专利名称：剪切因子癌蛋白sf2/asf在制备白血病治疗药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及剪切因子癌蛋白SF2/ASF在制备白血病治疗药物中的应用。
背景技术：
选择性剪接是当前肿瘤学的研究热点之一，研究认为它参与了肿瘤的发生过程。SF2/ASF蛋白是一类由 SFRS1(Serine/Arginine-rich Splicing Factorl)基因编码的具有典型SR (Serine/Arginine-rich)结构特征的剪接因子,而SR蛋白家族是一类富含精氨酸和丝氨酸序列的结构域蛋白质，不仅参与前体mRNA的组成性剪接，也是选择性剪接的重要调节因子。SR蛋白可调节许多已知原癌基因及肿瘤抑制基因的选择性剪接，于转录后水平激活它们，从而导致细胞的生长和繁殖失控。Yea等报道，转录因子KLF6的异构体KLF6-SV1在肝细胞癌中明显增高，使细胞无限增殖导致肝癌的发生。此外，它们还参与一系列剪接后事件:mRNA核质运输、mRNA衰减和mRNA翻译等。SR蛋白的本质是mRNA代谢的调节因子， 一旦功能受到破坏，将导致发育障碍和疾病发生。SF2/ASF蛋白在蛋白质-蛋白质及蛋白质-RNA互作、胞内定位及运输、以及前体mRNA的选择性剪接中起重要作用。在不同组织中，SF2/ASF的表达受到严格调控，它的表达量对于细胞和机体稳定发挥生理功能具有极其重要的作用。SF2/ASF蛋白的表达量可调控原癌基因Ron的选择性剪接，并在肿瘤浸润时影响细胞的粘着和迁移性。研究发现SF2/ASF蛋白在许多肿瘤中存在过表达现象。Karni等发现，SF2在各种人类肿瘤中均表达上调，部分是由于SFRSl基因扩增所导致的表达上调的人类肺癌细胞系中恢复SF2/ASF正常表达可逆转细胞系的转化状态；在成纤维细胞中异位高表达SF2/ASF蛋白能够诱导细胞发生转化，导致裸鼠体内形成肿瘤，由此得出SF2/ASF是一个原癌蛋白。此外，SF2/ASF在 mTOR (mammalian target of rapamycin)信号通路中也起着非常重要的作用。现已明确mTOR信号通路在许多肿瘤中被激活，该通路的阻滞剂已作为临床抗癌药物进入临床II期试验。研究发现，SF2/ASF可改变mTOR信号通路的活性，并特异性激活该通路中的mTORCl分支。采用RNAi干扰技术抑制mTOR通路，可去除SF2过表达细胞的致瘤能力。此外，SF2表达上调的肿瘤对mTOR抑制剂具有很高的敏感性。白血病是儿童时期最常见的恶性肿瘤和最常见的死亡原因。我国每年新发儿童白血病I. 5万例左右,其中儿童急性淋巴细胞白血病(Acute Lymphoblastic Leukemia, ALL)是最常见的类型，占儿童白血病的75%。20世纪80年代后，由于多药联合强化疗及有力的支持治疗，儿童ALL的治愈率已达80%左右，但近30年来ALL治愈率无明显提高，主要原因是白血病的发病机理至今不明。此外，白血病复发也是重要因素之一。目前儿童白血病的复发率闻达15%左右，已成为影响白血病患儿康复的最关键因素，不仅给患儿本身、而且给家庭及社会带来了不可弥补的严重伤害和不和谐因素
发明内容
本发明的目的是提供一种剪切因子癌蛋白SF2/ASF在制备白血病治疗药物中的应用。所述剪切因子癌蛋白SF2/ASF的全长cDNA如序列表序列10所示，第210-956位为开放阅读框，编码序列表序列9所示的蛋白。本发明提供抑制或降低剪切因子癌蛋白SF2/ASF表达的可生成小干扰RNA的短发夹RNA，其核苷酸序列由一个茎环序列及两个分别位于所述茎环序列两侧的反向重复序列组成，所述两个反向重复序列分别为序列表序列I和序列表序列2所示序列；或，序列表序列3和序列表序列4所示序列。