专利名称：新的产乙醇梭菌属物种clostridium coskatii的制作方法
技术领域：
本发明的领域涉及新的细菌物种，其能从由氢(H2)和二氧化碳(CO2CO2)和/或一氧化碳(CO)组成的气体混合物中产生乙醇。特别地，本发明提供了具有ATCC号PTA-10522的鉴定特征的新梭菌属物种，Clostridium coskatii (PS02),以及使用该新梭菌属物种,从 H2和/或CO2和/或CO气体中合成乙醇和其他有用产物的方法。
背景技术：
目前，生物燃料生产(从生物质中产生燃料，例如乙醇)的主要方法是通过直接发酵，其在美国占 90% 的乙醇产量(Licht, F. O. (2001) World Ethanol Markets, Analysisand Outlook,Kent,英国)。直接发酵是这样的方法,其中糖解微生物,例如酵母或细菌将糖转化成乙醇。这些糖可以是简单的(如葡萄糖)或复杂的(如淀粉、纤维素、半纤维素)。玉米淀粉是在当今乙醇生产工厂中使用的主要底物。在乙醇的直接发酵产生中使用玉米淀粉的一个缺点是，玉米是许多人类和动物食物的组分。因此，将玉米用于产生乙醇使得其不足以供给人类和动物消耗。也正在研究其他底物，例如木质纤维素生物质(如草、小树、纸废物或木屑)，用于生物燃料的直接发酵。然而，它们也具有局限性。木质纤维素由纤维素、半纤维素、果胶和木质素组成，在微生物可以利用该底物之前，其需要预处理过程，以将生物质降解成其各个糖组分。这增加了材料、工厂设计和废物处理领域中更多的花费。此外,大约22-35%的木质纤维素部分由木质素组成，其不能通过当前的直接发酵方法使用，并将其作为难以处理的废弃材料从工艺中丢弃。生物燃料产生的另一备选方法是间接发酵。间接发酵是这样的工艺，其中从含碳的非食物农业和工业废弃材料中产生可以提供电子源(例如H2和CO)和碳源(例如CO和CO2)的富含能量的气体，并然后转移到生物反应器中，在生物反应器厌氧细菌将气体转化成生物燃料。当木质纤维素的生物质热解(燃烧)时产生的气体是可用于间接发酵的废气类型的实例。合成气体(也称为“合成气”)(主要为CO、H2和CO2)是热解的生物质或煤的产物，并且已经确认了其在生物质至燃料乙醇的间接发酵中的潜在作用(Zeikus, J. G, AnnuRev. Microbiol. 34 :423-464 (1980))。富含能量的废气的另一来源是碱性氧气炼钢(LD转化炉)工艺，其产生了由70%C0、1-2%H2和10-15%C02组成的显著体积的废气，所述废气也适用于使用间接发酵法产生生物燃料。厌氧微生物例如产乙酸菌提供了通过间接发酵法，将废气转化成有用产物，例如乙醇和正丁醇的可行途径。此类细菌催化H2和CO2和/或CO至生物燃料的转化，具有比通过Fischer-Tropsch方法或者使用CC^PH2的其他化学生物燃料产生方法所达到的特异性、产率和能量消耗更高的特异性、更高的产率和更低的能量消耗。已经鉴定了几种能从废气和其他底物中产生生物燃料的微生物，并描述如下。已经描述了使用合成气的三种主要组分(h2+co2或CO或h2+co2和CO)的至少之一作为底物，用于产生生物燃料、乙醇、正丁醇或这些醇的混合物的六种产乙酸细菌。这些产乙酸细菌包括食甲基丁酸杆菌(Butyribacterium methylotrophicum) (Grethlein 等人，1990 ;Jain 等人，1994b)、Clostridium ragsdalei (Huhnke 等人，2008)、Clostridiumcarboxidivorans (Liou,等人，2005)、穆尔氏菌属(Moorella)物种 HUC22-1 (Inokuma,等人，2007)、Clostridium autoethanogenum (Abrini 等人，1994)和扬氏梭菌(Clostridiumljungdahlii) (Arora 等人，1995 ；Barik 等人，1988 ；Barik 等人 1990 ；和 Tanner 等人，1993)。在这些代表中，已知仅有三种产乙酸菌(扬氏梭菌、Clostridium ragsdalei和Clostridium autoethanogenum)可以将CO或CO和/或H2和CO2的混合物转化成乙酸和乙醇。