将单链蛋白质细胞内转化成它们的双链形式的方法

专利名称：：将单链蛋白质细胞内转化成它们的双链形式的方法将单链蛋白质细胞内转化成它们的双链形式的方法本专利申请根据35U.S.C.§119(e)要求2010年I月25日提交的美国临时专利申请系列第61/286，963号的优先权，所述美国临时专利申请通过引用整体并入本文。梭菌毒素例如肉毒神经毒素(BoNT)、BoNT/A、BoNT/B、BoNT/Cl、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F和BoNT/G以及破伤风神经毒素(TeNT)抑制神经元传递(neuronaltransmission)的能力正被开发利用于各种治疗性和美容性应用，参见，例如，WilliamJ-Lipham,Cosmetic励ClinicalApplicationsofBotulinumToxin(Slack，Inc.,2004)。作为药物组合物商购可得的梭菌毒素包括BoNT/A制剂,例如BOTOXrI(Allergan,Inc.，Irvine,CA)、DYSPORTifcZRELOXiNft(BeaufourIpsen,PortonDown,England)、NEURONOX".)Medy-Tox,Inc.,Ochang-myeon,SouthKorea)>BTX-A(LanzhouInstituteBiologicalProducts,China)和X—EOMIN*MerzPharmaceuticals,GmbH.,Frankfurt,Germany)；和BoNT/B制剂，例如MY0BL0CTM/NEUR0BL0CTM(ElanPharmaceuticals,SanFrancisco,CA)。例如，botgx'k目前在一个或多个国家被批准用于下列适应征失弛缓症，成人痉挛状态(adultspasticity)、肛裂、背痛、眼睑痉挛、夜磨牙症、颈肌张力障碍、特发性震颤、眉间纹或面部动力性皱纹(hyperkineticfacialline)、头痛、半面疫挛、膀胱机能允进(hyperactivityofbladder)、多汗症、儿童脑性瘫痪(juvenilecerebralpalsy)、多发性硬化、肌阵挛病症(myoclonicdisorder)、鼻唇纹(nasallabialline)、疫挛性发音困难(spasmodicdysphonia)、斜视和第七神经障碍(VIInervedisorder)。梭菌毒素的治疗性功用，除了它们目前松弛肌肉的应用外，已被扩展至治疗基于感觉神经的疾病例如各种慢性疼痛、神经源性炎症和泌尿生殖系统病症以及基于非神经元的病症例如胰腺炎。目前正被开发以扩展基于梭菌毒素的治疗的一个方法包括修饰梭菌毒素以便经修饰的毒素具有针对非-梭菌毒素靶细胞改变细胞靶向的能力。该重新靶向的(re-targeted)能力通过用显示对存在于非-梭菌毒素靶细胞中的非_梭菌毒素受体的选择性结合活性的靶向结构域替代梭菌毒素的天然存在的靶向结构域来实现。对靶向结构域的此类修饰导致能够选择性结合存在于非-梭菌毒素靶细胞上的非-梭菌毒素受体(靶受体)(重新靶向的)的经修饰的毒素。具有针对非-梭菌毒素靶细胞的靶向活性的重新靶向的梭菌毒素可结合非-梭菌毒素靶细胞上的受体，转位至细胞质中，以及对非-梭菌毒素靶细胞的SNARE复合物施加其蛋白水解作用。具有针对非-梭菌毒素靶细胞的靶向活性的重新靶向的梭菌毒素的非限定性实例描述于例如KeithA.Foster等人，ClostridialToxinDerivativesAbleToModifyPeripheralSensoryAfferentFunctions,美国专利5，989，545;CliffordC.Shone等人，RecombinantToxinFragments,美国专利6,461,617；StephanDonovan,ClostridialToxinDerivativesandMethodsForTreatingPain,美国专利6,500,436；ConradP.Quinn等人,MethodsandCompoundsfortheTreatmentofMucusHypersecretion,美国专利6，632，440；LanceE.Steward等人,MethodsAndCompositionsForTheTreatmentOfPancreatitis,美国专利6，843，998;J.OliverDolly等人，ActivatableRecombinantNeurotoxins,美国专利7,419,676；LanceE.Steward等人，MultivalentClostridialToxinDerivativesandMethodsofTheirUse,美国专利7，514，088;KeithA.Foster等人，InhibitionofSecretionfromNon-neuralCells,美国专利公布2003/0180289;和KeithA.Foster等人，Re-targetedToxinConjugates,国际专利公布W02005/023309。重新靶向的与梭菌毒素相关的治疗作用的能力已极大地扩展能够使用梭菌毒素疗法的医学应用的数目。作为非限定性实例，重新靶向感觉神经元的经修饰的梭菌毒素在治疗各种类型的慢性疼痛例如痛觉过敏和异常性疼痛、神经性疼痛和炎症疼痛中是有用的，参见，例如，Foster,同上，(1999);和Donovan,同上，(2002);以及StephanDonovan,MethodForTreatingNeurogenicInflammationPainwithBotulinumToxinandSubstancePComponents，美国专利7，022，329。作为另一个非限定性实例，重新靶向的胰腺细胞的经修饰的梭菌毒素在治疗胰腺炎中是有用的，参见，例如，Steward,同上，(2005)。梭菌毒素，无论是天然存在的还是经修饰的，都被加工成双链形式以获得完全活性。天然存在的梭菌毒素各自被翻译为约150kDa的单链多肽，所述单链多肽随后在二硫环内被天然存在的蛋白酶蛋白水解而裂解(图I)。该裂解在形成二硫桥的两个半胱氨酸残基之间产生的不连续双链环区域中发生。该翻译后加工产生包含约50kDa的轻链(LC)(其包含酶促结构域)和约IOOkDa的重链(HC)(其包含转位和细胞结合结构域)的双链分子，LC和HC通过单个二硫键和非共价相互作用保持在一起(图I)。重组产生的梭菌毒素通常用外源蛋白酶裂解位点替代天然存在的双链环蛋白酶裂解位点(图2)。参见，例如，Dolly，J.0.等人，ActivatableClostridialToxin,美国专利7，419，676,其通过引用将其并入本文。虽然重新靶向的梭菌毒素由于靶向部分的大小而在其总体分子量上发生变化，但活化过程及其对外源裂解位点的依赖性与重组产生的梭菌毒素的活化过程及其对外源裂解位点的依赖性基本上相同。参见,例如，Steward,L.E.等人，ActivatableClostridialToxin,美国专利公布2009/0005313;Steward,L.Ε·等人，ModifiedClostridialToxinwithEnhancedTranslocationCapabilitiesandAlteredTargetingActivityForNon-ClostridialToxinTargetCells,美国专利申请11/776，075;Steward,L.E.等人，ModifiedClostridialToxinwithEnhancedTranslocationCapabilitiesandAlteredTargetingActivityforClostridialToxinTargetCells,美国专利公布2008/0241881，将所述每个专利通过弓I用并入本文。迄今为止，重组产生的梭菌毒素或经修饰的梭菌毒素的单链形式至其双链形式的转化需要体外活化过程。首先，用于重组产生此类毒素的细菌细胞缺乏存在于产生天然毒素的梭菌属(Clostridial)菌株中的天然存在的蛋白酶。其次，出于在处理活化毒素中产生的安全顾虑，不存在对重组产生活化毒素的细菌细胞的大量需要。参见，例如，Dolly,U.S.7，419，676，同上，(2008)。然而，如果这些顾虑可被克服，则重组产生的活化毒素的产生可使重组产生的梭菌毒素或经修饰的梭菌毒素的制备过程简化。例如，目前重组产生的梭菌毒素或经修饰的梭菌毒素的制备包括下列纯化步骤I)固定金属亲和层析，2)缓冲液交换透析，3)蛋白酶裂解反应，4)离子交换层析和5)PEG的添加以及快速冷冻以在-80°C下贮存。可细胞内蛋白水解裂解重组梭菌毒素同时其仍然表达毒素的细菌细胞的使用将纯化步骤的数目减少至下列步骤1)固定金属亲和层析，2)缓冲液交换透析，3)离子交换层析，和4)PEG的添加以及快速冷冻以在_80°C下贮存。本说明书公开了将包含双链环区域的单链蛋白质转化成其双链形式的方法，所述方法不依赖于用于将毒素的单链形式转化成其双链形式的体外加工。这可通过使用表达蛋白质和将其转化成活性双链所必需的蛋白酶的细胞来实现。因此，本说明书的方面提供了双重表达构建体，所述构建体包括编码包含含有外源蛋白酶裂解位点的双链环区域的单链蛋白质的开放阅读框和编码可蛋白水解裂解位于双链环区域中的外源蛋白酶裂解位点的蛋白酶的开放阅读框。在其它方面，包含含有外源蛋白酶裂解位点的双链环区域的单链蛋白质可以是例如包含含有外源蛋白酶裂解位点的双链环区域的梭菌毒素、包含含有外源蛋白酶裂解位点的双链环区域的经修饰的梭菌毒素或包含梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、非-梭菌毒素结合结构域和含有外源蛋白酶裂解位点的双链环区域的单链蛋白质。多核苷酸以及它们编码的包含含有外源蛋白酶裂解位点的双链环区域的梭菌毒素描述于例如Dolly，J.O.等人，ActivatableClostridialToxin,美国专利7，132，259;Dolly,J.O.等人，ActivatableClostridialToxin，美国专利7，419，676(将所述每个专利通过引用整体并入本文)中。多核苷酸以及它们编码的包含梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、非-梭菌毒素结合结构域和含有外源蛋白酶裂解位点的双链环区域的蛋白质描述于例如Steward,L.E.等人，MultivalentClostridialToxin,美国专利公布2009/0048431；Steward,L.E.等人，ActivatableClostridalToxin,美国专利公布2009/0069238；Steward,L.E.等人，ModifiedClostridialToxinwithEnhancedTranslocationCapabilitiesandAlteredTargetingActivityForNon-ClostridialToxinTargetCells,美国专利申请11/776,075；Steward,L.E.等人，ModifiedClostridialToxinwithEnhancedTranslocationCapabilitiesandAlteredTargetingActivityforClostridialToxinTargetCells,美国专利公布2008/0241881;Foster,Κ.A.等人，FusionProteins,美国专利公布2009/0035822;Foster,Κ·A.等人，Non-CytotoxicProteinConjugates,美国专利公布2009/0162341;Steward,L.E.等人，ActivatableClostridialToxin,美国专利公布2008/0032931;Foster,Κ·A.等人，Non-CytotoxicProteinConjugates,美国专利公布2008/0187960;Steward,L.E.等人，DegradableClostridialToxin,美国专利公布2008/0213830;Steward,L.E.等人，ModifiedClostridialToxinWithEnhancedTranslocationCapabilitiesandAlteredTargetingActivityForClostridialToxinTargetCells,美国专利公布2008/0241881;Dolly,J.0.等人，ActivatableClostridialToxin,美国专利7,419,676；和同伴专利申请Ghanshani等人，ModifiedClostridialToxinComprisinganIntegratedProteaseCleavageSite-BindingDomain,AttorneyDocketNo.18468PR0V(BOT)(将所述每个专利通过引用整体并入本文)中。本说明书的其它方面提供了包含双重表达构建体的细胞，所述构建体包括编码包含含有外源蛋白酶裂解位点的双链环区域的单链蛋白质的开放阅读框和编码可蛋白水解裂解位于双链环区域中的外源蛋白酶裂解位点的蛋白酶的开放阅读框。在其它方面，包含含有外源蛋白酶裂解位点的双链环区域的单链蛋白质可以是例如包含含有外源蛋白酶裂解位点的双链环区域的梭菌毒素、包含含有外源蛋白酶裂解位点的双链环区域的经修饰的梭菌毒素、或包含梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、非-梭菌毒素结合结构域和包含本说明书中公开的外源蛋白酶裂解位点的双链环区域的单链蛋白质。本说明书的其它方面提供了将单链蛋白质转化成其双链形式的细胞内方法，所述方法包括步骤a)将包含双重表达构建体的细胞在第一温度下生长一定的时间段以达到最大细胞密度，所述双重表达构建体包含；i)编码包含含有外源蛋白酶裂解位点的双链环区域的单链蛋白质的开放阅读框；和ii)编码蛋白酶的开放阅读框；其中所述蛋白酶可裂解位于双链环内的外源蛋白酶裂解位点；b)将细胞在第二温度下生长一定的时间段以达到从编码单链蛋白质的开放阅读框进行蛋白质表达的最大诱导，其中在步骤(b)中的生长诱导单链蛋白质和蛋白酶从双重表达构建体表达；并且其中所产生的蛋白酶在位于双链环区域内的外源蛋白酶裂解位点上裂解单链蛋白质，从而将单链蛋白质转化成其双链形式。