本发明还提供由所述短发夹RNA衍生的如下I)或2)的小干扰RNA I) 一条链的核苷酸序列如序列表序列I所示，另一条链的核苷酸序列如序列表序列2所示；2) 一条链的核苷酸序列如序列表序列3所示，另一条链的核苷酸序列如序列表序列4所示。 本发明还提供所述RNA (即所述短发夹RNA和所述小干扰RNA)的编码基因。所述基因是由序列表序列5和序列表序列6的单链DNA组成的双链DNA分子，或由序列表序列7和序列表序列8的单链DNA组成的双链DNA分子。本发明还提供含有所述基因的表达所述RNA (即所述短发夹RNA和所述小干扰RNA)的重组表达载体。所述重组表达载体是将所述基因插入载体pDsU6或GFP_pDsU6的多克隆位点间得到的重组载体。所述GFP_pDsU6的构建方法如下以pEGFP_Nl (购自Clontech)为模板，在引物Pl (5，-AAGGATCCATTACCGCCATGCATTAG-3’)和 P2 (5，-CCTACGCCTTAAGATACATTG-3’)的引导下PCR扩增GFP基因，扩增产物经BamH I单酶切，连入载体pDsU6的Afl II和BamH I的位点间得到的重组载体。本发明还提供含有所述RNA或所述基因的重组菌或重组细胞系。本发明还提供一种治疗和/或预防白血病的产品(或药物)，所述产品(或药物)的活性成分中含有所述RNA、基因、重组表达载体和/或重组菌；所述产品(或药物)的活性成分中还含有长春新碱和/或阿糖胞苷。本发明保护序列表序列9所示蛋白作为靶点在开发预防和/或治疗白血病产品(或药物)中的应用。本发明保护抑制序列表序列9所示蛋白表达的物质在制备预防和/或治疗白血病产品(或药物)中的应用。本发明保护任一所述的RNA、基因、重组表达载体、重组菌或重组细胞系在制备治疗和/或预防白血病产品(或药物)中的应用。所述治疗和/或预防白血病产品(或药物)具有下述a)和b)至少一种特性a)降低或抑制白血病细胞中序列表序列9所示蛋白的表达；b)提高白血病细胞早期凋亡比例。所述白血病细胞具体可为B淋巴细胞白血病细胞。实验证明，以剪接因子癌蛋白SF2/ASF的mRNA为靶点，将RNA干扰重组表达载体GFP-pDsU6-sh-l和GFP-pDsU6-sh-2转入B淋巴细胞白血病的细胞系Nalm-6中获得的白血病重组细胞，其剪接因子癌蛋白SF2/ASF表达水平明显低于对照；细胞早期凋亡比例分别为9. 4%和4. 9%，是对照的3倍和I. 5倍；经I ii g/ml化疗药物长春碱处理后，重组白血病细胞Nalm-6/GFP-pDsU6-sh-l和Nalm-6/pDsU6-sh_Luc的早期凋亡比例分别为23. 0%和17. 6% ;经50 u g/ml阿糖胞苷处理后，重组白血病细胞Nalm-6/GFP-pDsU6-sh-l和Nalm-6/pDsU6-sh-Luc的早期凋亡比例分别为50. 3%和30. 2% ;经45 u g/ml生理盐水处理后，重组白血病细胞Nalm-6/GFP-pDsU6-sh-l和Nalm-6/pDsU6-sh_Luc的早期凋亡比例分别为8. 3%和 4. 2%o本发明证明剪接因子癌蛋白SF2/ASF是一个抗凋亡因子，在ALL细胞中具有抑制细胞凋亡的作用，干扰SF2/ASF的表达可促进肿瘤细胞白血病细胞发生凋亡，并增加白血病细胞对化疗药物的敏感性。本发明为白血病治疗提供了一条新的途径，剪接因子癌蛋白SF2/ASF有望成为抗白血病治疗的一个潜在靶点，在医学领域具有十分广阔的应用前景。