因此,它们是唯一已知的能形成单一醇(乙醇)终产物,而同时使用合成气体流的全部组分的生物。在本文件中，该组细菌称为产乙醇梭菌(clostridial ethanologens),其具有 显著的商业重要性，因为间接发酵法的经济学优点在于(a)同时使用H2和CO，使得组合转化率超过90%，和(b)产生了单一醇，其允许使用简化的和更便宜的生物燃料回收系统。在从合成气体产生生物燃料的文献中描述了六种产乙醇梭菌(I)扬氏梭菌PETCt (ATCC号49587和DSMZ号13528):该生物为该物种的原始型菌株保藏物(Tanner等人，1993)。参见美国专利号5，173,429。(2)扬氏梭菌ERI-2 (ATCC号55380):该生物的系统发生状况仍不清楚，因为其明显与PETC型菌株不同，但其并没有包括于已批准的细菌名称列表(Approved Lists ofBacterial Names)的列表中(Skerman 等人，1989)。参见美国专利号 5，593，886。(3)扬氏梭菌C-Ol ;(ATCC号55988):该生物的系统发生状况仍不清楚，因为其明显与PETC型菌株不同，但其并没有包括于已批准的细菌名称列表(Approved Lists ofBacterial Names)的列表中(Skerman 等人，1989)。参见美国专利号 6，136, 577。(4)扬氏梭菌0-52; (ATCC号55989):该生物的系统发生状况仍不清楚，因为其明显与PETC型菌株不同，但其并没有包括于已批准的细菌名称列表(Approved Lists ofBacterial Names)的列表中(Skerman 等人，1989)。参见美国专利号 6，136, 577。(5) Clostridium ragsdalei ; (ATCC 号 BAA-622):参见美国专利号 US20080057554(EP2061872A2)。(6) Clostridium autoethanogenum ； (DSMZ 号 10061)该分离物由 Abrini 等人，1994年描述为其从CO、H2和CO2的混合物中产生乙醇和乙酸。除描述用于生物燃料产生的特定产乙醇梭菌属的用途的专利外，如上文所定义，存在以下方法专利，用于从废气例如合成气体中产生生物燃料。某些专利还涵盖了已知从废气中产生多种醇(主要为乙醇和正丁醇)的微生物(例如，Clostridiumcarboxidivorans)(I)Lewis 等人的美国专利号 US20070275447A1 公开了 Clostridiumcarboxidivorans ATCC号BAA-624,其是一种能从废气例如合成气体中合成生物燃料,包括乙醇和正丁醇的新的厌氧梭菌属细菌物种。
(2) Jain 等人的美国专利号 5，192，673 公开了 Clostridium acetobytylicum 的突变菌株和用该菌株制备丁醇的方法。(3)Gaddy等人的美国专利号5，593，886公开了使用扬氏梭菌ATCC号55380的方法，用于使用废气(例如炭黑废气)作为底物，产生乙酸和乙醇。(4)Gaddy等人的美国专利号5，807，722公开了使用厌氧细菌，例如扬氏梭菌ATCC号55380，将废气转化成有用产物例如有机酸和醇的方法和装置。(5)Gaddy等人的美国专利号6，136，577公开了使用厌氧细菌，例如扬氏梭菌ATCC号55988和55989，将废气转化成有用产物例如有机酸和醇(特别地乙醇)的方法和装置。(6)Gaddy等人的美国专利号6，136，577公开了使用扬氏梭菌的厌氧菌株，将废气转化成有用产物例如有机酸和醇(特别地乙酸)的方法和装置。 (7)Gaddy等人的美国专利号6，753，170公开了用于产生乙酸的厌氧微生物发酵方法。(S)Gaddy等人的美国专利号7，285，402公开了用于产生乙醇的厌氧微生物发酵方法。尽管本领域知道有关微生物在生物燃料的产生中的用途，但仍存在发现和/或研发能使用间接发酵法产生有用的产物例如生物燃料的其他微生物的持续需求。