgc 120cccatctgcc aggcgccctg gcccctaggt gcagacacac ccgccctg168<210>2<211>56<212>PRT<213>Homo sapiens<300><301>Borden K. L. B.，Boddy Μ. N.，Lally J.，0' Reilly N. J.，Martin S.,Howe K. , Solomon Ε. , Freemont P. S.<302>The solution structure of the RING finger domain from the acutepromyelocytic leukaemia proto—oncoprotein PML<303>The EMBO Journal<304>14<305>7<306>1532-41<307>1995-04-03<308>NP_150241<309)2009-09-20<313>(49). . (104)<400>2Glu Glu Glu Phe Gln Phe Leu Arg Cys Gln Gln Cys Gln Ala Glu Ala151015Lys Cys Pro Lys Leu Leu Pro Cys Leu His Thr Leu Cys Ser Gly Cys
202530Leu Glu Ala Ser Gly Met Gln Cys Pro lie Cys Gln Ala Pro Trp Pro
354045Leu Gly Ala Asp Thr Pro Ala Leu505权利要求
1.一种DNA序列，其特征在于它由如下核苷酸序列组成1 gaggaggagttccagtttctgcgctgccagcaatgccaggcggaagccaagtgcccgaag 61 ctgctgccttgtctgcacacgctgtgctcaggatgcctggaggcgtcgggcatgcagtgc 121 cccatctgccaggcgccctggcccctaggtgcagacacacccgccctg 168
2.一种表达载体，其特征在于它包含权利要求1所述的DNA序列。
3.—种生物工程菌，其特征在于它包含权利要求2所述的表达载体。
4.一种蛋白质，其特征在于它是由权利要求3所述的生物工程菌在适合的条件下培养 获得的，从培养物中分离并纯化出来，且由如下氨基酸序列组成EEEFQFLR C QQCQA EAKCPKLLPCLHTL CSGCLEASGMQCP ICQAPWPLGADTPAL
5.一种单克隆抗体，其特征在于它由权利要求4所述的蛋白质免疫动物获得。
6.如权利要求5所述的单克隆抗体，其特征在于它可用于检测急性早幼粒细胞白血病 PML-RARa融合蛋白。
全文摘要
本发明公开一种可特异性识别人早幼粒细胞白血病蛋白(PML蛋白)的单克隆抗体的制备方法，属于生物基因工程和医学领域。本发明选择了PML蛋白锌指结构域中“ring finger”结构区的一段氨基酸序列，通过分子克隆的方法将其在大肠杆菌中表达。涉及从人粒细胞白血病细胞系(HL60)中，通过RT-PCR方法获得一段PML基因，将其克隆入pET32a载体中，在大肠杆菌中表达PML蛋白，将此重组蛋白经酶切和纯化后免疫BALB/c小鼠，通过细胞融合技术获得杂交瘤细胞株，将杂交瘤细胞接种至小鼠腹腔，制备腹水，从腹水中提纯抗人PML单克隆抗体。该单克隆抗体可特异性识别人PML蛋白，可用于检测PML-RARα融合蛋白，为急性早幼粒细胞白血病的诊断提供帮助，并能指导其临床预后判断和治疗方案的选择。
文档编号C12R1/19GK102041258SQ20091018780
公开日2011年5月4日 申请日期2009年10月10日 优先权日2009年10月10日
发明者吴芬芳, 王华颖, 陈立勇 申请人:大连美亿德生物科技有限公司