图I为RNA干扰重组白血病细胞中剪接因子癌蛋白SF2/ASF的Western Blot结果。其中，上一排为以SF2/ASF单克隆抗体为一抗检测剪接因子癌蛋白SF2/ASF，下一排为以GAPDH单克隆抗体为一抗检测内参GAPDH。图2为流式细胞仪检测RNA干扰重组白血病细胞中的Annexin V(+)/PI㈠细胞比例。图3为重组白血病细胞早期凋亡比例柱形统计图。图4为流式细胞仪检测药物处理后的RNA干扰重组白血病细胞中的AnnexinV (+) /PK-)细胞比例。其中，NS为生理盐水，VCR为化疗药物长春新碱，Ara-C为化疗药物阿糖胞苷。图5为药物处理后的重组白血病细胞早期凋亡比例柱形统计图。其中，NS为生理盐水，VCR为化疗药物长春新碱，Ara-c为化疗药物阿糖胞苷。图1-5中的sh-Luc、sh-2和sh_l分别代表重组白血病细胞Nalm_6/GFP-pDsU6-sh-Luc、Nalm-6/GFP-pDsU6-sh_2 和 Nalm-6/GFP-pDsU6-sh_l。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中的实验均设置三次重复，结果取平均值。载体PDsU6和载体Luc siRNA :首都医科大学附属北京儿童医院，中国科学院遗传与发育生物学研究所；参考文献Shilai Bao, Tao Lu, Xin Wang, Huyong Zheng, Li-EWang, Qingyi Wei, Walter N Hittelman and Lei Li. Disruption of the Rad9/Radl/Husl (9 - I - I)complex leads to checkpoint signaling and replication defects.Oncogene, 2004，23，5586 - 5593.B淋巴细胞白血病的细胞系Nalm-6:首都医科大学附属北京儿童医院，中国科学院遗传与发育生物学研究所；参考文献郜慧芳；张寒；裴珮；刘怡；李志刚；姜锦；张瑞东；高超；戚豫；郑胡镛.剪接因子SF2/ASF在儿童白血病细胞中的表达.《首都医科大学学报》2009年第03期。实施例I、剪接因子癌蛋白SF2/ASF的RNA干扰重组表达载体构建URNA干扰靶序列的选择针对剪接因子癌蛋白SF2/ASF编码基因SFRSl的全长cDNA序列(如序列表序列10所示)，选择如下两段DNA序列为RNA干扰的靶序列sh-1 :序列表序列 8 的第 271-290 位(S卩 5’ -GTAACTTACCTCCAGACATC-3’ )sh-2 :序列表序列 8 的第 479-498 位(SP 5’ -AAGCGGCCGTGGAACAGGCC-3’ )序列表序列10中第210-956位为开放阅读框，编码序列表序列9所示的剪接因子癌蛋白SF2/ASF。
2、小干扰 RNA (siRNA)根据步骤I的两种靶序列，剪接因子癌蛋白SF2/ASF的两种siRNA (siRNA-1和siRNA-2)的序列如下I) siRNA-1s iRNA-1-F :5，-guaacuuaccuccagacauc-3，(序列表序列 I 所不)；s iRNA-1-R :5’ -gaugucuggagguaaguuac-3，(序列表序列 2 所不)；2) siRNA-2siRNA-2-F :5’ -aagcggccguggaacaggcc-3’(序列表序列 3 所示)；siRNA-2-R :5’ -ggccuguuccacggccgcuu-3’(序列表序列 4 所不)。3、短发夹 RNA (shRNA)根据步骤2的两种siRNA，两种shRNA (shRNA-1和shRNA_2)的序列如下(大写字母为茎环序列，其余序列为两个短的反向重复序列)shRNA-1 5， -guaacuuaccuccagacaucUUCAAGAGAgaugucuggagguaaguuac-3，；shRNA-2 5，-aagcggccguggaacaggccUUCAAGAGAggccuguuccacggccgcuu-3，。