监控干细胞的分化状态的方法

专利名称：监控干细胞的分化状态的方法
技术领域：
本发明涉及监控干细胞的分化状态的方法。
背景技术：
在再生医疗领域中，期待通过使用了干细胞的细胞移植、脏器再生来治疗疑难病症。虽然提前实行了心脏疾病等的临床应用，但是关于实际上所移植的干细胞如何发挥功能，不清楚的地方还很多。为了进行安全的移植，必须解明干细胞的分化诱导(向具有某种特定功能的细胞诱导)的机理和确定控制细胞内动态及功能的因子。迄今为止，已知干细胞以分子水平表达了与未分化细胞高度特异的若干转录因子。它们包括Oct-4、Sox、Nanog、白血病抑制因子受体(LIF-R)。0ct_4在原肠未形成胚、 早期卵裂胚、盘状囊胚的内细胞团的细胞和胚性癌(EC)细胞中表达。成体动物中，仅在生殖细胞中发现Oct-4。在ES细胞、iPS细胞等干细胞实验中，通过与饲养细胞的共培养、LIF添加而维持了多能性，但是由于环境或细胞的状态会失去多潜能，有时容易分化。在谋求分化诱导过程的理解方面，正确地获知未分化状态(具有多能性的状态)、分化状态很重要，但是难以仅通过ES细胞的形态来判断分化状态。作为判断多能性的指标，进行了碱性磷酸酶染色、使用了针对分化标记物的特异抗体的免疫染色，但两种方法均固定了细胞，因而无法持续调查细胞的状态。干细胞研究还被期待应用于移植治疗等再生医疗领域，希望以使干细胞存活的状态进行经时状态变化的观察。若以使细胞存活的状态进行观察，还能够将作为实验目的的干细胞或经分化诱导的细胞分离出。从基础研究的观点来看，关于干细胞的未分化状态维持机理或伴随分化的标记基因表达量变化，也有许多不清楚的地方，为了解明分化诱导机理，也需要以存活的干细胞为对象进行研究。为了以使细胞存活的状态调查分化诱导状态，通过进行以GFP为指标的报道基因检测来进行分化标记物的表达量的观察(专利文献I)。现有技术文献专利文献专利文献I :日本特开2008-118991号公报专利文献2 :日本特表2009-523025号公报

发明内容
发明所要解决的课题本发明人着眼干在一定期间对干细胞的分化状态进行监控时，若利用专利文献1(日本特开2008-118991号公报)的方法，则存在以下所说明的问题。S卩，如专利文献I那样将GFP等荧光蛋白基因作为报道基因时，由于激发光照射所产生的噪音多，因而有时难以对基因表达量进行定量。因此，以GFP为指标的荧光观察多被用作确定基因有无表达的方法。此外，在将GFP作为指标时，由于在观察时照射激发光，因而对于几天 几周的长期观察，也考虑存在对细胞产生损伤的影响。此外，专利文献I中，为了干细胞分离而使用了流式细胞仪，但关于干细胞中的基因表达水平，认为表达在细胞周期的阶段发生变化，因而在将干细胞(或来自干细胞的集落)単一化后进行检测的流式细胞仪检测的情况下，也有可能无法选择目标干细胞。这样，由于照射激发光，利用以GFP为指标的报道基因检测来调查细胞的分化状态的方法在定量性和长期观察方面存在问题。另ー方面，作为不照射激发光而检测细胞内基因表达量的方法，进行了以荧光素酶基因等发光蛋白基因作为报道基因的检测。荧光素酶利用与荧光素的酶-底物反应而发光，因此不需要导入激发光，能够长时间观察。但是，如专利文献2 (日本特表2009-523025号公报)所述，使用荧光素酶检测基因表达变化时通常使用基于光度计的光子计数检测来进行，该检测中，为了检测整个培养皿的细胞群的总和，在以生物体内被认为是异源细胞群的干细胞(或来自干细胞的集落)为对象的情况下，无法检测各个干细胞的基因表达的变 化。另外，来自干细胞的集落是多样的细胞的三维集合体，以该三维的集合体的状态难以把握细胞的基因表达量。另外，来自干细胞的集落中，各干细胞、每个集落的特性不同，在以往进行的以培养皿的细胞群整体为对象进行观察的方法中，具有难以正确分析各干细胞、每个集落的问题。着眼于上述问题，本发明的目的在于提供ー种不对细胞造成损伤、而针对各细胞或各集落监控干细胞的分化状态的方法。用于解决课题的方案本发明人通过在干细胞中导入分化状态检测标记基因的启动子区域与发光蛋白基因(荧光素酶基因)的融合基因，并在一定期间对干细胞中发光蛋白基因(荧光素酶基因)的表达所产生的发光图像进行拍摄，从而达到了上述目的，完成了本发明。即，本发明提供下述技术方案。[I] 一种监控干细胞的分化状态的方法，其特征在于，其包括以下エ序(A-I)对导入有分化状态检测标记基因的启动子区域与发光蛋白基因的融合基因的干细胞进行培养的エ序；(A-2)对于所述(A-I)的エ序后的干细胞，在诱导分化的条件下进行培养的エ序；和(A-3)在所述(A-I) (A-2)的エ序的至少一定期间，对干细胞中由发光蛋白基因的表达所产生的发光图像进行拍摄的エ序。[2] 一种监控干细胞的分化状态的方法，其特征在于，其包括以下エ序(B-I)对导入有分化状态检测标记基因的启动子区域与发光蛋白基因的融合基因的干细胞进行培养的エ序；(B-2)进ー步对干细胞进行继代培养的エ序；(B-3)对于所述(B-2)的エ序后的干细胞，在诱导分化的条件下进行培养的エ序；和(B-4)在所述(B-I) (B-3)的エ序的至少一定期间，对干细胞中由发光蛋白基因的表达所产生的发光图像进行拍摄的エ序。
[3] 一种监控干细胞的分化状态的方法，其特征在于，其包括以下エ序(C-I)对导入有分化状态检测标记基因的启动子区域与发光蛋白基因的融合基因的干细胞进行培养的エ序；(C-2)进ー步对干细胞进行继代培养的エ序；和(C-3)在所述(C-I) (C-2)的エ序的至少一定期间，对干细胞中由发光蛋白基因的表达所产生的发光图像进行拍摄的エ序。[4]如上述[I] [3]中任一项所述的方法，其特征在于，所述拍摄エ序是通过发光成像系统持续拍摄两个以上的发光图像的エ序。[5]如上述[4]所述的方法，其特征在于，其还包括以下エ序
