专利名称：C型产气荚膜梭菌β的制作方法
技术领域：
本发明属于微生物学与分子生物学研究领域，特别是一种C型产气荚膜梭菌β2毒素突变基因。
背景技术：
C型产气荚梭菌(Clostridum perfringens type C)是引起多种动物坏死性肠炎和肠毒血症的主要病原菌，其致病因子主要是菌体产生的外毒素，其中，β毒素就是由其产生的一种坏死性和致死性毒素，长期以来一直以为C型菌只产生一种β毒素(现称为β1毒素)，而且是其主要的毒力因子；因此，虽然国内外学者对其进行了较详尽的研究，并研制开发了一些生物制品用于动物坏死性肠炎和肠毒血症的免疫预防，但免疫效果却不十分理想。直至1997年，法国巴斯德研究所的Gibert等首次报道，从一株分离自仔猪坏死性肠炎病例的C型产气荚膜梭菌(CWC245)的培养上清液中纯化到一种毒素，由于该毒素的分子量等理化性质不同于通常所说的β毒素，为了便于区别，作者将该毒素称为β2毒素，而把最初发现的β毒素称为β1毒素。在此基础上，他们从法国C型产气荚膜梭菌标准株CWC245基因组DNA中克隆了β2毒素基因，并进行了核苷酸序列的测定。但是，我国境内动物坏死性肠炎和肠毒血症的病原菌主要为C型产气荚膜梭菌的中国株，而不是CWC245等外国菌株，因此，为了解决困扰我国畜牧业发展的动物坏死性肠炎和肠毒血症的免疫预防问题，必须对C型产气荚膜梭菌中国标准株产生的β2毒素的基因结构、分子组成、生物学活性及免疫原性等性状进行详尽的研究。
发明内容
本发明的目的是通过采用PCR和基因点突变技术提供一种C型产气荚膜梭菌β2毒素突变基因。
本发明的目的按下述方案实现一种C型产气荚膜梭菌β2毒素突变基因，其特征在于其核苷酸序列如下图所示AAA GAA ATC GAC GCT TAT AGA AAG GTA ATG GAG AAT TAT CTTAAT GCT TTA AAA AAC TAC GAT ATT AAT ACA GTT GTA AAC ATTTCA GAA GAT GAA AGA GTA AAT AAT GTT GAA CAG TAT AGA GAAATG TTA GAA GAT TTT AAA TAT GAT CCT AAC CAA CAA CTG AAATCT TTT GAA ATA CTT AAT TCA CAA AAG AGC GAT AAT AAA GAAATA TTT AAT GTA AAA ACT GAA TTT TTA AAT GGT GCA ATT TATGAT ATG GAA TTT ACT GTA TCA TCT AAA GAT GGAAAA TTAATA GTA TCT GAT ATG GAA AGA ACA AAA ATT GAG AAT GAA GGA
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本发明克隆了由C型产气荚膜梭菌中国标准株C59-44产生的β2毒素突变基因，分析了其核苷酸序列，为进一步开展β2毒素的基因结构、分子组成、生物学活性及免疫原性等性状的研究以及研制相应的基因工程亚单位疫苗，解决困扰我国畜牧业发展的动物坏死性肠炎和肠毒血症的免疫预防问题，提供了理想的基因材料。
具体实施例方式
根据β2毒素基因的核苷酸序列，设计并合成了两条突变引物，引物15’-CATGCCATGGCAAAAGAAATCGACGCTTAT-3’引物25’-CTATGCACCATACCCTTCACCAAATAC-3’本发明是采用PCR和基因点突变技术，从C型产气荚膜梭菌中国标准株C59-44基因组DNA中克隆了β2毒素基因，大小为705bp；对β2毒素基因第700位碱基进行突变，并将其克隆到pGEM-T载体上，转化至受体菌JM109中；采用碱裂解法提取重组质粒后，经Nco I/Hind III双酶切鉴定及核苷酸序列测定，结果表明已将700位碱基T突变成G，导致编码的氨基酸残基由半胱氨基残基(Cys)变成甘氨基酸残基(Gly)。
权利要求
1.一种C型产气荚膜梭菌β2毒素突变基因，其特征在于其核苷酸序列如下图所示AAA GAA ATC GAC GCT TAT AGA AAG GTA ATG GAG AAT TAT CTTAAT GCT TTA AAA AAC TAC GAT ATT AAT ACA GTT GTA AAC ATTTCA GAA GAT GAA AGA GTA AAT AAT GTT GAA CAG TAT AGA GAAATG TTA GAA GAT TTT AAA TAT GAT CCT AAC CAA CAA CTG AAATCT TTT GAA ATA CTT AAT TCA CAA AAG AGC GAT AAT AAA GAAATA TTT AAT GTA AAA ACT GAA TTT TTA AAT GGT GCA ATT TATGAT ATG GAA TTT ACT GTA TCA TCT AAA GAT GGA AAA TTA ATAGTA TCT GAT ATG GAA AGA ACA AAA ATT GAG AAT GAA GGA AAATAT ATT TTA ACA CCA TCA TTT AGA ACT CAA GTT TGT ACA TGGGAT GAT GAA CTA GCA CAA GCA ATT GGG GGA GTT TAT CCA CAAACA TAT TCT GAT AGA TTT ACA TAT TAT GCA GAT AAT ATA TTATTA AAC TTC AGA CAA TAT GCA ACT TCA GGT TCA AGA GAT TTAAAA GTA GAA TAT AGT GTT GTA GAT CAT TGG ATG TGG AAA GATGAT GTT AAA GCT TCT CAA ATG GTA TAT GGT CAA AAT CCT GATTCT GCT AGA CAA ATA AGA TTA TAT ATA GAA AAA GGA CAA TCTTTC TAT AAA TAT AGA ATA AGA ATT AAA AAC TTT ACA CCT GCATCA ATT AGA GTA TTT GGT GAA GGG TAT GGT GCA。
2.如权利要求1所述的C型产气荚膜梭菌β2毒素突变基因，其特征在于其提取方法是采用PCR和基因点突变技术，从C型产气荚膜梭菌中国标准株C59-44基因组DNA中克隆了β2毒素基因，大小为705bp，对β2毒素基因第700位碱基进行突变，并将其克隆到pGEM-T载体上，转化至保藏的名称为JM109受体菌中(保藏号CGMCCNo.1020)。
全文摘要
本发明是一种C型产气荚膜梭菌β
文档编号C07H21/04GK1554771SQ20031012369
公开日2004年12月15日 申请日期2003年12月19日 优先权日2003年12月19日
发明者王玉炯, 许崇波, 邓光存, 曾瑾 申请人:宁夏大学