特别地，有利的是发现当在化学限定的或者低有机碳生长条件下培养时，表现出改进的生长特性和高生物燃料产率的新产乙醇梭菌属。具体而言，认为从细菌生长培养基中去除复杂的有机碳源例如酵母提取物、牛肉提取物、玉米浆或大豆胰蛋白胨，对于通过合成气体发酵产生生物燃料是有利的，因为(I)这些组分增加了生物燃料产生花费的额外开支，和(2)复杂的有机碳源支持了生物燃料生产发酵罐中外源细菌的生长，所述外源细菌的生长不利地影响了生物燃料产率和过程经济。发明概述本发明涉及新发现的产乙醇梭菌属物种，Clostridium coskatii (PS02)的生物学纯的培养物。该梭菌属物种是新的梭菌属物种，具有不同于其他已知梭菌属物种的表型特性和遗传特性。本发明的另一实施方案是该梭菌属物种从CO和/或H2和/或CO2的气体来源中产生乙醇和乙酸的独特能力。在本发明的另一实施方案中，Clostridium coskatii能独特地在复杂有机碳源，例如酵母提取物不存在的情况下进行乙醇生产。附图简述图I是负染色/相位的透射电子显微照片，25，000倍放大倍数。刻度(Bar)=1. O μ m。图2是稳定期期间，Clostridium coskatii (PS02)细胞的相差光学显微照片，1,000倍放大倍数。刻度=14. 63 μ m。图3是在对数生长期晚期期间收获的Clostridium coskatii (PS02)的扫描电子显微照片，10, 000倍放大倍数。刻度=1. O μ m。图 4 图解了与 Clostridium autoethanogenum 比较，基于 Clostridium coskatii(PS02)的分批培养的光学密度，pH生长最佳值。
图5图解了基于终产物，乙醇和乙酸的体积浓度，Clostridium coskatii (PS02)的分批培养的pH生长最佳值。图6图解了基于光学密度，Clostridium coskatii (PS02)的温度生长最佳值。图7a图解了产乙醇梭菌属(A)杨氏梭菌PETC ；⑶C. autoethanogenum ； (C)C. ragsdalei ； (D)C. coskatii(PS02)的脂肪酸甲酯谱的比较。化合物和相应的峰(I)十二酸甲酯(8. 161分钟);(2)十四醛(10. 046分钟)；(3)十四酸甲酯(12. 61分钟);(4) 1，I-二甲氧基-十二烷(13. 881分钟);(5) I-甲基十二胺(15. 176分钟)；(6) (Z)-13-十八醛(17. 638分钟)；(7)十六酸甲酯(18. 138分钟)；(8)甲基-6，6-二甲氧基-辛酸(18. 973分钟)；
(9)1，I-二甲氧基-十四烷(19. 506分钟)；(10) 2-己基-环丙烷辛酸甲酯(20. 735分钟)；
(11)I, I- 二甲氧基-十六烧(22. 113分钟)；(12) 2-氧-3-甲基_顺式_全氧-，I, 3-苯并.嗔嗪(23. 363分钟)。图7b提供了总结图7a的脂肪酸甲酯谱中线性关系的强度的相关系数的矩阵。图7c图解了显示图7b的脂肪酸甲酯谱中，线性关系的强度的散点图矩阵；a=0. 99。图8a 图解了 SEQ ID NO. 3,其是 Clostridium coskatii 的 16S rDNA 序列。通过与图Sb中显示的序列比对，产生了邻近序列中的缺口。图8b图解了梭菌属物种的16S rDNA简约树(parsimony tree)。条形对应于每100个序列位置I个核苷酸替换。产乙醇梭菌属聚类(C. coskatiiPS02)与其他选定的梭菌属聚类 I 代表者的距离为C. tyrobutyricum :95. 18% ；C. magnum :93. 01% ；C. kluyveri 92. 96% ；C.scatologenes:92. 52%。图9图解了显示产乙醇梭菌属的16S rDNA的相似性的16S rDNA相邻系统发生树距离矩阵得分。