4、编码siRNA及shRNA的DNA分子的设计与合成以sh-1为靶点的表达shRNA-1的双链DNA分子的两条单链DNA序列如下SF2/ASF-s sDNA271 -1-F (序列表序列 5 所示)5， -gtaacttacctccagacatcTTCAAGAGAgatgtctggaggtaagttacTTTTTTTA-3，；SF2/ASF-s sDNA271 -1-R (序列表序列 6 所示)5’ -^^XXAAAAAAAgtaacttacctccagacatcTCTCTTGAAgatgtctggaggtaagttac-3，。以sh-2为靶点的表达shRNA-2的双链DNA分子的两条单链DNA序列如下SF2/ASF_ssDNA479_2_F (序列表序列 I 所不)5， -aagcggccgtggaacaggccTTCAAGAGAggcctgttccacggccgcttTTTTTTTA-3，；SF2/ASF-ssDNA479-2-R (序列表序列 8 所示)5，-^^XXAAAAAAAaagcggccgtggaacaggccTCTCTTGAAggcctgttccacggccgctt-3，。上述4条单链DNA由Invitrogen公司合成，下划线部分为Hind III粘性末端序列。5、剪接因子癌蛋白SF2/ASF的RNA干扰重组表达载体构建I)双链DNA反应体的获得
分别取5iig (IOng/ii I)步骤4中合成的互补的单链DNA混合，100°C热处理5分钟后，室温退火，获得两种双链DNA分子，分别取这两种双链DNA5 u g进行磷酸化处理，获得两种双链DNA反应体。上述磷酸化处理的反应体系(50ill):双链 DNA5ii g，IOXT4Kinase Buffer5u I,ATP (IOmM) 5 u I, T4 Polynucleotide Kinase (IOU/ y I) 2 y I，用 ddH20 补充至 50 y I。上述磷酸化处理的反应条件37°C水浴反应I小时，再100°C 10分钟后慢慢冷却到室温，得到可用于构建重组质粒的双链DNA反应体。2) RNA干扰重组表达载体构建取载体pDsU6先用Sac I酶切后，用T4Polymerase Klenow片段进行末端补平处理，凝胶回收的线性化片段再用Hind III酶切消化，回收pDsU6载体的骨架片段，与步骤I)获得的两种双链DNA反应体连接，得到两种RNA干扰重组表达载体pDsU6-sh-l和 pDsU6-sh-2，经测序证实，RNA干扰重组表达载体pDsU6-sh-l为载体pDsU6的多克隆位点Sac I和Hind III间插入了序列表序列5所示基因获得的重组载体；RNA干扰重组表达载体pDsU6-sh-2为载体pDsU6的多克隆位点Sac I和Hind III间插入了序列表序列7所示基因获得的重组载体。3) GFP标记的RNA干扰重组表达载体的获得将步骤2 )得到的RNA干扰重组表达载体pDsU6-sh_l和pDsU6-sh_2分别转KtoplO感受态细胞，用LB培养基(含IOOng/ill卡那霉素)小量培养，小量碱法提质粒，分别进行BamH I和Hind III双酶切，回收350bp的片段分别与经BamH I和Hind III双酶切的载体GFP-pDsU6骨架片段相连，得到两种带有GFP标签的RNA干扰重组表达载体GFP-pDsU6-sh-l 和 GFP-pDsU6-sh-2。