本说明书的其它方面提供了将单链梭菌毒素转化成其双链形式的细胞内方法，所述方法包括步骤a)将包含双重表达构建体的细胞在37°C下生长约2至约3.5小时，所述双重表达构建体包含；i)编码单链梭菌毒素的开放阅读框，所述单链梭菌毒素包含酶促结构域、转位结构域、结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域；和ii)编码蛋白酶的开放阅读框，其中所述蛋白酶可裂解位于双链环内的外源蛋白酶裂解位点；b)将细胞在22°C下生长约16至约18小时，其中在步骤(b)中的生长诱导单链梭菌毒素和蛋白酶从双重表达构建体表达；并且其中所产生的蛋白酶在位于双链环区域内的外源蛋白酶裂解位点上裂解单链梭菌毒素，从而将单链梭菌毒素转化成其双链形式。本发说明书的其它方面提供了将单链蛋白质转化成其双链形式其双链形式的细胞内方法，所述方法包括步骤a)将包含双重表达构建体的细胞在37°C下生长约2至约8个小时，所述双重表达构建体包含；i)编码单链蛋白质的开放阅读框，所述单链蛋白质包含酶促结构域、转位结构域和整合的TEV蛋白酶裂解位点-阿片样物质结合结构域；和ii)编码TEV蛋白酶的开放阅读框；b)将细胞在约12至约16°C下生长约16至约18小时，其中在步骤(b)中的生长诱导单链蛋白质和TEV蛋白酶从双重表达构建体表达；并且其中所产生的TEV蛋白酶在位于整合的TEV裂解位点阿片样物质结合结构域内的TEV蛋白酶裂解位点上裂解单链蛋白质，从而将单链蛋白质转化成其双链形式。本说明书的其它方面提供了将单链蛋白质转化成其双链形式的细胞内方法，所述方法包括步骤a)将包含双重表达构建体的细胞在37°C下生长约2至约8小时，所述双重表达构建体包含；i)编码单链蛋白质的开放阅读框，所述单链蛋白质包含酶促结构域、转位结构域和整合的TEV蛋白酶裂解位点-阿片样物质结合结构域；和ii)编码TEV蛋白酶的开放阅读框山)将细胞在约20至约24°C下生长约16至约18小时，其中在步骤(b)中的生长诱导单链蛋白质和TEV蛋白酶从双重表达构建体表达；并且其中所产生的TEV蛋白酶在位于整合的TEV裂解位点阿片样物质结合结构域内的TEV蛋白酶裂解位点上裂解单链蛋白质，从而将单链蛋白质转化成其双链形式。本说明书的其它方面提供了将单链蛋白质转化成其双链形式的细胞内方法，所述方法包括步骤a)将包含双重表达构建体的细胞在37°C下生长约2至约8小时，所述双重表达构建体包含；i)编码单链蛋白质的开放阅读框，所述单链蛋白质包含酶促结构域、转位结构域非-梭菌毒素结合结构域以及包含TEV蛋白酶裂解位点的双链环区域；和ii)编码TEV蛋白酶的开放阅读框；b)将细胞在约12至约16°C下生长约16至约18小时，其中在步骤(b)中的生长诱导单链蛋白质和TEV蛋白酶从双重表达构建体表达；并且其中所产生的TEV蛋白酶在位于双链环区域内的TEV蛋白酶裂解位点上裂解单链蛋白质，从而将单链蛋白质转化成其双链形式。本说明书的其它方面提供了将单链蛋白质转化成其双链形式的细胞内方法，所述方法包括步骤a)将包含双重表达构建体的细胞在37°C下生长约2至约8小时，所述双重表达构建体包含；i)编码单链蛋白质的开放阅读框，所述单链蛋白质包含酶促结构域、转位结构域、非-梭菌毒素结合结构域以及包含TEV蛋白酶裂解位点的双链环区域jPii)编码TEV蛋白酶的开放阅读框；b)将细胞在约20至约24°C下生长约16至约18小时，其中在步骤(b)中的生长诱导单链蛋白质和TEV蛋白酶从双重表达构建体表达；并且其中所产生的TEV蛋白酶在位于双链环区域内的TEV蛋白酶裂解位点上裂解单链蛋白质，从而将单链蛋白质转化成其双链形式。本说明书的其它方面提供了表达构建体，所述表达构建体包含编码单链蛋白质的开放阅读框，所述单链蛋白质包含含有外源蛋白酶裂解位点的双链环区域。在其它方面，包含含有外源蛋白酶裂解位点的双链环区域的单链蛋白质可以是例如包含含有外源蛋白酶裂解位点的双链环区域的梭菌毒素、包含含有外源蛋白酶裂解位点的双链环区域的经修饰的梭菌毒素、或包含梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、非-梭菌毒素结合结构域以及包含本说明书中公开的外源蛋白酶裂解位点的双链环区域的单链蛋白质。本说明书的其它方面提供了表达构建体，所述表达构建体包含编码蛋白酶的开放阅读框，所述蛋白酶可蛋白水解裂解位于包含含有外源蛋白酶裂解位点的双链环区域的单链蛋白质的双链环区域中的外源蛋白酶裂解位点。本说明书的其它方面提供了细胞，所述细胞包含含有编码单链蛋白质(所述单链蛋白质包含含有外源蛋白酶裂解位点的双链环区域)的开放阅读框的表达构建体和含有编码蛋白酶(所述蛋白酶可蛋白水解裂解位于包含含有外源蛋白酶裂解位点的双链环区域的单链蛋白质的双链环区域内的外源蛋白酶裂解位点)的开放阅读框的另一个表达构建体。在其它方面，包含含有外源蛋白酶裂解位点的双链环区域的单链蛋白质可以是例如包含含有外源蛋白酶裂解位点的双链环区域的梭菌毒素、包含含有外源蛋白酶裂解位点的双链环区域的经修饰的梭菌毒素、或包含梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、非-梭菌毒素结合结构域以及包含本说明书中公开的外源蛋白酶裂解位点的双链环区域的单链蛋白质。本说明书的其它方面提供了将单链蛋白质转化成其双链形式的细胞内方法，所述方法包括步骤a)生长细胞，所述细胞包含i)含有编码单链蛋白质的开放阅读框的表达构建体，所述单链蛋白质包含含有外源蛋白酶裂解位点的双链环区域；和ii)含有编码蛋白酶的开放阅读框的另一个表达构建体；所述蛋白酶可蛋白水解裂解位于包含含有外源蛋白酶裂解位点的双链环区域的单链蛋白质的双链环区域内的外源蛋白酶裂解位点；b)将细胞在第二温度下生长一定的时间段以达到从编码单链蛋白质的开放阅读框进行蛋白质表达的最大诱导，其中在步骤(b)中的生长诱导单链蛋白质和蛋白酶从表达构建体表达；并且其中所产生的蛋白酶在位于双链环区域内的外源蛋白酶裂解位点上裂解单链蛋白质，从而将单链蛋白质转化成其双链形式。本说明书的其它方面提供了将单链梭菌毒素转化成其双链形式的细胞内方法，所述方法包括步骤a)将细胞在37°C下生长约2至约3.5小时，所述细胞包含i)含有编码单链梭菌毒素的开放阅读框的表达构建体，所述单链梭菌毒素包含酶促结构域、转位结构域、结合结构域以及包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域和ii)含有编码蛋白酶的开放阅读框的另一个表达构建体，所述蛋白酶可蛋白水解裂解位于包含含有外源蛋白酶裂解位点的双链环区域的单链蛋白质的双链环区域内的外源蛋白酶裂解位点山)将细胞在22°C下生长约16至约18小时，其中在步骤(b)中的生长诱导单链梭菌毒素和蛋白酶从表达构建体表达；并且其中所产生的蛋白酶在位于双链环区域内的外源蛋白酶裂解位点上裂解单链梭菌毒素，从而将单链梭菌毒素转化成其双链形式。本说明书的其它方面提供了将单链蛋白质转化成其双链形式的细胞内方法，所述方法包括步骤a)将细胞在37°C下生长约2至约8小时，所述细胞包含i)含有编码单链蛋白质的开放阅读框的表达构建体，所述单链蛋白质包含酶促结构域、转位结构域以及整合的TEV蛋白酶裂解位点-阿片样物质结合结构域，和ii)含有编码TEV蛋白酶的开放阅读框的另一个表达构建体山)将细胞在约12至约16°C下生长约16至约18小时，其中在步骤(b)中的生长诱导单链蛋白质和TEV蛋白酶从表达构建体表达；并且其中所产生的TEV蛋白酶在位于整合的TEV裂解位点阿片样物质结合结构域内的TEV蛋白酶裂解位点上裂解单链蛋白质，从而将单链蛋白质转化成其双链形式。本说明书的其它方面提供了将单链蛋白质转化成其双链形式的细胞内方法，所述方法包括步骤a)将细胞在37°C下生长约2至约8小时，所述细胞包含i)含有编码单链蛋白质的开放阅读框的表达构建体，所述单链蛋白质包含酶促结构域、转位结构域以及整合的TEV蛋白酶裂解位点-阿片样物质结合结构域，和ii)含有编码TEV蛋白酶的开放阅读框的另一个表达构建体山)将细胞在约20至约24°C下生长约16至约18小时，其中在步骤(b)中的生长诱导单链蛋白质和TEV蛋白酶从表达构建体表达；并且其中所产生的TEV蛋白酶在位于整合的TEV裂解位点阿片样物质结合结构域内的TEV蛋白酶裂解位点上裂解单链蛋白质，从而将单链蛋白质转化成其双链形式。本说明书的其它方面提供了将单链蛋白质转化成其双链形式的细胞内方法，所述方法包括步骤a)将细胞在37°C下生长约2至约8小时，所述细胞包含i)含有编码单链蛋白质的开放阅读框的表达构建体，所述单链蛋白质包含酶促结构域、转位结构域、非-梭菌毒素结合结构域以及包含TEV蛋白酶裂解位点的双链环区域，和ii)含有编码TEV蛋白酶的开放阅读框的另一个表达构建体山)将细胞在约12至约16°C下生长约16至约18小时，其中在步骤(b)中的生长诱导单链蛋白质和TEV蛋白酶从表达构建体表达；并且其中所产生的TEV蛋白酶在位于整合的TEV裂解位点阿片样物质结合结构域内的TEV蛋白酶裂解位点上裂解单链蛋白质，从而将单链蛋白质转化成其双链形式。本说明书的其它方面提供了将单链蛋白质转化成其双链形式的细胞内方法，所述方法包括步骤a)将细胞在37°C下生长约2至约8小时，所述细胞包含i)含有编码单链蛋白质的开放阅读框的表达构建体，所述单链蛋白质包含酶促结构域、转位结构域、非-梭菌毒素结合结构域以及包含TEV蛋白酶裂解位点的双链环区域，和ii)含有编码TEV蛋白酶的开放阅读框的另一个表达构建体山)将细胞在约20至约24°C下生长约16至约18小时，其中在步骤(b)中的生长诱导单链蛋白质和TEV蛋白酶从表达构建体表达；并且其中所产生的TEV蛋白酶在位于整合的TEV裂解位点阿片样物质结合结构域内的TEV蛋白酶裂解位点上裂解单链蛋白质，从而将单链蛋白质转化成其双链形式。附图简述图I显示天然存在的梭菌毒素的结构域组织。单链形式描述了包含酶促结构域、转位结构域和H。结合结构域的氨基至羧基的线性组织。位于转位与酶促结构域之间的双链环区域通过双SS托架(doubleSSbracket)来描述。该区域包含内源双链环蛋白酶裂解位点，所述裂解位点在用天然存在的蛋白酶例如内源梭菌毒素蛋白酶或环境中产生的天然存在的蛋白酶蛋白水解裂解后，将毒素的单链形式转化成双链形式。图2显示中枢和周围神经元中神经递质的释放和梭菌毒素中毒的目前范例的示意图。图2A显示中枢和周围神经元的神经递质释放机制的示意图。释放过程可被描述为包括两个步骤1)囊泡停靠(vesicledocking),其中包含神经递质分子的囊泡的囊泡结合的SNARE蛋白与位于质膜的膜结合SNARE蛋白结合；和2)神经递质释放，其中囊泡与质膜融合并且神经递质分子被胞吐。图2B显示中枢和周围神经元的破伤风和肉毒毒素活性的中毒机制的示意图。该中毒过程可被描述为包括4个步骤1)受体结合，其中梭菌毒素结合梭菌受体系统并且起始中毒过程；2)复合物内化，其中在毒素结合后，包含毒素/受体系统复合物的囊泡被胞吞入细胞；3)轻链转位，其中据认为发生多个事件，包括例如囊泡的内部pH的改变,包含梭菌毒素重链的Hn结构域的通道孔的形成,梭菌毒素轻链与重链的分离，以及活性轻链的释放，和4)酶促靶修饰，其中梭菌毒素的活性轻链蛋白水解裂解其靶SNARE底物例如SNAP-25、VAMP或突触融合蛋白，从而阻止囊泡的停靠和神经递质的释放。由肉毒梭菌(Clostridiumbotulinum)、破伤风梭菌(Clostridiumtetani)、巴氏梭菌(Clostridiumbaratii)和酪酸梭菌(Clostridiumbutyricum)产生的梭菌毒素被最广泛地用于人和其它动物的治疗性治疗和美容治疗。肉毒梭菌的菌株产生7个在抗原性上不同的类型的肉毒毒素(BoNT)，其已通过调查人(BoNT/A，/B，/E和/F)、动物(BoNT/Cl和/D)的肉毒中毒暴发被鉴定或从土壤分离(BoNT/G)。BoNT彼此具有约35%的氨基酸同一性并且共有相同的功能结构域组织和总体结构构造。本领域技术人员承认在每一种类型的梭菌毒素内，可存在在它们的氨基酸序列上以及也在编码此类蛋白质的核酸上少许不同的亚型。例如，目前存在4个BoNT/A亚型BoNT/Al、BoNT/A2、BoNT/A3和BoNT/A4，当与另一个BoNT/A亚型相比较时特定亚型显示约89%的氨基酸同一性。虽然所有7个BoNT血清型具有相似的结构和药理性质，但每一个血清型也显示异质的细菌学特征。相反地，破伤风毒素(TeNT)由均一组的破伤风梭菌产生。两个其它梭菌属种类巴氏梭菌和酪酸梭菌产生毒素BaNT和BuNT，所述毒素分别与BoNT/F和BoNT/E相似。每一个成熟双链分子包含3个功能上不同的结构域1)位于LC中的酶促结构域，其包括包含特异性祀向神经递质释放装置(neurotransmitterreleaseapparatus)的核心组分的锌依赖性内肽酶活性的金属蛋白酶区域；2)HC的氨基末端半部分内包含的转位结构域(Hn)，其帮助LC从细胞内囊泡至靶细胞的细胞质中的释放；和3)HC的羧基末端半部分内发现的结合结构域(H。)，其决定毒素对位于靶细胞的表面上的受体复合物的结合活性和结合特异性。Hc结构域包含两个具有大致相同尺寸的不同结构特征，所述结构特征显示功能并且被命名为Hcm和H。。亚结构域(subdomain)。表I提供了在示例性梭菌毒素中发现的每一个结构域的大致边界区域。表I.梭菌毒素的参照序列和区域这3个功能结构域的结合、转位和酶促活性全都是毒性所必需的。虽然该方法的所有细节尚未确知，但无论血清型或亚型如何，梭菌毒素籍以进入神经元并且抑制神经递质释放的总体细胞中毒机制是相似的。虽然申请者不希望受到下列描述的限制，但中毒机制可被描述为包括至少4个步骤1)受体结合，2)复合物内化，3)轻链转位，和4)酶促靶修饰(图3)。当梭菌毒素的Hc结构域结合位于靶细胞的质膜表面上的毒素特异性受体系统时，该过程被起始。受体复合物的结合特异性据认为部分地通过似乎明显地包含每种梭菌毒素受体复合物的神经节苷脂和蛋白质受体的特定组合来实现。一旦结合，毒素/受体复合物通过胞吞作用被内化并且内化的囊泡被分选至特定的细胞内途径。转位步骤似乎通过囊泡区室的酸化触发。