图10图解了显示6种产乙醇的产乙酸菌的16S rDNA序列中高变区的频率的熵图，以及这些高变区的序列比对。图11图解了产乙醇梭菌属物种的BOX-PCR比较。泳道排布为(I) IOObp序列梯；(2)C. coskatii (PS02) ； (3)C. ragsdalei ATCC BAA-622 ； (4)C. autoethanogenum DSMZ10061 ； (5)扬氏梭菌 PETC DSMZ 13528 ； (6)扬氏梭菌 C-01 ATCC55988 ； (7)扬氏梭菌ERI-2ATCC 55380 ； (8) IOObp 序列梯；(9) pUC19/Sau3A 标记。图12图解了用于分析产乙醇梭菌属物种的通过BOX-PCR产生的扩增子的简约树和Pearson UPGMA相似性矩阵得分。图13图解了产乙醇梭菌属物种的REP-PCR比较。泳道排布为(I) IOObp序列梯；(2)C. coskatii (PS02) ； (3)C. ragsdalei ATCC BAA-622 ； (4)C. autoethanogenum DSMZ10061 ； (5)扬氏梭菌PETC DSMZ 13528 ； (6)扬氏梭菌C-Ol ATCC55988 ； (7)扬氏梭菌ERI-2ATCC 55380 ； (8) IOObp 序列梯；(9) pUC19/Sau3A 标记。图14图解了用于分析产乙醇梭菌属物种的通过REP-PCR产生的扩增子的简约树和Pearson UPGMA相似性矩阵得分。图15图解了产乙醇梭菌属的ERIC-PCR比较。泳道排布为⑴IOObp序列梯；(2)C. coskatii (PS02)； (3)C. ragsdalei ATCC BAA-622 ； (4)C. autoethanogenum DSMZ 10061 ；
(5)扬氏梭菌 PETC DSMZ 13528 ； (6)扬氏梭菌 C-Ol ATCC55988 ； (7)扬氏梭菌 ERI-2 ATCC55380 ； (8) IOObp 序列梯；(9) pUC19/Sau3A 标记。图16图解了用于分析产乙醇梭菌属物种的通过ERIC-PCR产生的扩增子的简约树和Pearson UPGMA相似性矩阵得分。图17图解了使用2. O天的平均细胞保留时间，当使用Acetogen C5培养基时和在合成气体进料的CSTR中(a)在预稳定状态条件(指数生长期)下，和(b)在乙醇产生期(指数生长晚期至稳定期)，Clostridium coskatii (PS02)的比生长率测量。持续时间=43. 75天。图18是显示在Clostridium coskatii (PS02)细胞中存在的主要元素的X射线
-i'TfeP曰。
图19图解了使用2. O天平均保留时间和含有Clostridium coskatii (PS02)的Acetogen C5培养基，在合成气体进料的CSTR中产生的乙醇和乙酸的体积浓度。持续时间=43. 75 天。图20图解了当使用2. O天平均细胞保留时间和含有Clostridium coskatii(PS02)的Ethanologen C5培养基时，合成气体进料的CSTR (产物显示于图21中)的气体摄入率。持续时间=43. 75天。图21图解了在Clostridium coskatii (PS02)的稳定状态生长时,在合成气发酵的培养基相中存在的挥发物的GC-MS总离子流(TIC)层析。入口 显示通过代谢(甲酸、乙酯)或酸催化化学反应(乙酸乙酯)产生的痕量杂质的层析基线的28倍放大。图22a :在使用2. O天平均细胞保留时间和含有Clostridium coskatii (PS02)的Acetogen C5培养基的合成气体进料的CSTR中，470个小时稳定状态期，平均气体摄入率的统计学分析。持续时间=43. 75天。A) CO摄入，B)H2摄入，和C)C02摄入。图22b图解了在使用2. O天平均细胞保留时间和含有Clostridium coskatii(PS02)的Acetogen C5培养基的合成气体进料的CSTR中，470个小时稳定状态期，平均气体摄入率的统计学分析的继续。持续时间=43. 75天。A)以mmol/L表示的体积乙醇浓度，B)以mmol/L表示的体积乙醇浓度，和C)以mmol/L表示的从培养基中排出的总乙醇。图23图解了有机碳(酵母提取物)添加物对通过含有Clostridium coskatii的合成气体进料的CSTR的乙醇和乙酸产生的影响。