上述载体GFP_pDsU6的构建方法如下以pEGFP_Nl (购自Clontech)为模板，在引物 Pl (5， -AAGGATCCATTACCGCCATGCATTAG-3，)和 P2 (5，-CCTACGCCTTAAGATACATTG-3，)的引导下PCR扩增GFP基因，扩增产物经BamH I单酶切，消化片段经凝胶回收；取载体pDsU6进行Afl II单酶切,用T4 Polymerase Klenow片段进行末端补平处理,凝胶回收之后线性化片段再用BamH I酶切消化，消化后片段经凝胶回收；将这两种回收片段连接，获得载体GFP-pDsU6,经测序验证正确。实施例2、RNAi基因敲除重组载体转染白血病细胞I、转染用细胞的培养转染前24h，用含有10%胎牛血清(FBS)的RPMI-1640培养基在15ml培养皿、37°C和5%C02条件下培养B淋巴细胞白血病的细胞系Nalm-6达到75% 90%时进行转染。2、转染将实施例I获得的带有GFP标签的RNA干扰重组表达载体GFP-pDsU6-sh_l和GFP-pDsU6-sh-2以及载体GFP-pDsU6-sh-Luc (RNAi阳性对照，用于沉默荧光素酶基因)分别转染步骤I培养的细胞，获得含RNA干扰重组表达载体GFP-pDsU6-sh-l的重组白血病细胞Nalm-6/GFP-pDsU6-sh-l，含RNA干扰重组表达载体GFP-pDsU6-sh_2的重组白血病细胞Nalm-6/GFP-pDsU6-sh-2和含载体GFP-pDsU6-sh_Luc的重组白血病细胞Nalm-6/GFP-pDsU6-sh_Luc。上述载体GFP-pDsU6-sh_Luc的构建方法如下取载体Luc siRNA进行BamH I和Hind III双酶切，回收小片段DNA，与经BamH I和Hind III双酶切的载体GFP_pDsU6的骨架片段相连，获得重组载体GFP-pDsU6-sh-Luc。上述转染的具体方法如下计数步骤I培养的Nalm-6细胞密度，取含2 X IO6个细胞的培养液，90g离心5分钟，弃培养基，采用IOOii I电转液(Nucleofector Solution, Lonza)重悬细胞；转移细胞悬液至L 5ml Eppendorf管，加入2 y g DNA质粒，指腹轻弹充分混合；将细胞/DNA混悬液转移至电转杯中，避免气泡，盖上杯盖；将电转杯放置于电转仪的电转座(NucleofectorDevice, Lonza)上,选择电转程序C_005(专适用于Nalm_6细胞系);取2ml预热的RPMI-1640培养基(10%FBS)与电转杯中的细胞悬液混合，转移到细胞培养皿中，避免对细胞悬液进行反复抽吸；转染的细胞放置培养箱中，37°C，5%C02细胞培养箱中继续培养，用于下述实施例 的检测和实验。实施例3、Western Blot检测重组白血病细胞中剪接因子癌蛋白SF2/ASF的表达
取实施例2中转染72h后的三种重组白血病细胞Nalm-6/GFP-pDsU6-sh-l、Nalm-6/GFP-pDsU6-sh-2 和 Nalm-6/GFP-pDsU6-sh_Luc，分别提取总蛋白，以 GAPDH (甘油醛-3-磷酸脱氢酶)为内参，进行Western blot检测，检测剪接因子癌蛋白SF2/ASF的一抗为SF2/ASF(分子量34KDa)单克隆抗体(购自Santa Cruz公司)，检测内参GAPDH的一抗为GAPDH单克隆抗体(购自中国上海康城公司)，结果如图I所示，结果表明含RNA干扰重组表达载体GFP-pDsU6-sh-l的重组白血病细胞Nalm-6/GFP-pDsU6-sh-l和含RNA干扰重组表达载体GFP-pDsU6-sh-2的重组白血病细胞Nalm-6/GFP-pDsU6-sh-2中，剪接因子癌蛋白SF2/ASF表达水平明显低于对照含载体GFP-pDsU6-sh-Luc的重组白血病细胞Nalm-6/GFP-pDsU6-sh-Luc。上述提取总蛋白的具体方法如下90g离心5分钟收集重组白血病细胞，用预冷的PBS洗两遍，加150 300iU RIPA缓冲液[20mM Tris pH7. 