该过程似乎起始两个重要的PH-依赖性结构重排，所述结构重排增加疏水性和促进毒素的双链形式的形成。一旦被激活，毒素的轻链内肽酶从细胞内囊泡释放至细胞溶胶，在细胞溶胶中其似乎特异性靶向神经递质释放装置的3个已知核心组分之一。此类核心蛋白、囊泡关联膜蛋白(vesicle-associatedmembraneprotein)(VAMP)/突触囊泡蛋白、25kDa的突触小体相关蛋白(synaptosomal-associatedprotein)(SNAP-25)和突触融合蛋白是在可溶性N-乙基马来酰亚胺敏感性因子附着型的蛋白受体(^lubleN-ethylmaleimide-sensitivefactor-互ttachmentprotein-receptor)(SNARE)家族的神经末梢和组成成员上突触囊泡停靠和融合所必需的。BoNT/A和BoNT/E裂解羧基末端区域中的SNAP-25，从而分别释放9或26个氨基酸的区段，BoNT/Cl还在羧基端附近裂解SNAP-25。肉毒菌素血清型BoNT/B、BoNT/D、BoNT/F和BoNT/G以及破伤风毒素作用于VAMP的保守中心部分，将VAMP的氨基末端部分释放至细胞溶胶中。BoNT/Cl在细胞溶胶膜表面附近的单个位点上裂解突触融合蛋白。突触SNARE的选择性蛋白水解负责由梭菌毒素引起的神经递质释放的体内阻断。梭菌毒素的SNARE蛋白靶对于多种非神经元类型的胞吐是共同的；在这些细胞中，如在神经元中，轻链肽酶活性抑制胞吐，参见，例如，YannHumeau等人，HowBotulinumandTetanusNeurotoxinsBlockNeurotransmitterRelease,82(5)Biochimie.427-446(2000)；KathrynTurton等人,BotulinumandTetanusNeurotoxinsStructure,FunctionandTherapeuticUtility,27(11)TrendsBiochem.Sci.552-558.(2002)；GiovannaLalli等人，TheJourneyofTetanusandTetanusNeurotoxinsinNeurons,11(9)TrendsMicrobiol.431-437,(2003)。在本发明的方面，经修饰的梭菌毒素部分地包含单链经修饰的梭菌毒素和双链经修饰的梭菌毒素。如上文中所述，梭菌毒素，无论是天然存在的还是非天然存在的，最初都合成为单链多肽。该单链形式随后在位于不连续双链环区域(形成二硫桥的两个半胱氨酸残基之间产生的)内的蛋白酶裂解位点上被蛋白酶裂解。该翻译后加工产生包含轻链(LC)和重链的双链分子。如本文中所用的，术语“双链环区域”是指通过位于LC结构域与HC结构域之间的二硫桥形成的天然存在的或非天然存在的梭菌毒素的环区域。如本文中所用，术语“单链修饰的梭菌毒素”是指本说明书中公开的任何经修饰的梭菌毒素，其以其单链形式存在，即，所述毒素在位于双链环区域内的蛋白酶裂解位点上未被其关联蛋白酶裂解。如本文中所用，术语“双链经修饰的梭菌毒素”是指本说明书中公开的任何经修饰的梭菌毒素，其以其双链形式形式存在，即，毒素已在位于双链环区域内的蛋白酶裂解位点上被其关联蛋白酶裂解。本发明的方面部分地提供了多核苷酸分子。如本文中所用，术语“多核苷酸分子”与“核酸分子”同义并且意指具有任何长度的核苷酸例如核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸的多聚体形式。有用的多核苷酸分子包括但不限于天然存在的和非天然存在的DNA分子以及天然存在和非天然存在的RNA分子。天然存在的和非天然存在的DNA分子的非限定性实例包括单链DNA分子、双链DNA分子、基因组DNA分子、cDNA分子、载体构建体，例如质粒构建体、噬菌粒构建体、噬菌体构建体、逆转录病毒构建体和人工染色体构建体。天然存在和非天然存在的RNA分子的非限定性实例包括单链RNA、双链RNA和mRNA。对于制备编码本说明书中公开的经修饰的梭菌毒素的多核苷酸分子可以是必需的已确立的分子生物学技术包括但不限于牵涉聚合酶链式反应(PCR)扩增、限制性酶反应、琼脂糖凝胶电泳、核酸连接、细菌转化、核酸纯化、核酸测序的方法，基于重组的技术是常规的并且完全在本领域技术人员的能力范围内以及来自本文中的教导。制备编码经修饰的梭菌毒素的多核苷酸分子所必需的具体方案的非限定性实例描述于例如M^uukCloningALaboratoryManual,问上，(2001)；^PCueeentProtocolsinMqlecularBiqlqgy(FrederickM.Ausubel等人编，JohnWiley&Sons,2004)。此外,用于制备编码经修饰的梭菌毒素的多核苷酸分子的多种商购可得的制品是广泛可获得的。此类方案是完全在本领域技术人员的能力范围之内的常规方法并且来自本文中的教导。本说明书中公开的方法部分地包括开放阅读框。如本文中所用，术语“开放阅读框”与“0RF”同义并且意指编码蛋白质或蛋白质的部分的任何多核苷酸。开放阅读框通常始于起始密码子(以标准密码子表示为例如AUG(对于RNA分子)和ATG(在DNA分子中))并且以密码子-三联体阅读直至框架以终止密码子(以标准密码子表示为例如UAA、UGA或UAG(对于RNA分子)和TAA、TGA或TAG(在DNA分子中))终止。如本文中所用，术语“密码子”意指在蛋白质合成过程中指定特定氨基酸的多核苷酸分子中的3个核苷酸的序列；也称为三联体或密码子-三联体。本说明书中公开的方法部分地包括表达构建体。表达构建体包含多核苷酸分子，所述多核苷酸包括本说明书中公开的可操作地连接于用于在细胞或无细胞提取物中表达所述多核苷酸分子的表达载体的开放阅读框。多种表达载体可用于表达本说明书中公开的多核苷酸分子，包括但不限于病毒表达载体；原核表达载体；真核表达载体例如酵母表达载体、昆虫表达载体和哺乳动物表达载体；以及无细胞(体外)表达载体。还应理解，用于实施此类方法的方面的表达载体可包括在组成型、组织特异性、细胞特异性或诱导型启动子元件、增强子元件或两者的控制下表达多核苷酸分子的那些表达载体。表达载体以及用于从此类表达载体制备和使用表达构建体的已确立的试剂和条件的非限定性实例可容易地从提供商获得，包括但不限于BDBiosciences-Clontech,PaloAlto,CA；BDBiosciencesPharmingen,SanDiego,CA；Invitrogen,Inc,Carlsbad,CA;EMDBiosciences_Novagen,Madison,WI；QIAGEN,Inc.，Valencia,CA;和Stratagene,LaJolla,CA。适当的表达载体的选择、制备和使用是完全在本领域技术人员的能力范围之内的常规方法以及来自本文中的教导。本说明书中公开的表达构建体可包含编码蛋白质的开放阅读框，所述蛋白质包括含有外源蛋白酶裂解位点的双链环区域，其中外源蛋白酶裂解位点的裂解将单链蛋白质转化为其双链形式。在本实施方案的方面，病毒表达载体可操作地连接于编码包含位于双链环内的外源蛋白酶裂解位点的蛋白质的多核苷酸分子；原核表达载体可操作地连接于编码包含位于双链环内的外源蛋白酶裂解位点的蛋白质的多核苷酸分子；酵母表达载体可操作地连接于编码包含位于双链环内的外源蛋白酶裂解位点的蛋白质的多核苷酸分子；昆虫表达载体可操作地连接于编码包含位于双链环内的外源蛋白酶裂解位点的蛋白质的多核苷酸分子；以及哺乳动物表达载体可操作地连接于编码包含位于双链环内的外源蛋白酶裂解位点的蛋白质的多核苷酸分子。在本实施方案的其它方面，适用于表达本说明书中公开的多核苷酸分子的表达构建体可使用无细胞提取物来表达。在本实施方案的方面，无细胞表达载体可操作地连接于编码包含位于双链环内的外源蛋白酶裂解位点的蛋白质的多核苷酸分子。在一个实施方案中，本说明中公开的表达构建体包含编码梭菌毒素的开放阅读框，所述梭菌毒素包含含有外源蛋白酶裂解位点的双链环区域。在本实施方案的方面，本说明书中公开的表达构建体可包含编码梭菌毒素的开放阅读框，所述梭菌毒素包含梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、梭菌毒素结合结构域以及包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域。在本实施方案的方面，单链梭菌毒素包含如下的线性氨基-至-羧基顺序I)梭菌毒素酶促结构域、包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域、梭菌毒素转位结构域和梭菌毒素结合结构域；2)梭菌毒素酶促结构域、包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域、梭菌毒素结合结构域和梭菌毒素转位结构域；3)梭菌毒素结合结构域、梭菌毒素转位结构域、包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域和梭菌毒素酶促结构域；4)梭菌毒素结合结构域、梭菌毒素酶促结构域，包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域和梭菌毒素转位结构域；5)梭菌毒素转位结构域、包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域、梭菌毒素酶促结构域和梭菌毒素结合结构域；或6)梭菌毒素转位结构域、包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域、梭菌毒素结合结构域和梭菌毒素酶促结构域。在本实施方案的其它方面，表达构建体包含开放阅读框，其编码1)ΒοΝΤ/Α毒素酶促结构域、BoNT/A转位结构域、BoNT/A结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域；2)BoNT/B酶促结构域、BoNT/B转位结构域、BoNT/B结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域；3)BoNT/Cl酶促结构域、BoNT/Cl转位结构域、BoNT/Cl结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域；4)BoNT/D酶促结构域、BoNT/D转位结构域、BoNT/D结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域；5)BoNT/E酶促结构域、BoNT/E转位结构域、BoNT/E结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域；6)BoNT/F酶促结构域、BoNT/F转位结构域、BoNT/F结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域；7)BoNT/G酶促结构域、BoNT/G转位结构域、BoNT/G结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域；8)TeNT酶促结构域、TeNT转位结构域、TeNT结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域；9)BaNT酶促结构域、BaNT转位结构域、BaNT结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域；10)BuNT酶促结构域、BuNT转位结构域、BuNT结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域。在本实施方案的其它方面，表达构建体包含开放阅读框，其编码1)ΒοΝΤ/Α毒素酶促结构域、BoNT/A转位结构域、BoNT/A结合结构域和包含TEV蛋白酶裂解位点的双链环区域；2)BoNT/B酶促结构域、BoNT/B转位结构域、BoNT/B结合结构域和包含TEV蛋白酶裂解位点的双链环区域；3)BoNT/Cl酶促结构域、BoNT/Cl转位结构域、BoNT/Cl结合结构域和包含TEV蛋白酶裂解位点的双链环区域；4)BoNT/D酶促结构域、BoNT/D转位结构域、BoNT/D结合结构域和包含TEV蛋白酶裂解位点的双链环区域；5)BoNT/E酶促结构域、BoNT/E转位结构域、BoNT/E结合结构域和包含TEV蛋白酶裂解位点的双链环区域；6)BoNT/F酶促结构域、BoNT/F转位结构域、BoNT/F结合结构域和包含TEV蛋白酶裂解位点的双链环区域；7)BoNT/G酶促结构域、BoNT/G转位结构域、BoNT/G结合结构域和包含TEV蛋白酶裂解位点的双链环区域；8)TeNT酶促结构域、TeNT转位结构域、TeNT结合结构域和包含TEV蛋白酶裂解位点的双链环区域；9)BaNT酶促结构域、BaNT转位结构域、BaNT结合结构域和包含TEV蛋白酶裂解位点的双链环区域；10)BuNT酶促结构域、BuNT转位结构域、BuNT结合结构域和包含TEV蛋白酶裂解位点的双链环区域。此类包含含有外源蛋白酶裂解位点的双链环区域的梭菌毒素的实例描述于例如J.OliverDolly等人，ActivatableRecombinantNeurotoxins,美国专利7，132,529；J.OliverDolly等人，ActivatableRecombinantNeurotoxins,美国专利7，419,676；LanceSteward等人，Leucine-BasedMotifsandClostridialNeurotoxins,美国专利6，903,187；LanceSteward等人，Leucine-BasedMotifsandClostridialNeurotoxins,美国专利7,393,925；ffei-JenLin等人，NeurotoxinswithEnhancedTargetSpecificity,美国专利7，273,722；LanceSteward等人，ModifiedBotulinumNeurotoxins,美国专利7,491,799；LanceE.Steward等人，OptimizedExpressionofActiveBotulinumToxinTypeE,美国专利公布2008/0138893;EsterFernandez-Salas等人，OptimizedExpressionofActiveBotulinumToxinTypeA,美国专利公布2008/0057575中；将所述每个专利通过引用整体并入本文。