在通过所述拍摄エ序得到的发光图像的特定细胞区域，作为分化状态的指标，测定发光量，分析发光量的经时变化。[6]如上述[I] [5]中任一项所述的方法，其特征在于，其还包括以下エ序进行干细胞的明视野观察，在与发光图像相同的区域获得明视野图像。[7]如上述[I] [6]中任一项所述的方法,其特征在于，分化状态检测标记基因是细胞在未分化的状态下特异表达的未分化标记基因和/或细胞在特定的分化过程中特异表达的分化标记基因。[8]如上述[I] [7]中任一项所述的方法，其特征在于，干细胞是导入了两种以上的融合基因的干细胞，融合基因分别包含不同种类的分化状态检测标记基因的启动子区域，分化状态检测标记基因的启动子区域分别与编码具有不同的发光波长的发光蛋白的基因融合，使得其与其他分化状态检测标记基因的启动子区域相区别地被检测出。[9]如上述[8]所述的方法，其特征在干，干细胞是导入了两种融合基因的干细胞，ー种融合基因是未分化标记基因的启动子区域与第一发光蛋白基因的融合基因，另ー种融合基因是在特定的分化过程中特异表达的分化标记基因的启动子区域与第二种发光蛋白基因的融合基因，所述第二种发光蛋白基因的表达与所述第一发光蛋白基因的表达相区别地被检测出。[10] 一种确定干细胞的分化状态的方法，其特征在于，其包括以下エ序基于利用上述[I] [9]中任一项所述的方法得到的发光图像和/或发光量数据和/或明视野图像，确定干细胞的分化状态。[11] ー种获得显示所期望的分化状态的干细胞的方法，其特征在于，其包括以下
ェ序基于利用上述[6]所述的方法得到的发光图像和/或发光量数据和/或明视野图像，由多个干细胞中获得显示所期望的分化状态的干细胞。[12]如上述[I] [11]中任一项所述的方法，其特征在于，所述发光图像表示集落内的各个干细胞的基因表达量。[13]如上述[12]所述的方法，其中，所述集落形成了拟胚体。发明效果根据本发明的方法，通过在干细胞中导入分化状态检测标记基因的启动子区域与发光蛋白基因(荧光素酶基因)的融合基因，并在一定期间对干细胞中的发光蛋白基因(荧光素酶基因)的表达所产生的发光图像进行拍摄，从而能够在不对细胞造成损伤的情况下对各细胞或各集落监控干细胞的分化状态。


图I是示出本发明的方法的一例的说明图。图2是悬滴法的示意图。图3是示出发光成像系统的一例的图。图4是示出本发明的实施例1-1 (刚观察后)的结果的显微镜照片。图5是示出本发明的实施例1-1 (观察21小时后)的结果的显微镜照片。图6是示出本发明的实施例1-1的结果的曲线图。图7是示出本发明的实施例1_2(添加LIF)的结果的显微镜照片。图8是示出本发明的实施例1_2(添加LIF)中的细胞选择区域的显微镜照片。图9是示出本发明的实施例1_2(添加LIF)的结果的曲线图。图10是示出本发明的实施例1-2 (未添加LIF)中的细胞选择区域的显微镜照片。图11是示出本发明的实施例1_2(未添加LIF)的结果的曲线图。图12是示出本发明的实施例1-3中的细胞选择区域的显微镜照片。图13是示出本发明的实施例1-3的结果的曲线图。图14是示出本发明的实施例2-1的结果的显微镜照片。图15是示意性示出拟胚体(EB)形成的状况的图。图16是示出本发明的实施例2-2的结果的显微镜照片。
具体实施例方式下面详细说明本发明，但下述说明的目的在于说明本发明，并不是要限定本发明。在ー个方式中，本发明的监控干细胞的分化状态的方法包括以下エ序(A-I)对导入有分化状态检测标记基因的启动子区域与荧光素酶基因的融合基因的干细胞进行培养的エ序；(A-2)对于所述(A-I)的エ序后的干细胞，在诱导分化的条件下进行培养的エ序；(A-3)在所述(A-I) (A-2)的エ序的至少一定期间，对干细胞中由荧光素酶基因的表达所产生的发光图像进行拍摄的エ序。该方式中，能够对经分化诱导处理的干细胞的分化状态进行监控。在其他方式中，本发明的方法还包括以下エ序在上述(A-I)的培养エ序后，对干细胞进行继代培养。即，该方式中，本发明的监控干细胞的分化状态的方法包括以下エ序(B-I)对导入有分化状态检测标记基因的启动子区域与荧光素酶基因的融合基因的干细胞进行培养的エ序；(B-2)进ー步对干细胞进行继代培养的エ序；(B-3)对于所述(B-2)的エ序后的干细胞，在诱导分化的条件下进行培养的エ序；(B-4)在所述(B-I) (B-3)的エ序的至少一定期间，对干细胞中由荧光素酶基因的表达所产生的发光图像进行拍摄的エ序。
该方式中，能够监控继代培养期间干细胞的分化状态，以及能够监控经分化诱导处理的干细胞的分化状态。将该方式示意性地示于图I。如图I所示，若在抑制分化的条件下对用于分化状态监控而制成的干细胞进行培养，则其大部分具有分化多能性，表达未分化标记基因(Nanog基因)(參照图I的分化诱导前的培养皿)。该干细胞通过进行长时间的培养而有时与分化的干细胞混杂，由此，分化多能性产生偏差，出现未分化标记基因(Nanog基因)的表达减少或消失的细胞(參照图I的细胞继代后的培养皿)。其后，若对干细胞实施分化诱导处理并进行培养，则若干干细胞被分化诱导，表达特异的分化标记基因(參照图I的分化诱导后的培养皿)。这样，本发明中，使用不同的荧光素酶检测未分化标记基因或分化标记基因的表达，针对各细胞或各集落监控干细胞的分化状态。在另ー个方式中，本发明的方法还包括在上述(A-I)的培养エ序后对干细胞进行 继代培养的エ序，不包括(A-2)的诱导分化的エ序。即，该方式中，本发明的监控干细胞的分化状态的方法包括以下エ序(C-I)对导入有分化状态检测标记基因的启动子区域与荧光素酶基因的融合基因的干细胞进行培养的エ序；(C-2)进ー步对干细胞进行继代培养的エ序；(C-3)在所述(C-I) (C-2)的エ序的至少一定期间，对干细胞中由荧光素酶基因的表达所产生的发光图像进行拍摄的エ序。该方式中，能够对继代培养期间干细胞的分化状态进行监控。本发明中，“干细胞”是来自哺乳类(例如人、小鼠等)的任意的干细胞，例如为胚胎干细胞(ES细胞)、组织性干细胞、人工多能干细胞(iPS细胞)等。干细胞可以使用市售的细胞，也可以根据公知的方法制备。本发明中，“对分化状态进行监控”是指对干细胞为未分化的状态、还是分化了何种程度的状态进行监控的意思。本发明中，“分化状态”包括未分化的细胞的状态也分化后的细胞的状态。本发明中，“分化状态检测标记基因”包括细胞在未分化的状态下特异表达的“未分化标记基因”和细胞在特定的分化过程中特异表达的“分化标记基因”。本发明的方法中，作为“分化状态检测标记基因”，可以使用未分化标记基因或分化标记基因中的任意一者，也可以使用两者。另外，“分化状态检测标记基因”可以使用ー种，也可以使用两种以上(例如2种 5种)。例如，本发明中，可以使用两种以上(例如2种或3种)的未分化标记基因，也可以使用I种未分化标记基因和I种分化标记基因，还可以使用I种未分化标记基因和两种以上(例如2种或3种)的分化标记基因。“未分化标记基因”是细胞在未分化的状态下特异表达的任意的基因，可以举出例如NanOg、0ct、SOX等。另外，“分化标记基因”是细胞在特定的分化过程中特异表达的任意的基因，例如作为神经分化标记基因，可以举出Nestin、MashI，作为心肌分化标记基因，可以举出 GATA4、Nkx2. 5。下面，对本发明的方法的各エ序进行说明。在以下的说明中，“分化状态检测标记基因”也简称为“标记基因”。