(A)在接收了化学限定的基本培养基(Acetogen C5)或补充了 O. lg/L酵母提取物的相同培养基的2L CSTR (D=每天O. 5)中的乙醇产生。(B)在接收了化学限定的基本培养基(Acetogen C5)或补充了 O. lg/L酵母提取物的相同培养基的2L CSTR (D=每天O. 5)中的乙酸产生。实施方案的详细描述本发明细菌是新的产乙醇梭菌属物种，其显示出由ATCC号PTA-10522表示的特性，在本文中称为 “Clostridium coskatii (PS02)”。已经分析了 Clostridium coskatii(PS02)的系统发生、形态学和生物化学特性，并描述于下文实施例部分。尽管Clostridiumcoskatii (PS02)的某些特性与其他梭菌属物种相似,但Clostridium coskatii (PS02)拥有证实其为该属的新物种的独特特征。在实施例中包括的数据显示，该细菌是梭菌属的新代表。Clostridium coskatii (PS02)具有在厌氧条件下，从底物 C0+H20 或 H2+C02 或C0+H2+C02中产生乙酸和乙醇的能力。对于产生乙酸和乙醇的反应，CO或CO2提供了碳源，并且H2或CO提供了电子源。根据以下反应,通过由Clostridium coskatii (PS02)发酵CO和/或H2和CO2产生的主要产物是乙醇6C0+3H20 — C2H50H+4C02 (I)
6H2+2C02 — C2H50H+3H20 (2)Clostridium coskatii (PS02)还可以产生乙酸。乙酸产生通过以下反应发生4C0+2H20 — CH3C00H+2C02 (3)4H2+2C02 — CH3C00H+2H20 (4)本发明的梭菌属可以利用C0、C02和H2的许多来源。例如，这些底物的优选来源包括“废”气，例如合成气、炼油厂废气、钢铁生产废气、天然气的自热改造，以及煤的气化。来源还包括由酵母、梭菌属发酵，以及气化的纤维素物质产生的气体(含有一些H2)。备选地，此类气体底物并不必需作为其他工艺的副产物产生，但可以特定地用于使用Clostridiumcoskatii (PS02)的本发明发酵反应。本领域技术人员将认识到，可以将底物气体的任一来源用于本发明的实践，只要其可以在适合于细菌实施发酵反应的条件下，为Clostridiumcoskatii提供足够量的底物气体。在本发明的一个优选的实施方案中，CO、CO2和H2的来源是合成气。用作为底物的合成气可以例如作为煤的气化的气体副产物获得。备选地，合成气可以通过明确用于细菌发酵为目的的容易获得的廉价农业原材料的气化产生，从而提供了将生物质间接发酵成燃料乙醇的途径。存在可以将原材料转化成合成气的大量实例，因为大多数类型的植物都可以用于该目的。优选的原材料包括但不限于，多年生草例如柳枝稷、作物残余物例如玉米秸杆、加工废物例如锯屑等。本领域技术人员熟悉从此类起始物质中产生合成气。总之，合成气主要通过热解、部分氧化和蒸汽转化，在气化器中从干的生物质中产生，主要的产物为CO、H2和C02。术语“气化”和“热解”指相似的工艺；两种工艺都限制生物质所暴露的氧的量。有时使用的术语“气化”包括气化和热解二者。还可以将用于注入间接发酵方法的底物气体源的组合用于改变来自生物反应器的通风口蒸汽中组分的浓度。例如，CO、CO2和H2的主要来源可以是合成气，其一般表现出37%0)、35%!12和18%C02的浓度比，但可以用来自其他来源的气体补充合成气，以富集CO(如，钢铁厂废气富含CO)或H2的水平。本发明的Clostridium coskatii必需在厌氧条件下培养。“厌氧条件”意为在气相中，氧(O2)的水平低于百万分之零点五。用于由等式(I)或(3)所表示的反应的H2O的来源一般为其中培养生物的含水培养基。总之，用于培养本发明的产乙酸菌的经优化的乙醇产生培养基是化学限定的液体培养基。然而本领域技术人员认为，可以使用备选的培养基，例如在H2 = CO2和C0:C02大气下，初始PH为6的ATCC培养基1045。此外，对于任意的几种目的，可以加入多种培养基补充剂，例如，缓冲剂、金属、维生素和盐。