5,50mM NaCl,2mM Na3VO4, IOmM NaF, ImM EDTA, 0. l%TritonX-100和蛋白酶抑制剂(Roche)]，冰上裂解30min，收集细胞。8V电压超声10秒X 2次，间隔40秒；4°C, 12000rpm离心30min ;吸取上清,利用Brandford法进行蛋白定量；各取20 y g总蛋白进行Western blot检测。上述Western blot检测的具体方法如下I)电泳及转膜对待测蛋白样品进行SDS-PAGE电泳，先在电压80V下电泳10_30分钟，待染料前沿进入分离胶后，将电压提高到160V继续电泳约I小时，直至溴酚蓝到达分离胶的底部。电泳结束后，用电转移法将分离的蛋白样品转移至硝酸纤维素膜(NC膜)，400mA (100V)，I 小时(或 350mA (95V)，I. 5 小时)。2)封闭膜用 TBS-T 溶液洗(Nacl8. Og,20mlIM Tris-Hcl, Tween_202ml，加蒸馏水950ml，标定PH值至7. 6，再定容至1L)NC膜10-15分钟。将NC膜放入含5%脱脂奶粉的TBS-T溶液中，室温封闭I小时(或4°C 12-24小时)。3)免疫杂交A、一抗孵育将SF2/ASF(分子量34KDa)单克隆抗体(或GAPDH单克隆抗体)按I: (2000-3000)稀释于含5%脱脂奶粉的TBS-T溶液中，室温下与NC膜在脱色摇床上一起孵育约I小时(40分钟至I小时20分钟)，用TBS-T溶液50mL洗NC膜10分钟，
重复3次。
B、二抗孵育将结合辣根过氧化物酶的羊抗兔IgG抗体(或结合辣根过氧化物酶羊抗鼠IgG抗体)按I: (3000-5000)稀释在含5%脱脂奶粉的TBS-T溶液中，室温下与NC膜在脱色摇床上一起孵育约45分钟(40分钟至I小时20分钟)，用TBS-T溶液50mL洗NC膜10分钟，重复3次。4)ECL试剂显色使用ECL蛋白杂交检测试剂盒(瑞典Amersham公司),参照操作说明进行NC膜显色反应。实施例4、重组白血病细胞的凋亡检测取实施例2中转染72h后的三种重组白血病细胞Nalm-6/GFP-pDsU6-sh-l、Nalm-6/GFP-pDsU6-sh-2和Nalm-6/GFP-pDsU6-sh_Luc，分别用流式细胞仪对细胞凋亡百分比进行统计分析，结果如图2和图3所示。结果表明重组白血病细胞Nalm-6/GFP-pDsU6-sh-l、Nalm-6/GFP-pDsU6-sh-2 和对照(重组白血病细胞Nalm-6/GFP-pDsU6-sh-Luc)的细胞早期凋亡比例分别为9. 4%、4. 9% 和3. 0%，说明RNA干扰重组表达载体GFP-pDsU6-sh-l和GFP-pDsU6-sh_2均能有效降低/抑制SF2/ASF在细胞中的表达，其中GFP-pDsU6-sh-l的干扰效果较好。上述流式细胞仪统计细胞凋亡百分比的具体方法如下300g离心5分钟收集重组白血病细胞，用预冷的PBS洗两遍，使用AnnexinV-APC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒(购自美国BD公司，BD Pharmingen 556547)标记细胞。采用流式细胞仪(美国BD公司，FACSAria II)收集10000个GFP阳性的细胞，对细胞的凋亡百分比进行统计分析，观察白血病细胞系在凋亡方面的变化特点。实施例5、化疗药物处理过的重组白血病细胞的凋亡检测取实施例2中转染48小时后的重组白血病细胞Nalm-6/GFP-pDsU6-sh-l和Nalm-6/GFP-pDsU6-sh-Luc，分别加入临床上常用的急性淋巴细胞白血病(ALL)化疗药物长春新碱(VCR) Iii g/ml和阿糖胞苷(Ara-c) 50 ii g/ml及生理盐水(NS) 45 y g/ml，72小时后收获细胞，采用流式细胞仪对细胞进行凋亡检测，方法同实施例4，结果如图4和图5所示。