I.监控用干细胞的制备本发明中，根据公知技木，将标记基因的启动子区域与荧光素酶基因(报道基因)融合，在干细胞中导入该融合基因，从而制备出监控用干细胞。“标记基因的启动子区域”可以使用公知的启动子区域，也可以基于公知的标记基因的碱基序列进行克隆。例如，Nanog的启动子区域记载于T Kuroda etal. , Molecular and Cellular Biology (2005 vol. 25, No. 6 p2475_2485) ; Oct 的启动子区域记载于 SOkumura-Nakanishi et al. , The journal of Biological Chemistry (2005vol. 280，No7p5307_5317) ;Nestin 的启动子区域记载于 L Cheng et al. , FEBS Letters2004 565ρ195-202。“荧光素酶基因”可以使用市售的基因，可以使用例如Eluc荧光素酶(绿)XRB荧光素酶(红)、海肾荧光素酶(蓝)。若使用预先插入于载体内的形态的荧光素酶基因，则从制备融合基因的方面来看是方便的。例如，作为预先含有荧光素酶基因的市售的载体，可以举出 Eluc 载体(东洋纺)、CRB 载体(Promega)、Renilla 载体(Promega)。 此处，列举使用荧光素酶基因作为报道基因时的例子对本发明进行说明，但本发明不限定于此，可以使用该技术领域中公知的任意的“发光蛋白基因(luminescentprotein-coding gene) ”作为报道基因。本说明书中，“发光蛋白基因”与绿色荧光蛋白(GFP)基因等荧光蛋白基因对比使用，尤其是编码生物发光蛋白的基因，例如该技术领域中公知的各种荧光素酶基因。在使用两种以上标记基因的情况下，使用两种以上的荧光素酶基因，各标记基因分别与不同的荧光素酶基因融合从而被识别检测出。即，标记基因的启动子区域分别与具有不同的发光波长的荧光素酶融合，使得其与其他标记基因的启动子区域相区别地被检测出。例如，对使用两种“未分化标记基因” Oct-4基因和Nanog基因作为标记基因的情况进行说明。首先，使用已经在论文中公开的基因序列，对这些未分化标记基因的启动子区域进行克隆。S卩，关于 Oct-4 基因，以 “S Okumura-Nakanishi et al. , The journalof Biological Chemistry 2005 vol. 280, No7 p5307_5317” 为參考来获得启动子特异性序列；关于 Nanog 基因，以 “T Kuroda et al. , Molecular and Cellular Biology 2005vol. 25，No. 6p2475-2485”为參考来获得启动子特异性序列。将所获得的Nanog、0ct-4基因启动子序列分别插入ELuc载体(东洋纺)、CBR载体(Promega)。Eluc载体是含有Eluc突光素酶(緑)的载体，CBR载体是含有CRB荧光素酶(红)的载体。由此，通过向这些载体插入Nanog、0ct-4基因启动子序列,制作未分化标记物表达特异性发光载体pNanog-Eluc、p0ct4_CBR。将含有融合基因的载体向干细胞中导入时可以根据公知的方法进行，例如，可以通过磷酸钙法、脂质体法、电穿孔法进行。这些方法可以根据目的和细胞的种类而分别使用。2.培养エ序本发明中，对根据上述方法制备的监控用干细胞、即“导入有分化状态检测标记基因的启动子区域与荧光素酶基因的融合基因的干细胞”进行培养。可以利用公知的方法，根据干细胞的种类将所需要的分化抑制因子添加到培养基中，在饲养细胞上进行培养。优选在抑制分化的条件下培养干细胞。例如小鼠ES细胞的培养可以如下进行利用直径35_的细胞培养用培养皿，在含有分化抑制因子LIF (白血病抑制因子)的DMEM培养基中，在作为饲养细胞的小鼠胚胎成纤维细胞上进行培养。干细胞例如在37. (TC培养I天 3天。上述培养后的干细胞可以继续进行继代培养，也可以转移到分化诱导エ序。继代培养可以在与上述培养相同的条件下进行。通常，干细胞容易自发性分化，因而在进行继代培养时，需要注意培养条件。例如，可以在含有分化抑制因子的培养基中进行继代培养，观察未分化标记物的表达的变化，确定未分化细胞；或者，也可以在不含有分化抑制因子的培养基中进行继代培养，观察未分化标记物和/或分化标记物的表达的变化，确定未分化细胞和/或分化细胞。3.分化诱导エ序干细胞的分化诱导可以如下进行利用公知的方法，根据干细胞的种类、分化的方向性，在诱导分化的条件下培养干细胞，从而进行干细胞的分化诱导。 诱导分化的条件下可以为积极地诱导干细胞的分化的条件下，也可以为抑制干细胞的自发性分化的条件下(不存在分化抑制因子的条件下)。干细胞的分化诱导法可以举出利用物理刺激的方法、利用药物刺激的方法、利用分化诱导因子的导入的方法等。作为利用物理刺激的方法，可以举出例如悬滴法、振荡培养。另外，作为利用药物刺激的方法，例如为了分化诱导为神经系统细胞，可以举出向培养基中添加视黄酸(Retinoic acid)的方法；为了分化诱导为心肌细胞，可以举出添加拟胚体形成后的BMP-2和Wnt-Il的方法。S卩，关于干细胞的分化诱导，可以使用悬滴法等，从干细胞经过拟胚体创造出分化细胞；或者，也可以从干细胞直接创造出分化细胞而不经过拟胚体。将悬滴法的示意图示于图2。悬滴法中，如图2所示，在以水滴状滴落到塑料培养皿盖等基板上的培养液(液滴)中培养干细胞。即，将导入有对象标记基因的启动子的发光载体导入细胞，接种到细胞培养用的塑料培养皿盖，形成液滴。在进行了液滴形成后，根据本发明，使用发光显微镜进行2天的连续观察。可以利用发光显微镜经时地观察単一的干细胞凝聚并形成拟胚体的过程。另外，根据需要，若在导入有标记基因的启动子的发光载体中预先导入抗生物质的耐性基因，则能够在回收必要的拟胚体后通过进ー步进行药物选择来得到目标细胞。已知ES细胞的分化不仅与细胞特性有关，还与细胞间的相互关系有夫。还认为各种细胞的分化效率被拟胚体的性质所影响。由于拟胚体的性质因液滴的大小、所接种的细胞数而改变，因而观察拟胚体的形成过程很重要，但现状是未进行拟胚体形成过程的成像检测。已知在拟胚体形成中有在滲透干细胞的状态下进行培养的方法。4.拍摄エ序对在培养容器中所培养的干细胞的发光图像进行拍摄时，在含有干细胞的培养基中添加作为底物的荧光素，开始发光观察。荧光素的添加也可以伴随ATP、镁等的添加。本发明中，在上述培养エ序和分化诱导エ序的至少一定期间，对干细胞中由荧光素酶基因的表达所产生的发光图像进行拍摄。该拍摄エ序可以通过发光成像进行。优选通过发光成像持续拍摄发光图像。发光成像可以使用市售的发光成像系统、例如奥林巴斯制造的发光成像系统LV200来进行。