在另一个实施方案中，本说明书中公开的表达构建体可包含编码包含梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、非-梭菌毒素结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域的蛋白质的开放阅读框。在本实施方案的方面，单链蛋白质包含如下的线性氨基-至-羧基顺序1)梭菌毒素酶促结构域、包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域、梭菌毒素转位结构域和非-梭菌毒素结合结构域；2)梭菌毒素酶促结构域、包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域、非-梭菌毒素结合结构域和梭菌毒素转位结构域；3)非-梭菌毒素结合结构域、梭菌毒素转位结构域、包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域和梭菌毒素酶促结构域；4)非-梭菌毒素结合结构域、梭菌毒素酶促结构域、包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域和梭菌毒素转位结构域；5)梭菌毒素转位结构域、包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域、梭菌毒素酶促结构域和非-梭菌毒素结合结构域；或6)梭菌毒素转位结构域、包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域、非-梭菌毒素结合结构域和梭菌毒素酶促结构域。在本实施方案的其它方面，表达构建体包含开放阅读框，其编码梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、阿片样物质结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域。在本实施方案的其它方面，表达构建体包含开放阅读框，其编码I)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、脑啡肽结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域；2)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、牛肾上腺髓质_22(BAM22)肽结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域；3)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、内吗啡肽结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域；4)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、内啡肽结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域；5)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、强啡肽结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域；6)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、痛敏肽结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域；7)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、血衍吗啡素(hemorphin)结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域；或8)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、强啡肽B(Hmorphin)结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域。在本实施方案的其它方面，表达构建体包含开放阅读框，其编码梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、黑皮质素肽结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域。在本实施方案的其它方面，表达构建体包含开放阅读框，其编码I)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、促黑素细胞激素结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域；2)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、促肾上腺皮质激素结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域；或3)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、促脂解素结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域。在本实施方案的其它方面，表达构建体包含开放阅读框，其编码梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、甘丙肽肽结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域。在本实施方案的其它方面，表达构建体包含开放阅读框架，其编码I)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、甘丙肽结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域；或2)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、甘丙肽信息相关肽(GMAP)结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域。在本实施方案的其它方面，表达构建体包含开放阅读框，其编码梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、鸟尿素肽结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域。在本实施方案的其它方面，表达构建体包含开放阅读框，其编码I)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、嗜铬粒蛋白A结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域；2)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、嗜铬粒蛋白B结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域；或3)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、嗜铬粒蛋白C结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域。在本实施方案的其它方面，表达构建体包含开放阅读框，其编码梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、速激肽结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域。在本实施方案的其它方面，表达构建体包含开放阅读框，其编码I)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、P物质结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域；2)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、神经肽K结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域；3)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、神经肽Y结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域；4)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、神经激肽A结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域；5)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、血红素激肽结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域；或6)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、endokinin结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域。在本实施方案的其它方面，表达构建体包含开放阅读框，其编码梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、神经肽Y相关肽结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域。在本实施方案的其它方面，表达构建体包含开放阅读框，其编码I)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、神经肽Y(NPY)结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域；2)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、肽YY(PYY)结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域；3)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、胰腺肽(PP)结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域；或4)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、胰腺二十肽(PIP)结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域。在本实施方案的其它方面，表达构建体包含开放阅读框，其编码梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、神经激素肽结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域。在本实施方案的其它方面，表达构建体包含开放阅读框，其编码I)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、促皮质素-释放激素(CCRH)结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域；2)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、甲状旁腺素(PTH)结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域；3)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、促甲状腺激素释放激素(TRH)结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域；或4)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、生长抑素结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域。在本实施方案的其它方面，表达构建体包含开放阅读框，其编码梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、细胞因子肽结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域。