特别地，作为营养操作和生理适应，本领域技术人员熟悉此类技术，其导致了生物产物增加的或优化的产率。例如，在“限制生长”条件(即减缓细菌生长和繁殖的速率的条件)下培养产溶剂的微生物导致了高度还原的发酵产物例如乙醇的增强的产生。这可能是因为在限制生长条件下，增加了可用的还原等价物(还原的铁氧还蛋白、NADH或NADPH)与可用的碳的比率，并且增加的还原能力转向了乙酰辅酶A或有机酸的化学还原，从而形成了醇。限制生长条件的实例包括，例如在非最佳温度或PH下维持培养物，和限制营养物和碳源。通常，在培养物中达到期望的细菌密度后施行非生长条件。本领域技术人员熟悉用于优化产生期望的产物的方法，并且本发明意图包括使用Clostridium coskatii (PS02)的全部此类经优化的方法。特别地，可以使用Balch 技术(Balch 和 Wolfe, 1976, Appl. Environ.Microbiol. 32 :781-791 ;Balch 等人，1979，Microbiol. Rev. 43 :260-296)培养 Clostridiumcoskatii (PS02)。其需要用于制备培养物质的厌氧培养室和气体交换歧管的帮助，以建立期望在密封的管或器皿中的培养的任何气相。有关培养产生产乙酸菌的溶剂的更具体的细节，例如酸性 pH 的使用，显示于 Tanner 等人，1993, Int. J. Syst. Bacteriol. 43 :232-236 和Liou 等人，2005，Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 55 :2085-2091 中。增强乙醇产生的方法包括优化关键的培养基组分(例如铁、磷酸盐和维生素)、控制培养pH、随机诱变细菌然后克隆筛选或者细菌的遗传改造。可以在另外修饰或者不另外修饰的情况下，在本领域技术人员已知的任意几种类型的装置中或者在当前正在研发的其他类型的发酵设备中，实施提供给Clostridium coskatii (PS02)发酵的气体(CO和/或H2和CO2)的代谢。实例包括但不限于泡罩塔反应器、两级生物反应器、滴流床反应器、膜反应器、含有固定化细胞的填充床反应器等。此类装置的主要要求包括(I)Axenicity ；(2)厌氧条件；(3)维持温度、压力和pH的合适条件；(4)提供给培养物的底物的足够数量；(5)可以容易地从细菌培养液中回收发酵的终产物。反应器可以例如是，常规的搅拌釜反应器、具有固定化的或者悬浮的细胞的柱发酵罐、连续流动型反应器、高压反应器、具有细胞再循环的悬浮细胞反应器，以及以前所列的其他实例。此外，反应器可以是以串联和/或并联排列的反应器系统，其含有任意的上述反应器。例如，可以将多个反应器用于在一种设定条件下培养细胞，并在另一种设定条件下，在最低生长的情况下产生乙醇(或其他产物)。总之，允许进行发酵，直到在培养基中产生了期望水平的产物例如乙醇。通常，该水平的乙醇在至少15克/升至50克/升培养基的范围内，其中优选的是至少30克/升的水平。Clostridiumcoskatii (PS02)仍是存活的,并且可以在至少60克/升的乙醇浓度中生长。备选地，当实现了一定速率的产生时，例如，当由于例如细菌废产物的积累、底物可用性的降低、产物的反馈抑制、存活细菌的数目降低或者本领域技术人员已知的任一几种其他原因，期望产物的产生速率降低时，可以中止生产。此外，存在连续的培养技术，其允许连续补充新鲜的培养基，同时去除已使用的培养基，包括其中的任一液体产物的情况下(即恒化器模式)。可以从培养物中去除由本发明的细菌产生的产物，并通过本领域技术人员已知的任一几种方法纯化。例如，可以去除乙醇并进一步加工，例如通过溶剂提取；蒸馏至共沸混合物然后共沸蒸馏；分子筛脱水；全蒸发；或流经沸石管。本领域技术人员将认识到，在工业中用于乙醇脱水然后蒸馏的两种主要技术是共沸蒸馏和分子筛脱水。此外，取决于产物的数量，需要应用几种分离技术，以获得若干纯的产物。同样地，可以通过相似的方法去除乙酸盐并进一步加工。