參照图3，对发光成像系统的一例进行说明。在图3所示的发光成像系统100中，含有干细胞的标本110配置于载物台104上的培养器103内。标本110通常放入培养皿中，载物台104和培养器103开有观察用的孔(未图示)。在发光观察的情况下，标本110发出的光在物镜光学系统105中前迸，不需要的光被分光滤波器106所截断，在CCD照相机107中被检测出。在CCD照相机107中被检测出的光被送至控制器PClll而图像化。需要说明的是，在単色的发光观察的情况下，也可以不配置分光滤波器106。光源109照射用于明视野观察的照明光。分光滤波器108在仅透过特定波长的光时(荧光观察)使用，在明视野观察时不使用。控制器PClll是一般的PC等计算机，其对CXD照相机107的摄影条件进行控制；进行所获图像的图像化和显示以及光源109的光量的控制等。并且，控制器PClll进行图像处理和图像分析，还能够与观察条件一起预先保持图像分析数据。 将这些装置的一部分或全部配置于遮断来自外部的光的腔等遮光装置内，从而能够以良好的精度稳定地检测微弱光而不受外部的光的影响。例如，如图3所示，可以以标本110被暗箱102和盖101遮光的状态来放置。发光成像系统的光学系统可以參照国际公开W02006-106882。本发明中，持续拍摄发光图像可以是连续拍摄发光图像，也可以是以预定的间隔(例如，5分钟 I小时的间隔)拍摄发光图像。利用两种以上荧光素酶基因识别标记两种以上标记基因的情况下，如后述的实施例2所述，使用分光滤波器(參照图3的滤波器106)，以特异的各波长对各荧光素酶进行拍摄。发光图像的观察可以与明视野图像的观察组合进行(參照图4和图5)。S卩，通过在与获得发光图像的区域相同的区域获得明视野图像，从而能够观察标记基因的表达状况和细胞分化所引起的细胞的形态变化(例如通过向神经系统细胞的分化所引起的细胞的形态变化)的状況。此外，在通过拍摄エ序得到的发光图像的特定细胞区域中，作为分化状态的指标，可以测定发光量，分析发光量的经时变化(參照图6)。基于所得到的发光图像和/或发光量数据和/或明视野图像，能够确定干细胞的分化状态。优选能够基于发光图像的经时变化和/或发光量的经时变化来确定干细胞的分化状态。或者优选能够基于与发光量的经时变化有关的数据来确定干细胞的分化状态。另外，基于所得到的发光图像和/或发光量数据和/或明视野图像，能够由多个干细胞中获得显示所期望的分化状态的干细胞。优选能够基于发光图像的经时变化和/或发光量的经时变化来获得显示所期望的分化状态的干细胞。或者优选能够基于与发光量的经时变化有关的数据来获得显示所期望的分化状态的干细胞。例如，根据发光图像和/或发光量数据，在含有测定对象细胞的感兴趣区域(R0I Region Of Interest)中，未分化标记物的表达量维持恒定的情况下,可知测定对象的细胞以未分化的状态维持。另ー方面，根据发光图像和/或发光量数据，在观察到未分化标记物的表达量降低的情况下，可知测定对象的细胞由未分化的状态发生了变化。该情况下，通过合用未分化标记物和分化标记物，对未分化标记物的表达量降低和分化标记物的表达量增大这两者进行观察，即使在细胞未出现形态变化的阶段，也可知晓测定对象的细胞朝向分化的方向。关于用于获得所期望的干细胞的拾取操作，可以在获得发光图像的发光显微镜下进行，也可以将样品移动至正置显微镜而进行。另外，本发明中可以进行各种变更而不限定于上述例子。例如，在上述说明中对拾取操作进行了说明，但本发明中也可以应用包括在容器等中分离所期望的细胞或细胞内部位等其他操作的各种细胞操作。并且，在上述说明中，为了将作为生物体试样而从个体提取等的细胞或组织等保持为存活的状态，在预定的容器内进行培养，从而具有还能够适用于胚、微生物、细菌等微小生物的构成，但在对实验用动物或植物等生物个体进行显微镜性质的拍摄时(所谓活体成像或内窥镜观察等)，在使用了培养器等的容器内进行培养时，进行自然培养以使干细胞等在体内保持为生存状态，这样的培养也包括在本发明中的培养エ序中。5.本发明的效果 如上所述，本发明中，利用以荧光素酶为指标的发光成像，以图像的形式检测标记基因表达量，从而能够测定来自ー个细胞或者不同的集落的发光量，能够确定各干细胞或各集落的分化状态。通过进行以荧光素酶为指标的干细胞成像，能够在使细胞存活的状态下对标记基因的表达进行定量且经时的观察。另外，通过以荧光素酶为指标进行干细胞成像，能够对在细胞的形态变化中无法确定的细胞分化的程度进行监测，与迄今为止的方法相比能够更精细地把握分化状态。通过基于干细胞成像进行图像检测，经时地观察各干细胞或集落，能够进行鉴于细胞周期的阶段的更高精度的检测。通过将多种而非ー种未分化标记物和分化标记物组合检测，能够更准确地把握分化状态的阶段。另外，通过与定量性优异的发光成像合用目的在于形态观察的明视野观察，还能够在不对细胞进行激发光照射的情况下捕捉细胞的形态变化和标记基因表达的状況。关于干细胞的未分化維持机理，尚未明确，但利用发明的方法也能够检测在形态的变化中未知的各种未分化标记物的基因表达变化。例如，可以通过针对各干细胞或集落将已经确定的Oct-4和Nanog基因表达量可视化，来把握各未分化标记物的表达平衡，调查以何种程度保持未分化状态，在形态相同的细胞中，调查未分化标记物表达量对分化的方向性所产生的影响。实施例实施例I :使用了未分化标记物的例子实施例1-1 :暂时性表达细胞的观察和分析(I)导入有未分化标记基因的启动子区域与荧光素酶基因的融合基因的ES细胞的制作关于Nanog基因启动子区域的克隆，參考非专利文献“T Kuroda etal. , Molecular and Cellular Biology 2005 vol. 25，No. 6，p2475_2485” 来获得启动子序列。以小鼠基因组DNA为模板来获得Nanog基因启动子区域序列。用于扩增Nanog基因启动子区域的引物使用下述引物。