在本实施方案的其它方面，表达构建体包含开放阅读框，其编码I)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、睫状神经营养因子(CNTF)结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域；2)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、血型糖蛋白-A(GPA)结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域；3)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、白血病抑制因子(LIF)结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域；4)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、白细胞介素(IL)结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域；5)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、抑瘤素M结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域；6)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、心脏营养素-I(CT-I)结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域；7)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、心脏营养素-样细胞因子(CLC)结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域；8)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、神经白细胞素结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域。在本实施方案的其它方面，表达构建体包含开放阅读框，其编码梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、激肽结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域。在本实施方案的其它方面，表达构建体包含开放阅读框，其编码I)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、缓激肽结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域；2)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、胰激肽结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域；3)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、desArg9缓激肽结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域；或4)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、desArglO缓激肽结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域。在本实施方案的其它方面，表达构建体包含开放阅读框，其编码梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、成纤维细胞生长因子(FGF)肽结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域。在本实施方案的其它方面，表达构建体包含开放阅读框，其编码I)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、FGF-I结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域；2)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、FGF-2结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域；3)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、FGF-4结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域；4)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、FGF-8结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域；5)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、FGF-9结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域；6)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、FGF-17结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域；或4)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、FGF-18结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域。在本实施方案的其它方面，表达构建体包含开放阅读框，其编码梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、神经营养因子肽结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域。在本实施方案的其它方面，表达构建体包含开放阅读框，其编码I)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、神经生长因子(NGF)结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域；2)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、脑源性神经营养因子(BDNF)结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域；3)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、神经营养因子-3(NT-3)结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域；4)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、神经营养因子-4/5(NT-4/5)结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域；或5)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、头激活肽(HA)结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域。在本实施方案的其它方面，表达构建体包含开放阅读框，其编码梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、肿瘤坏死因子(TNF)肽结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域。在本实施方案的其它方面，表达构建体包含开放阅读框，其编码梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、胶质细胞源性生长因子(GDNF)肽结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域。在本实施方案的其它方面，表达构建体包含开放阅读框，其编码I)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、neurturin结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域；2)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、persephrin结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域；或3)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、artemin结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域。在本实施方案的其它方面，表达构建体包含开放阅读框，其编码梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、转化生长因子β(TGFii)肽结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域。在本实施方案的其它方面，表达构建体包含开放阅读框，其编码I)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、TGF^I结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域；2)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、TGFβ2结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域；3)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、TGFβ3结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域；或4)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、TGFii4结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域。在本实施方案的其它方面，表达构建体包含开放阅读框，其编码梭菌毒素酶促结构域，梭菌毒素转位结构域、骨形态发生蛋白β(BMP)肽结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域。在本实施方案的其它方面，表达构建体包含开放阅读框，其编码I)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、ΒΜΡ2结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域；2)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、ΒΜΡ3结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域；3)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、ΒΜΡ4结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域；4)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、ΒΜΡ5结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域；5)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、ΒΜΡ6结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域；6)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、ΒΜΡ7结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域；7)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、ΒΜΡ8结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域；或8)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、BMPlO结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域。在本实施方案的其它方面，表达构建体包含开放阅读框，其编码梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、生长分化因子β(GDF)肽结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域。