Clostridium coskatii (PS02)获自在 125mL 血清管中，在 C0:H2:N2:C02(7:37:33:23摩尔%)的大气和初始ρΗ6· O下，使用Acetogen C3培养基，例如下文所述，通过以前所述的方法(Bryant, 1972),用收集自 Coskata-Coatue Wildlife Refuge inNantucket,Massachusetts的河口沉积物接种的厌氧富集物。使用Acetogen C3培养基和H2 (5%)、C02 (10%)和队(85%)的大气，从挑选自含琼脂的(15%w: V)培养皿的单个菌落分离物中获得的生物质中，制备主细胞库。该细菌在2009年12月10日，作为菌株ATCC号PTA-10522保藏于美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)。几种系统发生不同组别的厌氧细菌具有将CO、CO2和H2转化成多种商业上重要的产物，包括乙酸、乙醇、丁酸、丁醇和氢的能力。选定的亚组，产乙醇梭菌属表现出同时利用氢和一氧化碳形成乙醇(当使用二氧化碳作为碳源时，形成少量乙酸)的独特能力。已经分析了 Clostridium coskatii (PS02)的系统发生、形态学和生物化学特性,并与其他相似的梭菌属物种进行了比较。 在该比较研究中使用的其他梭菌属物种包括扬氏梭菌PETC (ATCC号49587或DSMZ 号 I3528) ；C. ragsdalei (ATCC BAA-622) ；C. autoethanogenum (DSMZ 号 ΙΟΟΘΙ);扬氏梭菌(C. Ijundgahlii)ERI-2 (ATCC 号 55380);和扬氏梭菌 C-Ol (ATCC 号 55988)。ATCC样品获自美国典型培养物保藏中心(ATCC ;Manassas，VA)。DSMZ样品获自德意志微生物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen) (DSMZ) GmbH(Braunschweig,德国)。然而，自2010年2月I日起,扬氏梭菌0_52不再是公共可获得的，因为保藏者终止了对美国典型培养物保藏中心的供应活动。实施例I-细胞形态学Clostridium coskatii (PS02)的菌落表现为环形,颜色为白色至半透明，并且在Acetogen C3琼脂板的中央轻微凸起。当菌落龄期超过6_7天,颜色加深至褐色或者浅褐色。Clostridium coskatii (PS02)的细胞很少移动，棒状、革兰氏染色阳性，并且单独地或者成串地出现。在C. coskatii细胞的薄切片的电子显微照片中，可以看见与40-45nm细胞壁一致的外层细胞结构，其支持了革兰氏阳性分配。在指数生长早期中，细胞为O. 75μπιΧ3-4μπι并且是有周生鞭毛的(图I)。孢子偶尔存在，但当存在时，表现为中部-末端至末端膨胀，并且通常为球棒状外型(图2)。孢子形态学的该特性与热醋穆尔氏菌(Moorella thermoacetica) (Drake 等人，2006)相似，但显著不同于 Clostridiumautoethanogenum (Abrini 等人，1994)或者 Clostridium ragsdalei (Huhnke 等人,2008)所观察到的未膨胀的孢子形态学。对指数生长早期和晚期中细胞的电子显微照片的比较显示，细胞在生长的晚期增加了其长度(图3)。对于表现出高体积乙醇浓度的老化批培养物(aged batch culture),观察到了伸长多达20-30 μ m的细胞,并显示出与生理胁迫相关，因为当转移到新鲜培养基时，这些细胞并不容易回收。在伸长的细胞中没有观察到孢子形成，其可能促进不能回收这些细胞。将Acetogen C3培养基用于启动取自冻干的或者冰冻的主细胞库(ImL当量体积)的经保存的培养物。在37°C温度下，在100转/分钟的定轨摇床(5cm摇动振幅)上培养该实施例中所使用的培养物。使用由Balch和Wolfe (1976)所述的严格厌氧技术制备培养基，如在下表A、B、D和E中所详述。灭菌后，将无氧的维生素溶液(表C)无菌地加入到瓶中，并使用104kPa (15psig)的最终压力，将每一瓶的顶部空间用由C0:H2:N2:C02 ( 7 : 37 : 33 : 23摩尔％)组成的气体混合物交换。