正向引物CTACTCGAGATCGCCAGGGTCTGGA(序列编号I)反向引物CTACTCGAGCGCAGCCTTCCCACAGAAA(序列编号 2)。将所获得的Nanog基因启动子序列插入pGL4_basic载体(Promega),制作“Nanog基因表达特异性发光载体pNanog-GL4”。为了培养ES细胞，准备了饲养细胞。具体地说，用O. 1%明胶涂覆直径为35mm的塑料培养皿，用PBS清洗3次。在进行了明胶涂覆的培养皿中撒上经丝裂霉素C处理而停止了分裂的MEF细胞(mouse embryonic fibro-blast小鼠胚胎成纤维细胞)，进行了一晚培养。培养基使用DMEM(酚红、加入10%FCS)。第二天，将小鼠ES细胞(BRC6株、理研BRC)撒在35mm培养皿内的饲养细胞上。培养ー晚后，将上述“pNanog-GL4基因表达载体”转染到小鼠ES细胞，作为培养基使用加入了 15%KSR (Knockout Serum(Gibco))、LIF(白血病抑制因子)的DMEM，将转染后的ES细胞培养一晩。基因的转染使用基于Amaxa Nucleofector (和光纯药株式会社)的 核转染法。第二天，将培养基置换为加入了 HEPES的DMEM(15%KSR、去除酚红)。需要说明的是，本实验中，使用了暂时性表达细胞株，但也可以使用导入耐药性基因而进行药物选择的稳定表达株细胞。(2) ES细胞的观察和分析为了进行发光观察而加入D-突光素(Promega社制造最终浓度100 μ M),使用发光显微镜LV200(奥林巴斯株式会社制造)观察了小鼠ES细胞。作为发光观察条件，以45分钟间隔对小鼠ES细胞进行15分钟摄影，由此观察Nanog基因表达量。物镜为X20，像素组合为1X1，CCD照相机为ImagEM(Hamamatsu Photonics株式会社制造)。定时拍摄观察后，保存所拍摄的观察图像，使用图像分析系统“AQUAC0SM0S(Hamamatsu Photonics株式会社制造)”由该观察图像分析数值数据，同时将所分析的数值数据曲线图化。将所获得的发光图像示于图4和图5。图4的(A)表示利用LV200刚进行发光观察后的发光图像，图4的(B)表示利用LV200刚进行发光观察后的明视野图像与发光图像的叠加图像。图5是观察21小时后的图像。图5的(A)表示发光图像，图5的⑶表示明视野图像与发光图像的叠加图像。选择3处ES细胞集落，在各区域进行发光量的数值化，其结果示于图6。所选择的3处区域示于图4和图5，分别称为ROI I 3。由图4和图5的图像可知，在观察21小时后，ROI 2的区域中发光强度降低，ROI 3的区域中发光强度増大。该结果与图6的发光量的结果也一致。由图4 6的结果观察到从培养开始时起发光增加的集落(R0I 3)、变化少的集落(R0I I)、減少的集落(R0I 2)，可知根据各干细胞集落的不同，集落整体的Nanog基因表达的模式不同。基因表达的模式表示基因表达随时间经过而变动的状況。已知ES细胞是具有不同性质的异源的细胞群，与以往得到的见解一致。由本结果可知，能够针对每ー个细胞或每ー个集落监控ES细胞的分化状态。由以上的实验结果可知，将荧光素酶的发光量作为指标，能够连续地測定未分化标记物Nanog的基因表达。本研究中为21小时左右的观察，若在数天进行长期观察的情况下，也可以交换荧光素和添加了分化抑制因子LIF(白血病抑制因子)的ES细胞培养液，连续地进行观察。根据需要,也可以添加饲养细胞。实施例1-2 :稳定表达细胞的长期观察和分析本实施例中，作为基因导入载体，使用含有耐药性基因的载体，通过药物选择来选择进行了基因导入的细胞(稳定表达细胞)，进行长期观察和分析。以下说明本实施例的详细内容。(I)导入有未分化标记基因的启动子区域与荧光素酶基因的融合基因的ES细胞的制作关于Nanog基因启动子区域的克隆，參考非专利文献“T Kuroda etal. , Molecular and Cellular Biology 2005 vol. 25，No. 6，p2475_2485” 来获得启动子序列。 以小鼠基因组DNA为模板来获得Nanog基因启动子区域序列。用于扩增Nanog基因启动子区域的引物使用下述引物。正向引物CTACTCGAGATCGCCAGGGTCTGGA(序列编号 I)反向引物CTACTCGAGCGCAGCCTTCCCACAGAAA(序列编号 2)。关于基因导入载体，将新霉素耐性pGL4载体(Promega)的荧光素酶基因部分置換为Eluc荧光素酶基因进行使用。将所获得的Nanog基因启动子序列导入上述载体，制作“ Nanog基因表达特异性发光载体pNanog-EIuc”，对小鼠ES细胞进行基因导入。基因的转染使用基于AmaxaNucleofector (和光纯药株式会社)的核转染法。通过进行G418添加，仅对进行了基因导入的细胞进行药物选择，制作稳定表达株细胞。为了培养ES细胞，准备了饲养细胞。具体地说，用0. 1%明胶涂覆直径为35mm的塑料培养皿，用PBS清洗3次。在进行了明胶涂覆的培养皿中撒上经丝裂霉素C处理而停止了分裂的MEF细胞(mouse embryonic fibro-blast小鼠胚胎成纤维细胞)，进行了一晚培养。培养基使用DMEM(酚红、加入10%FCS)。第二天，将小鼠ES细胞(BRC6株、理研BRC)撒在35mm培养皿内的饲养细胞上。培养ー晚后，作为培养基使用加入了 15%KSR (Knockout Serum(Gibco))、LIF (白血病抑制因子)的DMEM，将恒常表达Nanog-Eluc的小鼠ES细胞培养一晩。培养后，为了以“添加LIF”、“不添加LIF”的两个条件进行发光观察，在转染的第二天，分别置换为加入有LIF和HEPES的01^] (15%1 1 、去除酚红)、加入有冊 ￡3的DMEM (15%KSR、去除酚红、不添加LIF)培养基。关于LIF的添加，通过以规定浓度使用制品名LIF Human, recombinant, CultureSupernatant (和光纯药制造)来进行。需要说明的是，本实验中，使用了导入耐药性基因而进行药物选择的稳定表达株细胞，但也可以使用暂时性表达细胞株。(2) ES细胞的观察和分析为了进行发光观察而加入D-突光素(Promega社制造最终浓度500 ii M),使用发光显微镜LV200(奥林巴斯株式会社制造)观察了小鼠ES细胞。作为发光观察条件，以15分钟间隔对小鼠ES细胞进行12分钟摄影，由此观察Nanog基因表达量。物镜为X20，像素组合为1X1, CCD照相机为ImagEM(Hamamatsu Photonics株式会社制造)。