在本实施方案的其它方面，表达构建体包含开放阅读框，其编码I)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、GDFl结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域；2)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、GDF2结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域；3)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、GDF3结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域；4)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、GDF5结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域；5)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、GDF6结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域；6)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、GDF7结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域；7)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、GDF8结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域；8)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、GDFlO结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域；9)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、GDFll结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域；或10)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、GDF15结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域。在本实施方案的其它方面，表达构建体包含开放阅读框，其编码梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、激活蛋白肽结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域。在本实施方案的其它方面，表达构建体包含开放阅读框，其编码I)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、激活蛋白A结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域；2)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、激活蛋白B结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域；3)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、激活蛋白C结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域；4)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、激活蛋白E结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域；或5)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、抑制素A结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域。在本实施方案的其它方面，表达构建体包含开放阅读框，其编码梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、血管内皮生长因子(VEGF)肽结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域。在本实施方案的其它方面，表达构建体包含开放阅读框，其编码梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、胰岛素生长因子(IGF)肽结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域。在本实施方案的其它方面，表达构建体包含开放阅读框，其编码I)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、IGF-I结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域；或2)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、IGF-2结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域。在本实施方案的其它方面，表达构建体包含开放阅读框，其编码梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、表皮生长因子(EGF)肽结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域。在本实施方案的其它方面，表达构建体包含开放阅读框，其编码梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、高血糖素样激素肽结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域。在本实施方案的其它方面，表达构建体包含开放阅读框，其编码I)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、分泌素结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域；或2)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、高血糖素样肽结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域。在本实施方案的其它方面，表达构建体包含开放阅读框，其编码梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、垂体腺苷酸环化酶激活肽(PACAP)肽结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域。在本实施方案的其它方面，表达构建体包含开放阅读框，其编码梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、生长激素释放激素(GHRH)肽结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域。在本实施方案的其它方面，表达构建体包含开放阅读框，其编码梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、生长激素释放激素(GHRH)肽结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域。在本实施方案的其它方面，表达构建体包含开放阅读框，其编码梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、血管活性肠肽(VIP)肽结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域。在本实施方案的其它方面，表达构建体包含开放阅读框，其编码I)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、VIPl结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域；或2)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、VIP2结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域。在本实施方案的其它方面，表达构建体包含开放阅读框，其编码梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、肠抑胃肽(GIP)肽结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域。在本实施方案的其它方面，表达构建体包含开放阅读框，其编码梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、降韩素相关肽脑肠肽(Calcitonin-relatedpeptidesvisceralgutpeptide)结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域。在本实施方案的其它方面，表达构建体包含开放阅读框，其编码I)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、胃泌素结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域；2)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、胃泌素-释放肽结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域；或3)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、胆囊收缩素(CCK)结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域。在本实施方案的其它方面，表达构建体包含开放阅读框，其编码梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、蛋白酶激活受体(PAR)肽结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域。在本实施方案的其它方面，表达构建体包含开放阅读框，其编码I)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、PARl结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域；2)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、PAR2结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域；3)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、PAR3结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域；或4)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、PAR3结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域。此类包含含有外源蛋白酶裂解位点的双链环区域的蛋白质的实例描述于例如J.OliverDolly等人，ActivatableRecombinantNeurotoxins,美国专利7，132,529；J.OliverDolly等人，ActivatableRecombinantNeurotoxins,美国专利7，419,676；LanceE.Steward等人，MultivalentClostridialToxinDerivativesandMethodsofTheirUse,美国专利7，514，088;KeithA.Foster等人，Re-targetedToxinConjugates,InternationalPatentPublicationWO2005/023309；LanceE.Steward等人，ActivatableRecombinantNeurotoxins,美国专利公布2008/0032930;LanceE.Steward等人，ActivatableRecombinantNeurotoxins,美国专利公布2008/0032931；LanceE.Steward等人，ActivatableRecombinantNeurotoxins,美国专利公布2008/0161226；LanceE.Steward等人，ActivatableRecombinantNeurotoxins,美国专利公布2008/0221012；LanceE.Steward等人，ActivatableRecombinantNeurotoxins,美国专利公布2009/0004224;LanceE.Steward等人，ActivatableRecombinantNeurotoxins,美国专利公布2009/0005313；LanceE.Steward等人，ActivatableRecombinantNeurotoxins,美国专利公布2009/0018081；LanceE.Steward等人，ActivatableRecombinantNeurotoxins,美国专利公布2009/0069238；和LanceE.Steward等人，MultivalentClostridialToxinDerivativesandMethodsofTheirUse,美国专利公布2009/0048431(将所述每个专利通过引用整体并入本文)中。在另一个实施方案中，表达构建体包含开编码蛋白质的放阅读框架，所述蛋白质包含梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域和整合的蛋白酶裂解位点-结合结构域。