标准接种量为10% (v/v),其转移自生长于指数期中期至晚期的储用培养物。使用浓度为20g/L (pH 6. O)的 2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES ;在 37V, pK=5. 97)控制分批发酵的pH。作为MES的替代物，可以使用浓度为20g/L的以下缓冲液来进行pH生长最适值研究MES (pH 4-6. 5)、哌嗪-N，N’ - 二(2-乙磺酸(PIPES ；pH 6. 6-7. 5 ;在 37°C下，pKa=6. 66)和三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS ；pH7. 5-8. 5 ;在 37°C,pKa=7. 72)。表A:矿物质贮存液
项目组分量，g/L
~ NaCl80
2NH4Cl
3KCl10 ~ KH2PO4 10
5MgSO4. 7H20 20
~6CaCl2. 2H20 4表B:痕量金属贮存液
项目组分量，g/L
~盐酸，12. IN2.360
2MnSO4. H2O170
3FeSO4. 7H20~2~CoCl2.6H200 2
5ZnSO4. 7Η20Γ0
~6NiCl2.6Η200 2
~Na2MoO4. 2Η200 02
8Na2SeO4O. I
~9Na2WO402表C :维生素贮存液
权利要求
1.微生物Clostridiumcoskatii的生物学纯的培养物，其具有ATCC号PTA-10522的全部鉴定特征。
2.微生物Clostridiumcoskatii, ATCC号PTA-10522的生物学纯的培养物，其具有在厌氧条件下从选自一氧化碳、二氧化碳和氢或它们的组合的气体底物中产生乙醇的能力。
3.权利要求2的生物学纯的培养物，其中所述气体底物通过合成气提供。
4.微生物Clostridiumcoskatii, ATCC号PTA-10522的生物学纯的培养物，其具有在厌氧条件下从选自一氧化碳、二氧化碳和氢或它们的组合的气体底物中产生乙酸的能力。
5.权利要求4的生物学纯的培养物，其中所述气体底物通过合成气提供。
6.微生物Clostridiumcoskatii, ATCC号PTA-10522的生物学纯的培养物，其具有从包含碳源的厌氧含水营养培养基中产生乙醇的能力。
7.权利要求6的生物学纯的培养物，其中所述碳源不是有机复杂碳源。
8.权利要求6的生物学纯的培养物，其中所述碳源不是酵母提取物。
9.微生物Clostridiumcoskatii, ATCC号PTA-10522的生物学纯的培养物，其具有从由有机碳源组成的厌氧含水营养培养基中生物合成乙酸的能力。
10.微生物Clostridiumcoskatii的生物学纯的培养物，其具有如SEQ ID NO. I、SEQID NO. 2 和 SEQ ID NO. 3 中给出的 16S rDNA 序列。
11.微生物Clostridiumcoskatii的生物学纯的培养物,其具有在每毫升100 μ g氯霉素抗生素存在下生长的能力。
12.产生乙醇的方法,其包括在允许Clostridiumcoskatii将碳源转化成乙醇的条件下，组合碳源、电子源和Clostridium coskatii的步骤。
13.权利要求10的方法，其中所述碳源是C02。
14.权利要求10的方法，其中所述碳源是有机碳。
15.权利要求10的方法，其中所述电子源是H2或CO。
全文摘要
本发明提供了新的梭菌属细菌物种(Clostridium coskatii ATCC号PTA-10522，“PS02”)。在厌氧条件下，C.coskatii可以将CO和/或H2和/或CO2转化成乙醇或乙酸。从而，该新的细菌能将废气(例如，合成气和炼油厂废气)转变成有用的产物。
文档编号C12R1/145GK102939372SQ201180014236
公开日2013年2月20日 申请日期2011年3月16日 优先权日2010年3月19日
发明者J·A·扎恩, J·萨克塞纳 申请人:科斯卡塔公司