定时拍摄观察后，保存所拍摄的观察图像，使用图像分析系统“AQUAC0SM0S(Hamamatsu Photonics株式会社制造)”由该观察图像分析数值数据，同时将所分析的数值数据曲线图化。进行在培养基中加入LIF并进行观察的实验，将所获得的发光图像示于图7。图7的(A)是利用LV200刚进行发光观察后的发光图像，图7的(B)是利用LV200刚进行发光观察后的明视野图像与发光图像的叠加图像。以模拟彩色黄色表示发光图像。为了对Nanog表达量进行定量，选择多处ES细胞集落，进行发光量的数值化。将细胞选择区域示于图8。在所选择的区域中，关于ROI 1-10的10个集落，将发光量数值曲线图化并示于图9。分别称为ROI I 10。图9的(A)表示ROI I 5的結果，图9的⑶表示ROI 6 10的結果。
由图9的结果观察到在许多集落中Nanog基因表达量发生变动。看起来具有16-18 小时周期的振荡。在 Chambers I, et al. , Nature, Vol. 450，1230-1234，2007 中，报道了干细胞中的振荡现象，但迄今并没有长时间对每ー个集落进行Nanog表达分析的研究。接下来，以从培养基中除去了 LIF的条件进行了发光和明视野观察。为了对Nanog表达量进行定量，选择多处ES细胞集落，进行发光量的数值化。利用基于明视野图像的形态信息，分类成未分化状态的集落和分化状态略微扩大的集落，进行发光量的数值化。将细胞选择区域示于图10。未分化细胞选择为ROI 6-10，分化细胞选择为ROI 1-5。将所选择的未分化细胞和分化细胞的发光量数值曲线图化，示于图U。图11的(A)表示未分化细胞的结果，图11的(B)表示分化细胞的結果。对基于形态分类的发光模式进行比较时，在未分化状态的集落中观察到振荡，但在进行了分化的集落中观察到振荡消失的倾向。实施例1-3 :药物刺激下的稳定表达细胞的长期观察和分析使用实施例1-2中所用的恒常表达Nanog-Eluc的小鼠ES细胞，在利用FGF(成纤维细胞生长因子)分化诱导后，尝试了使信号传导抑制剂发挥作用的观察。据报道FGF信号是诱导干细胞分化的信号传导系统，通过使抑制剂发挥作用，从分化返回未分化状态(TKunath et al.，Development 134，2895-2902，2007)。细胞的制备法与实施例 1-2 相同。(I)ES细胞的制备在培养皿接种并培养ー晚后，作为培养基使用加入有15%KSR (KnockoutSerum (Gibco)),LIF (白血病抑制因子)的DMEM，将恒常表达Nanog-Eluc的小鼠ES细胞培养一晩。培养后，置换为加入有JEPES的DMEM(15%KSR、去除酚红、未添加LIF)。(2) ES细胞的观察和分析为了进行发光观察而加入D-突光素(Promega社制造最终浓度500 U M),以终浓度为10ng/ml的方式添加FGF (FGF ^人，PeproTech制造)，使用发光显微镜LV200 (奥林巴斯株式会社制造)观察了小鼠ES细胞。作为发光观察条件，以I小时间隔对小鼠ES细胞进行55分钟摄影，由此观察Nanog基因表达量。观察40小时后，添加作为FGF信号的抑制剂的H)184352(和光纯药制造)和SU5402(和光纯药制造)，进而进行26小时观察。PD184352为ERK路径的抑制剂，SU5402为FGF-R酪氨酸激酶抑制剂，据报道通过同时使用这两者，对于FGF信号的抑制效果増大。各抑制剂的终浓度分别为10mM、2mM。物镜为X 20,像素组合为1X1, (XD照相机为ImagEM(HamamatsuPhotonics株式会社制造)。
定时拍摄观察后，保存所拍摄的观察图像，使用图像分析系统“AQUAC0SM0S(Hamamatsu Photonics株式会社制造)”由该观察图像分析数值数据，同时将所分析的数值数据曲线图化。为了对Nanog表达量进行定量，选择多处ES细胞集落。将发光图像的细胞选择区域的一部分示于图12。图12的(A)是利用LV200进行发光观察开始时的发光图像，图12的(B)是利用LV200进行发光观察结束时的发光图像。将所选择的9个区域ROI 1-9的发光量数值曲线图化，示于图13。集落的Nanog表达量分成A-C的3种表达模式。将A-C的表达模式分别不于图13的(A)-(C)。A的表达模式为在Nanog表达降低的40小时后通过添加抑制剂Nanog表达上升的集落。认为是由于抑制了分化诱导而使作为未分化标记物的Nanog表达上升。这与Nanog的表达为可逆的报道结果一致。关于B的表达模式，在添加抑制剂后也仍为Nanog表达降低的状态，认为是分化诱 导进行而未观察到抑制剂的效果。关于C的表达模式，其是在添加FGF时未观察到Nanog表达、但通过添加抑制剂Nanog表达上升的集落。虽然生理学上的意义尚不明确，但如这些分类这样，能够观察到在各集落中Nanog表达的模式不同。由这些结果可知，关于Nanog基因表达量和周期等，由于各干细胞集落的不同，Nanog基因表达的模式不同。已知ES细胞是具有不同性质的异源的细胞群，与以往得到的见解一致。由本结果可知，对于每一个细胞或每ー个集落，能够监控ES细胞的分化状态。这样，不进行流式细胞仪那样的在终点进行的多能性/分化标记物的检测、定量，而是对每ー个细胞进行时间上连续的基因表达模式分析，从而能够进行精度更高的分析。对每ー个细胞或每ー个集落进行了详细的分析后，以表示基因表达量的发光量和表示基因表达模式的发光模式作为指标，获得目标细胞，从而容易地实现干细胞的纯化。通过进一歩对所获得的干细胞进行继代培养，能够明确每个集落的特性。由以上的实验结果可知，将荧光素酶的发光量作为指标，能够连续地计测未分化标记物Nanog的基因表达。实施例2 :使用了未分化标记物和分化标记物的例子实施例2-1 :分化诱导前的ES细胞的观察本实施例中，以具有不同的波长特性的荧光素酶即绿(Eluc荧光素酶)和红(CBR荧光素酶)作为指标，对未分化标记物Nanog基因、神经分化标记物Nestin基因进行检測。本实施例中，将干细胞分化诱导为神经系统细胞时，利用发光成像对与ES细胞的分化诱导相伴的各标记基因的表达变化进行检测、定量化。(I)导入有未分化标记基因的启动子区域与荧光素酶基因的融合基因、及分化标记基因的启动子区域与荧光素酶基因的融合基因这两者的ES细胞的制作关于Nanog基因、Nestin基因的启动子区域的克隆，使用已经在论文中公开的基因序列。关于Nanog基因，參考非专利文献“T Kuroda et al. , Molecular and CellularBiology 2005 vol. 25, No. 6，p2475_2485”来获得启动子序列，关于Nestin基因，參考非专利文献“L Cheng et al. , FEBS Letters 2004 565 pl95_202”来获得启动子序列。