在本实施方案的方面，单链蛋白质包含如下的线性氨基-至-羧基顺序1)整合的蛋白酶裂解位点-结合结构域、梭菌毒素转位结构域和梭菌毒素酶促结构域；2)整合的蛋白酶裂解位点-结合结构域、梭菌毒素酶促结构域和梭菌毒素转位结构域；3)梭菌毒素酶促结构域、整合的蛋白酶裂解位点-结合结构域和梭菌毒素转位结构域；4)梭菌毒素转位结构域、整合的蛋白酶裂解位点-结合结构域和梭菌毒素酶促结构域；5)梭菌毒素转位结构域、梭菌毒素酶促结构域和整合的蛋白酶裂解位点-结合结构域；和6)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域和整合的蛋白酶裂解位点-结合结构域。在本实施方案的其它方面，表达构建体包含开放阅读框，其编码梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域和整合的TEV蛋白酶裂解位点-阿片样物质结合结构域。在本实施方案的其它方面，表达构建体包含开放阅读框，其编码I)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域和整合的TEV蛋白酶裂解位点-脑啡肽结合结构域；2)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域和整合的TEV蛋白酶裂解位点-牛肾上腺髓质-22(BAM22)结合结构域；3)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域和整合的TEV蛋白酶裂解位点-内吗啡肽结合结构域；4)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域和整合的TEV蛋白酶裂解位点-内啡肽结合结构域；5)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域和整合的TEV蛋白酶裂解位点-强啡肽结合结构域；6)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域和整合的TEV蛋白酶裂解位点-痛敏肽结合结构域；7)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域和整合的TEV蛋白酶裂解位点-血衍吗啡素结合结构域；或8)梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域和整合的TEV蛋白酶裂解位点-强啡肽B结合结构域。此类包含整合的蛋白酶裂解位点-结合结构域的蛋白质的实例描述于例如同伴专利申请SanjivGhanshani等人，ModifiedClostridialToxinsComprisinganIntegratedProteaseCleavageSite-BindingDomain,将其通过引用整体并入本文。本说明书中公开的表达构建体可包含编码蛋白酶的开放阅读框。在本实施方案的方面，病毒表达载体被可操作地连接于编码蛋白酶的多核苷酸分子；原核表达载体被可操作地连接于编码蛋白酶的多核苷酸分子；酵母表达载体被可操作地连接于编码蛋白酶的多核苷酸分子；昆虫表达载体被可操作地连接于编码蛋白酶的多核苷酸分子；以及哺乳动物表达载体被可操作地连接于编码蛋白酶的多核苷酸分子。在本实施方案的其它方面，适用于表达本说明书中公开的多核苷酸分子的表达构建体可使用无细胞提取物来表达。在本实施方案的方面，无细胞提取物表达载体可操作地连接于编码蛋白酶的多核苷酸分子。在本实施方案的方面，包含开放阅读框的表达构建体编码肠激酶、人鼻病毒3C蛋白酶、人肠病毒3C蛋白酶、烟草蚀纹病毒(TEV)蛋白酶、烟草脉斑驳病毒(TVMV)蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶或半胱天冬酶3蛋白酶。肠激酶蛋白酶和编码它们的多核苷酸分子的实例描述于例如EdwardR.LaVallie,CloningofEnterokinaseandMethodofUse,美国专利5，665，566;EdwardR.LaVallie,CloningofEnterokinaseandMethodofUse,美国专利6，746，859(将所述每个专利通过引用整体并入本文)中。枯草杆菌蛋白酶和编码它们的多核苷酸的实例描述于例如DonnN.Rubingh等人，SubtillisinProteaseVariantshavingAminoAcidDeletionsandSubstitutionsinDefinedEpitopeRegions,美国专利6，586，224(将其通过弓I用整体并入本文)中。在本实施方案的另一个方面，肠激酶为SEQIDNO:11。在本实施方案的另一个方面，肠激酶包含SEQIDNO:11的氨基酸239-1035。在本实施方案的另一个方面，肠激酶是天然存在的肠激酶变体例如肠激酶同种型。在本实施方案的另一个方面，肠激酶是非天然存在的肠激酶变体例如保守肠激酶变体、非-保守肠激酶变体、肠激酶嵌合体、活性肠激酶片段或其任意组合。在本实施方案的另一个方面，肠激酶为美国专利5，665，566或美国专利6，746，859中公开的肠激酶。在本实施方案的另一个方面，肠激酶、天然存在的肠激酶变体或非天然存在的肠激酶变体获自哺乳动物的物种例如人、牛或啮齿类动物。在本实施方案的其它方面，肠激酶包括多肽，所述多肽与SEQIDNO=Il具有例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的氨基酸同一性；或与SEQIDNO:11具有至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%的氨基酸同一性。在本实施方案的其它方面，肠激酶包括多肽，所述多肽相对于SEQIDN011具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个非连续氨基酸的缺失、添加和/或置换；或相对于SEQIDNO11具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个非连续氨基酸的缺失、添加和/或置换。在本实施方案的其它方面，肠激酶包括多肽，所述多肽相对于SEQIDNO:11具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸的缺失、添加和/或置换；或对于SEQIDNO:11具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸的缺失、添加和/或置换。在本实施方案的另一个方面，人鼻病毒3C蛋白酶是SEQIDNO:12。在本实施方案的另一个方面，人鼻病毒3C蛋白酶是天然存在的人鼻病毒3C蛋白酶变体例如人鼻病毒3C蛋白酶同种型。在本实施方案的另一个方面，人鼻病毒3C蛋白酶为非天然存在的人鼻病毒3C蛋白酶变体例如保守人鼻病毒3C蛋白酶变体、非-保守人鼻病毒3C蛋白酶变体、人鼻病毒3C蛋白酶嵌合体、活性人鼻病毒3C蛋白酶片段或其任意组合。在本实施方案的另一个方面，人鼻病毒3C蛋白酶、天然存在的人鼻病毒3C蛋白酶变体或非天然存在的人鼻病毒3C蛋白酶变体获自鼻病毒属的物种。在本实施方案的其它方面，人鼻病毒3C蛋白酶包含多肽，所述多肽与SEQIDNO12具有例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的氨基酸同一性；或与SEQIDNO:12具有至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%的氨基酸同一'丨生。在本实施方案的其它方面,人鼻病毒3C蛋白酶包含多肽,所述多肽相对于SEQIDNO:12具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个非连续氨基酸的缺失、添加和/或置换；或相对于SEQIDNO:12具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个非连续氨基酸的缺失、添加和/或置换。在本实施方案的其它方面，人鼻病毒3C蛋白酶包含多肽，所述多肽相对于SEQIDN0:12具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸的缺失、添加和/或置换；或至多相对于SEQIDNO12具有例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸的缺失、添加和/或置换。在本实施方案的另一个方面，人肠病毒3C蛋白酶为SEQIDNO:13。在本实施方案的另一个方面，人肠病毒3C蛋白酶为天然存在的人肠病毒3C蛋白酶变体例如人肠病毒3C蛋白酶同种型。在本实施方案的另一个方面，人肠病毒3C蛋白酶为非天然存在的人肠病毒3C蛋白酶变体例如保守人肠病毒3C蛋白酶变体、非-保守人肠病毒3C蛋白酶变体、人肠病毒3C蛋白酶嵌合体、活性人肠病毒3C蛋白酶片段或其任意组合。在本实施方案的另一个方面，人肠病毒3C蛋白酶、天然存在的人肠病毒3C蛋白酶变体或非天然存在的人肠病毒3C蛋白酶变体获自肠道病毒属的物种。在本实施方案的其它方面，人肠病毒3C蛋白酶包含多肽，所述多肽与SEQIDNO13具有例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的氨基酸同一性；或与SEQIDNO:13具有至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%的氨基酸同一性。在本实施方案的其它方面，人肠病毒3C蛋白酶包括多肽，所述多肽相对于SEQIDNO:13具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个非连续氨基酸的缺失、添加和/或置换；或相对于SEQIDNO:13具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个非连续氨基酸的缺失、添加和/或置换。在本实施方案的其它方面，人肠病毒3C蛋白酶包括多肽，所述多肽相对于SEQIDNO:13具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸的缺失、添加和/或置换；或相对于SEQIDNO:13具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸的缺失、添加和/或置换。在本实施方案的另一个方面，TEV蛋白酶为SEQIDNO:14。在本实施方案的另一个方面，TEV蛋白酶包含SEQISNO:14的氨基酸2038-2270。在本实施方案的另一个方面，TEV蛋白酶包含SEQIDNO15,SEQIDNO16,SEQIDNO17,SEQIDNO18,SEQIDNO:19、SEQIDNO20,SEQIDNO2USEQIDNO:22或SEQIDNO:23。在本实施方案的另一个方面，TEV蛋白酶为天然存在的TEV蛋白酶变体例如TEV蛋白酶同种型。在本实施方案的另一个方面，TEV蛋白酶为非天然存在的TEV蛋白酶变体例如保守TEV蛋白酶变体、非-保守TEV蛋白酶变体，TEV蛋白酶嵌合体、活性TEV蛋白酶片段或其任意组合。在本实施方案的另一个方面，TEV蛋白酶、天然存在的TEV蛋白酶变体或非天然存在的TEV蛋白酶变体获自马铃薯Y病毒属的物种。在本实施方案的其它方面，TEV蛋白酶包含多肽，所述多肽与SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO2USEQIDNO:22或SEQIDNO:23具有例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的氨基酸同一性；或与SEQIDNO14,SEQIDNO:15、SEQIDNO16,SEQIDNO17,SEQIDNO18,SEQIDNO19,SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO:22或SEQIDNO:23具有至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%的氨基酸同一性。在本实施方案的其它方面，TEV蛋白酶包含多肽，所述多肽相对于SEQIDNO14,SEQIDNO15,SEQIDNO16,SEQIDNO17,SEQIDNO18,SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO22或SEQIDNO23具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个非连续氨基酸的缺失、添加和/或置；或相对于SEQIDNO14,SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO20,SEQIDNO2USEQIDNO:22或SEQIDNO:23具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个非连续氨基酸的缺失、添加和/或置换。在本实施方案的其它方面，TEV蛋白酶包含多肽，所述多肽相对于SEQIDNO14,SEQIDNO15,SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO:22或SEQIDNO:23具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸的缺失、添加和/或置换；或相对于SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO20,SEQIDNO2USEQIDNO:22或SEQIDNO:23具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸的缺失、添加和/或置换。在本实施方案的另一个方面，TVMV蛋白酶为SEQIDNO:24。在本实施方案的另一个方面，TEV蛋白酶包含SEQISNO:24的氨基酸2002-2236。