结果表明经VCR和Ara-c药物处理后，重组白血病细胞Nalm-6/GFP-pDsU6-sh-l和Nalm-6/GFP-pDsU6-sh-Luc的早期凋亡比例明显增加。经VCR处理后，重组白血病细胞 Nalm-6/GFP-pDsU6-sh-l 和 Nalm-6/GFP-pDsU6-sh_Luc 的早期凋亡比例分别为23. 0% 和 17. 6% ；经 Ara-c 处理后，重组白血病细胞 Nalm-6/GFP-pDsU6-sh_l 和 Nalm-6/GFP-pDsU6-sh-Luc的早期凋亡比例分别为50. 3%和30. 2% ;经NS处理后，重组白血病细胞Nalm-6/GFP-pDsU6-sh-l 和 Nalm-6/pDsU6-sh_Luc 的早期凋亡比例分别为 8. 3% 和 4. 2%。实施例3-5证明，剪接因子癌蛋白SF2/ASF是一个抗凋亡因子，在ALL细胞中具有抑制细胞凋亡的作用，干扰SF2/ASF的表达可促进肿瘤细胞——白血病细胞发生凋亡,并增加白血病细胞对化疗药物的敏感性。
权利要求
1.短发夹RNA，其核苷酸序列由一个茎环序列及两个分别位于所述茎环序列两侧的反向重复序列组成，所述两个反向重复序列分别为序列表序列I和序列表序列2所示序列；或，序列表序列3和序列表序列4所示序列。
2.由权利要求I所述短发夹RNA衍生的如下I)或2)的小干扰RNA 1)一条链的核苷酸序列如序列表序列I所示，另一条链的核苷酸序列如序列表序列2所示； 2)一条链的核苷酸序列如序列表序列3所示，另一条链的核苷酸序列如序列表序列4所示。
3.权利要求I或2所述RNA的编码基因；所述基因具体为由序列表序列5和序列表序列6的单链DNA组成的双链DNA分子，或由序列表序列7和序列表序列8的单链DNA组成的双链DNA分子。
4.含有权利要求3所述基因的表达权利要求I或2所述RNA的重组表达载体；所述重组表达载体具体是将权利要求3或4所述基因插入载体pDsU6或GFP-pDsU6的多克隆位点间得到的重组载体。
5.含有权利要求1-4任一所述RNA、基因或重组表达载体的重组菌或重组细胞系。
6.一种治疗和/或预防白血病的产品，其特征在于所述产品的活性成分中含有权利要求1-5中任一所述的RNA、基因、重组表达载体和/或重组菌。
7.根据权利要求6所述的产品，其特征在于所述产品的活性成分中含有长春新碱和/或阿糖胞苷。
8.序列表序列9所示蛋白作为靶点在开发预防和/或治疗白血病产品中的应用。
9.抑制序列表序列9所不蛋白表达的物质在制备预防和/或治疗白血病广品中的应用。
10.权利要求1-5中任一所述的RNA、基因、重组表达载体、重组菌或重组细胞系在制备治疗和/或预防白血病产品中的应用。
全文摘要
本发明公开了剪切因子癌蛋白SF2/ASF在制备白血病治疗药物中的应用。本发明还提供抑制剪切因子癌蛋白SF2/ASF表达的小干扰RNA及其编码基因和载体。实验证明，利用RNA干扰技术抑制白血病细胞中序列表序列9所示剪切因子癌蛋白SF2/ASF的表达，可明显提高白血病细胞的早期凋亡比例。本发明为白血病治疗提供了一个新的靶点，在医学领域具有十分广阔的应用前景。
文档编号A61K48/00GK102747083SQ20121022942
公开日2012年10月24日 申请日期2012年7月3日 优先权日2012年7月3日
发明者张寒, 杜超豪, 邹丽敏, 郑胡镛, 郜慧芳, 鲍时来 申请人:中国科学院遗传与发育生物学研究所, 首都医科大学附属北京儿童医院