以小鼠基因组DNA为模板来获得Nanog基因启动子区域序列。用于扩增Nanog基因启动子区域的引物使用下述引物。正向引物CTACTCGAGATCGCCAGGGTCTGGA(序列编号 I)反向引物CTACTCGAGCGCAGCCTTCCCACAGAAA(序列编号 2)。以小鼠基因组DNA为模板来获得Nestin基因启动子区域序列。用于扩增Nestin基因启动子区域的引物使用下述引物。正向引物GAGAACGCGTGGGCTGTGTGTTGCACT(序列编号 3)反向引物GAGACTCGAGGTGGAGCACTAGAGAAGGGAGT(序列编号 4)。将所获得的Nanog、Nestin基因启动子序列分别插入ELuc载体(东洋纺)、CBR载体(Promega)，制作出插入有不同荧光素酶的“未分化标记物表达特异性发光载体 pNanog-Eluc”、“分化标记物表达特异性发光载体pNestin_CBR”。为了培养进行基因导入的ES细胞，准备了饲养细胞。具体地说，用O. 1%明胶涂覆直径为35mm的塑料培养皿，用PBS清洗3次。在进行了明胶涂覆的培养皿中撒上经丝裂霉素C处理而停止了分裂的MEF细胞(mouse embryonic fibro-blast小鼠胚胎成纤维细胞)，进行了ー晚培养。培养基使用DMEM(酚红、加入10%FCS)。第二天，将小鼠ES细胞(BRC6株、理研BRC)撒在35mm培养皿内的饲养细胞上。培养ー晚后，将pNanog-Eluc、pNestin-CBR两载体转染到小鼠ES细胞，作为培养基使用加入了 15%KSR (Knockout Serum(Gibco))、LIF(白血病抑制因子)的DMEM，将转染后的细胞培养一晩。基因的转染使用基于Amaxa Nucleofector (和光纯药株式会社)的核转染法。第二天，置换为加入了 HEPES的DMEM(15%KSR、去除酚红)，为了进行向神经系统细胞的分化诱导，添加了 IuM的视黄酸(Sigma)。(2) ES细胞的观察为了进行发光观察而加入D-突光素(Promega社制造最终浓度100 μ M),使用发光显微镜LV200(奥林巴斯株式会社制造)观察了小鼠ES细胞。为了将具有不同的波长特性的2种荧光素酶分光，使用BP515-560 (Sigma)、6IOALP (Sigma)这两种分光滤波器，对各波长进行拍摄。转染48小时后，使用LV200进行观察。緑色和红色的多色检测使用上述分光滤波器进行。观察条件如下所述。观察装置LV200(奥林巴斯)物镜10倍(NA O. 45) CCD照相机ImagEM(Hamamatsu Photonicsノ露出时间滤波器515-5603分钟滤波器610ALP 3分钟EM gain :1200观察用培养基小鼠ES细胞用培养基+25mM HEPES、500 μ M D-荧光素(Wako)将转染48小时后的拍摄结果示于图14。图14的(A)表示明视野图像，图14的(B)表示使用了滤波器ΒΡ515-560的发光图像I (Nanog表达)，图14的(C)表示使用了滤波器610ALP的发光图像2 (Nestin表达)，图14的⑶表示发光图像I与2的叠加图像。各观察中的露出时间为3分钟，能够进行每ー个集落的发光检測。由于加入LIF进行培养，因而认为能够维持未分化状态，但发现了略微的Nestin的表达。这样，根据本实施例可知对于各个集落，能够连续地对从未分化状态至分化后的状态进行监控。特别是，在ー个集落内，能够同时监控混杂有未分化状态和分化后的状态两者的集落内各基因的表达。另外，对于多个集落，也能够同时监控未分化状态的集落和分化后的集落。本发明的方法能够同时监控不同的状态，该方法能够在再生医疗的领域中提供ー种新型的应用，该应用克服了如荧光观察那样不同的激发光彼此所产生的串扰的问题。实施例2-2 :分化诱导后的ES细胞的观察和分析在分化诱导ES细胞的情况下，通常在浮游培养系统中形成拟胚体(EmbryoidBody EB)。已知悬滴法等多种制作方法，本研究中，使用在培养面涂覆了特殊磷脂质聚合物的EZBindShut (IffAKI)来形成拟胚体，对进行了分化的拟胚体中Nestin基因表达如何变化进行了检测。拟胚体(EB)的制备如下进行。(I)准备直径为35mm的一个培养皿量的铺满(confluent)状态的小鼠ES细胞。(2)用PBS清洗I次后，进行胰蛋白酶处理。
(3)调整细胞数，使其最终为200 u L/孔(1000细胞/孔)，通过核转染进行基因导入。(4)将细胞接种到加入了 15%KSR(Knockout Serum(Gibco))的 DMEM 中，加入到低粘接性 U 底微孔板(EZ BindShut, AGC ASAHI TECHNO GLASS CORPORATION)。(5)在细胞用培养器内进行培养。将培养开始日作为拟胚体(EB)形成第0天。将拟胚体(EB)形成的状况示意性地示于图15。(6)在进行发光观察时，使用微量移液管回收拟胚体，转移到含有加入了 D-荧光素(Promega、最终浓度500iiM)的发光观察用培养基的35mm培养皿中，所述培养基是加入了 HEPES 的 DMEM(15%KSR、去除酚红)。(7)使用LUMIN0VIEW(LV200，奥林巴斯)进行发光观察。观察条件如下所述。观察装置LV200(奥林巴斯)物镜10X倍(NA 0. 45) CCD照相机ImagEM(Hamamatsu Photonics； EM gain :1200观察用培养基小鼠EB细胞用培养基+25mM HEPES、500 u M D-荧光素(Promega)对在拟胚体(EB)形成后第2天和第12天拍摄的观察图像进行保存，使用图像分析系统“AQUAC0SM0S (Hamamatsu Photonics株式会社制造)”由该观察图像进行数值数据分析。以每个分光滤波器得到的发光强度为基础，利用在现有的荧光观察中使用的计算方法计算出来自各荧光素酶的发光強度，调查各标记物的基因表达强度、表达比。将拟胚体(EB)形成后第2天和第12天的观察图像示于图16。图16的上层为拟胚体(EB)形成后第2天的图像，从左起依次表示明视野图像、使用了滤波器BP515-560的发光图像I (Nanog表达)、使用了滤波器610ALP的发光图像2 (Nestin表达)和发光图像I与2的叠加图像。图12的下层为拟胚体(EB)形成后第12天的图像，从左起依次表示明视野图像、使用了滤波器BP515-560的发光图像3(Nanog表达)、使用了滤波器610ALP的发光图像4 (Nestin表达)、发光图像3与4的叠加图像。以下示出分析結果。拟胚体中的发光强度(平均值信号-背景数值)EB 形成转染第 2 天 Eluc :3394 CBR 1062 Eluc/CBR=3. 19EB 形成转染第 12 天 Eluc :105 CBR :3726 Eluc/CBR=0. 03对EB形成后第2天和第12天的Nanog和Nestin表达量进行了比较，结果在第2天ELuc表达高、Nanog表达具有优势(Eluc/CBR=3. 19)。在EB形成后第12天,Nanog表达变低，Nestin表达上升(Eluc/CBR=0. 03)。可知随着时间经过进行分化诱导，Nanog表达減少，Nestin表达增加。本研究中比较了分化诱导后第2天和第12天的拟胚体观察結果。只要是带有细胞培养功能的显微镜，均能够进行显微镜下的连续观察。若长时间的观察困难，也可以分成连续观察分化诱导的初期、中期、后期来进行观察。本研究中进行了暂时性的基因表达，因而也可以使用基因导入后的稳定株细胞来进行实验。本实验中，不仅为发光，通过组合明视野观察，从而能够得到分化为神经系统细胞时的形态变化，得到无法观察到标记基因的表达的时刻的形态信息，能够进行更闻精度的实验。这些结果表明在进行分化诱导的状态下存在具有多种性质的干细胞或来自干细胞的分化细胞，需要从其中选择实验目标集落。通过以发光为指标进行拍摄，以图像信息的形式获得基因表达量，从而能够针对各干细胞对在细胞的形态变化中无法确定的细胞分化的程度进行监控。
在上述说明中，为了作为图像处理所需要的区域(ROI)选择集落或干细胞，可以在PC附帯或另外的显示器上显示发光图像和明视野图像的叠加图像，也可以仅显示发光图像。在作为各干细胞或干细胞所属的各集落的形态信息的各轮廓信息、或者集落内的干细胞的分布等位置信息为必要的情况下，明视野图像优选与发光图像合用。若限定于得到轮廓和/或位置的信息的目的，可以将通过进行荧光观察所得到的荧光图像来代替明视野图像与发光图像叠加，或者，也可以对叠加了明视野图像与荧光图像两者的形态性的图像进ー步叠加表示基因表达量的发光图像。
权利要求
1.一种监控干细胞的分化状态的方法，其特征在于，其包括以下エ序 (A-I)对导入有分化状态检测标记基因的启动子区域与发光蛋白基因的融合基因的干细胞进行培养的エ序； (A-2)对于所述(A-I)的エ序后的干细胞，在诱导分化的条件下进行培养的エ序；和(A-3)在所述(A-I) (A-2)的エ序的至少一定期间，对干细胞中由发光蛋白基因的表达所产生的发光图像进行拍摄的エ序。
2.一种监控干细胞的分化状态的方法，其特征在于，其包括以下エ序 (B-I)对导入有分化状态检测标记基因的启动子区域与发光蛋白基因的融合基因的干细胞进行培养的エ序； (B-2)进ー步对干细胞进行继代培养的エ序； (B-3)对于所述(B-2)的エ序后的干细胞，在诱导分化的条件下进行培养的エ序；和(B-4)在所述(B-I) (B-3)的エ序的至少一定期间，对干细胞中由发光蛋白基因的表达所产生的发光图像进行拍摄的エ序。
3.—种监控干细胞的分化状态的方法，其特征在于，其包括以下エ序 (C-I)对导入有分化状态检测标记基因的启动子区域与发光蛋白基因的融合基因的干细胞进行培养的エ序； (C-2)进ー步对干细胞进行继代培养的エ序；和 (C-3)在所述(C-I) (C-2)的エ序的至少一定期间，对干细胞中由发光蛋白基因的表达所产生的发光图像进行拍摄的エ序。
4.如权利要求I 3中任一项所述的方法，其特征在于， 所述拍摄エ序是通过发光成像系统持续拍摄两个以上的发光图像的エ序。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，其还包括以下エ序 在通过所述拍摄エ序得到的发光图像的特定细胞区域，作为分化状态的指标，測定发光量，分析发光量的经时变化。
6.如权利要求I 5中任一项所述的方法，其特征在于，其还包括以下エ序 为获得干细胞或干细胞所属的集落的轮廓和/或位置的信息进行明视野观察和/或荧光观察，在与发光图像相同的区域获得明视野图像和/或荧光图像。
7.如权利要求I 6中任一项所述的方法,其特征在于， 分化状态检测标记基因是细胞在未分化的状态下特异表达的未分化标记基因和/或细胞在特定的分化过程中特异表达的分化标记基因。
8.如权利要求I 7中任一项所述的方法，其特征在于， 干细胞是导入了两种以上的融合基因的干细胞， 融合基因分别包含不同种类的分化状态检测标记基因的启动子区域， 分化状态检测标记基因的启动子区域分别与编码具有不同的发光波长的发光蛋白的基因融合，使得其与其他分化状态检测标记基因的启动子区域相区别地被检测出。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在干， 干细胞是导入了两种融合基因的干细胞， ー种融合基因是未分化标记基因的启动子区域与第一发光蛋白基因的融合基因， 另ー种融合基因是在特定的分化过程中特异表达的分化标记基因的启动子区域与第ニ种发光蛋白基因的融合基因，所述第二种发光蛋白基因的表达与所述第一发光蛋白基因的表达相区别地被检测出。
10.一种确定干细胞的分化状态的方法，其特征在于，其包括以下エ序 基于利用权利要求I 9中任一项所述的方法得到的发光图像和/或发光量数据和/或明视野图像，确定干细胞的分化状态。
11.ー种获得显示所期望的分化状态的干细胞的方法，其特征在于，其包括以下エ序 基于利用权利要求6所述的方法得到的发光图像和/或发光量数据和/或明视野图像，由多个干细胞中获得显示所期望的分化状态的干细胞。
12.如权利要求I 11中任一项所述的方法，其特征在于，所述发光图像表示集落内的各个干细胞的基因表达量。
13.如权利要求12所述的方法，其中，所述集落形成了拟胚体。
全文摘要
本发明涉及一种监控干细胞的分化状态的方法，其特征在于，其包括以下工序(A-1)对导入有分化状态检测标记基因的启动子区域与发光蛋白基因的融合基因的干细胞进行培养的工序；(A-2)对于所述(A-1)的工序后的干细胞，在诱导分化的条件下进行培养的工序；(A-3)在所述(A-1)～(A-2)的工序的至少一定期间，对干细胞中由发光蛋白基因的表达所产生的发光图像进行拍摄的工序。
文档编号C12Q1/66GK102822333SQ20118001498
公开日2012年12月12日 申请日期2011年3月23日 优先权日2010年3月23日
发明者大桥阳子 申请人:奥林巴斯株式会社