在本实施方案的另一个方面，TVMV蛋白酶为天然存在的TVMV蛋白酶变体例如TVMV蛋白酶同种型。在本实施方案的另一个方面，TVMV蛋白酶为非天然存在的TVMV蛋白酶变体例如保守TVMV蛋白酶变体、非-保守TVMV蛋白酶变体、TVMV蛋白酶嵌合体、活性TVMV蛋白酶片段或其任意组合。在本实施方案的另一个方面，TVMV蛋白酶、天然存在的TVMV蛋白酶变体或非天然存在的TVMV蛋白酶变体获自马铃薯Y病毒属的物种。在本实施方案的其它方面，TVMV蛋白酶包括多肽，所述多肽与SEQIDNO24或SEQISNO:24的氨基酸2002-2236具有例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的氨基酸同一性；或与SEQIDNO:24或SEQISNO:24的氨基酸2002-2236具有至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%的氨基酸同一性。在本实施方案的其它方面，TVMV蛋白酶包含多肽，所述多肽相对于SEQIDN024或SEQISNO24的氨基酸2002-2236具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个非连续氨基酸的缺失、添加和/或置换；或相对于SEQIDN0:24或SEQISNO24的氨基酸2002-2236具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个非连续氨基酸的缺失、添加和/或置换。在本实施方案的其它方面，TVMV蛋白酶包含多肽，所述多肽相对于SEQIDN0:24或SEQISNO:24的氨基酸2002-2236具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸的缺失、添加和/或置换；或相对于SEQIDNO:24或SEQISNO:24的氨基酸2002-2236具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸的缺失、添加和/或置换。在本实施方案的另一个方面，枯草杆菌蛋白酶为SEQIDNO:25。在本实施方案的另一个方面，枯草杆菌蛋白酶包含SEQISNO:25的氨基酸107-365。在本实施方案的另一个方面，枯草杆菌蛋白酶为天然存在的枯草杆菌蛋白酶变体例如枯草杆菌蛋白酶同种型。在本实施方案的另一个方面，枯草杆菌蛋白酶为非天然存在的枯草杆菌蛋白酶变体例如保守枯草杆菌蛋白酶变体、非-保守枯草杆菌蛋白酶变体、枯草杆菌蛋白酶嵌合体、活性枯草杆菌蛋白酶片段或其任意组合。在本实施方案的另一个方面，枯草杆菌蛋白酶、天然存在的枯草杆菌蛋白酶变体或非天然存在的枯草杆菌蛋白酶变体获自芽孢杆菌属的物种。在本实施方案的其它方面，枯草杆菌蛋白酶包含多肽，所述多肽与SEQIDNO25或SEQISNO:25的氨基酸107-365具有例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的氨基酸同一性；或与SEQIDNO:25或SEQISNO:25的氨基酸107-365具有至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%的氨基酸同一'I"生。在本实施方案的其它方面，枯草杆菌蛋白酶包含多肽，所述多肽相对于SEQIDNO:25或SEQISNO25的氨基酸107-365具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个非连续氨基酸的缺失、添加和/或置换；或相对于SEQIDNO25或SEQISNO25的氨基酸107-365具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个非连续氨基酸的缺失、添加和/或置换。在本实施方案的其它方面，枯草杆菌蛋白酶包含多肽，所述多肽相对于SEQIDNO25或SEQISNO25的氨基酸107-365具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸的缺失、添加和/或置换；或相对于SEQIDNO25或SEQISNO:25的氨基酸107-365具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸的缺失、添加和/或置换。在本实施方案的另一个方面，半胱天冬酶3蛋白酶为SEQIDNO:26。在本实施方案的另一个方面，半胱天冬酶3蛋白酶为天然存在的半胱天冬酶3蛋白酶变体例如半胱天冬酶3蛋白酶同种型。在本实施方案的另一个方面，半胱天冬酶3蛋白酶为非天然存在的半胱天冬酶3蛋白酶变体例如保守半胱天冬酶3蛋白酶变体、非-保守半胱天冬酶3蛋白酶变体、半胱天冬酶3蛋白酶嵌合体、活性半胱天冬酶3蛋白酶片段或其任意组合。在本实施方案的另一个方面，半胱天冬酶3蛋白酶、天然存在的半胱天冬酶3蛋白酶变体或非天然存在的半胱天冬酶3蛋白酶变体获自哺乳动物的物种例如人、牛或啮齿类动物。在本实施方案的其它方面，半胱天冬酶3蛋白酶包含多肽，所述多肽与SEQIDNO:26具有例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的氨基酸同一性；或与SEQIDNO:26具有至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%的氨基酸同一性。在本实施方案的其它方面，半胱天冬酶3蛋白酶包含多肽，所述多肽相对于SEQIDNO:26具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个非连续氨基酸的缺失、添加和/或置换；或相对于SEQIDNO:26具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个非连续氨基酸的缺失、添加和/或置换。在本实施方案的其它方面，半胱天冬酶3蛋白酶包含多肽，所述多肽相对于SEQIDN0:26具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸的缺失、添加和/或置换；或相对于SEQIDNO26具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸的缺失、添加和/或置换。本说明书中公开的方法部分地包括双重表达构建体。双重表达构建体包含两个多核苷酸分子，每一个多核苷酸分子包括可操作地连接于用于在细胞或无细胞提取物中表达两个多核苷酸分子的表达载体的本说明书中公开的开放阅读框。多种双重表达载体可用于表达本说明书中公开的多核苷酸分子，包括但不限于病毒双重表达载体；原核双重表达载体；真核双重表达载体例如酵母双重表达载体、昆虫双重表达载体和哺乳动物双重表达载体；以及无细胞提取物双重表达载体。还应理解，用于实施这些方法的方面的双重表达载体可包括在组成型、组织特异性、细胞特异性或诱导型启动子元件、增强子元件或两者的控制下表达多核苷酸分子的那些表达载体。双重表达载体以及用于从此类表达载体制备和使用表达构建体的已确立的试剂和条件的非限定性实例可容易地从提供商获得，包括但不限于EMDBiosciences-Novagen,Madison,WI。适当的双重表达载体的选择、制备和使用是完全在本领域技术人员的能力范围之内的常规方法以及来自本文中的教导。本说明书中公开的双重表达构建体可包含编码蛋白质的开放阅读框，所述蛋白质包含含有外源蛋白酶裂解位点的双链环区域，和编码蛋白酶的另一个开放阅读框，所述蛋白酶可裂解位于双链环内的外源蛋白酶裂解位点，从而将单链蛋白质转化成其双链形式。因此，在一个实施方案中，双重表达构建体包含编码蛋白质的开放阅读框，所述蛋白质包含含有本说明书中公开的外源蛋白酶裂解位点的双链环区域，和编码蛋白酶的另一个开放阅读框，所述蛋白酶可裂解位于本说明书中公开的双链环内的外源蛋白酶裂解位点。在本实施方案的方面，双重表达构建体可包含编码梭菌毒素(其包含含有TEV蛋白酶裂解位点的双链环区域)的一个开放阅读框和编码TEV蛋白酶的另一个开放阅读框。在本实施方案的另一个方面，双重表达构建体可包含编码梭菌毒素(其包含梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、梭菌毒素结合结构域和包含TEV蛋白酶裂解位点的双链环区域)的一个开放阅读框和编码TEV蛋白酶的另一个开放阅读框。在本实施方案的另一个方面，双重表达构建体可包含编码梭菌毒素(其包含梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、梭菌毒素结合结构域、双链环区域和TEV蛋白酶裂解位点，其中TEV蛋白酶裂解位点位于双链环区域内)的一个开放阅读框和编码TEV蛋白酶的另一个开放阅读框。在本实施方案的方面，双重表达构建体包含编码蛋白质(所述蛋白质包含梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、非-梭菌毒素结合结构域和包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域)的开放阅读框和编码可裂解位于双链环区域内的外源蛋白酶裂解位点的蛋白质酶的另一个开放阅读框。在本实施方案的另一个方面，双重表达构建体可包含编码蛋白质(所述蛋白质包含梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、非-梭菌毒素结合结构域和包含TEV蛋白酶裂解位点的双链环区域)的一个开放阅读框和编码TEV蛋白酶的另一个开放阅读框。在本实施方案的另一个方面，双重表达构建体可包含编码蛋白质(所述蛋白质包含梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、非-梭菌毒素结合结构域、双链环区域和TEV蛋白酶裂解位点，其中TEV蛋白酶裂解位点位于双链环区域内)的一个开放阅读框和编码TEV蛋白酶的另一个开放阅读框。在本实施方案的方面，双重表达构建体包含编码包含梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域和整合的蛋白酶裂解位点-结合结构域的蛋白质的开放阅读框。在本实施方案的另一个方面，双重表达构建体可包含编码蛋白质(所述蛋白质包含梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、整合的TEV蛋白酶裂解位点-结合结构域)的一个开放阅读框和编码TEV蛋白酶的另一个开放阅读框。在本实施方案的另一个方面，双重表达构建体可包含编码蛋白质(所述蛋白质包含梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域和整合的TEV蛋白酶裂解位点-结合结构域，其中TEV蛋白酶裂解位点位于双链环区域内)的一个开放阅读框和编码TEV蛋白酶的另一个开放阅读框。双重表达构建体中包含的开放阅读框之一的位置可以以相对于另一个开放阅读框的位置的任何顺序存在，只要从两个开放阅读框的转录仍然可发生。当制备双重表达构建体时，来自第一启动子区域的转录起始通常转录两个开放阅读框，然而，来自第二启动子区域的转录起始通常仅转录开放阅读框之一。因此，取决于开放阅读框相对于第一和第二启动子区域的定位，可从开放阅读框之一产生多至2倍的转录物。因此，在一个实施方案，编码蛋白酶的开放阅读框处于第一启动子区域的控制之下，然而编码包含包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域的蛋白质的开放阅读框处于第一启动子和第二启动子区域的控制之下。在本实施方案的方面，编码TEV蛋白酶的开放阅读框处于第一启动子区域的控制之下，然而编码包含位于双链环区域中的TEV蛋白酶裂解位点的梭菌毒素的开放阅读框处于第一启动子和第二启动子区域的控制之下。在本实施方案的另一个方面，编码TEV蛋白酶的开放阅读框处于第一启动子区域的控制之下，然而编码包含梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、非-梭菌毒素结合结构域和包含TEV蛋白酶裂解位点的双链环区域的蛋白质的开放阅读框处于第一启动子和第二启动子区域的控制之下。在本实施方案的另一个方面，编码TEV蛋白酶的开放阅读框处于第一启动子区域的控制之下，然而编码包含梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域和整合的TEV蛋白酶裂解位点-结合结构域的蛋白质的开放阅读框处于第一启动子和第二启动子区域的控制之下。在另一个实施方案中，编码包含含有外源蛋白酶裂解位点的双链环区域的蛋白质的开放阅读框处于第一启动子区域的控制之下，然而编码蛋白酶的开放阅读框处于第一启动子和第二启动子区域的控制之下。在本实施方案的方面，编码包含含有TEV蛋白酶裂解位点的双链环区域的梭菌毒素的开放阅读框处于第一启动子区域的控制之下，然而，编码TEV蛋白酶的开放阅读框处于第一启动子和第二启动子区域的控制之下。在本实施方案的另一个方面，编码包含梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域、非-梭菌毒素结合结构域和包含TEV蛋白酶裂解位点的双链环区域的蛋白质的开放阅读框处于第一启动子区域的控制之下，然而编码TEV蛋白酶的开放阅读框处于第一启动子和第二启动子区域的控制之下。在本实施方案的另一个方面，编码包含梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素转位结构域和整合的TEV蛋白酶裂解位点-结合结构域的蛋白质的开放阅读框处于第一启动子区域的控制之下，然而编码TEV蛋白酶的开放阅读框处于第一启动子和第二启动子区域的控制之下。双重表达构建体中包含的开放阅读框之一的5’-3’取向相对于另一个开放阅读框的5’-3’取向可以处于任何方向，只要从两个开放阅读框的转录仍然可发生。在一个实施方案中，开放阅读框之一的5’-3’取向处于与另一个开放阅读框的5’-3’取向相同的方向。在另一个实施方案中，开放阅读框之一的5’-3’取向处于与另一个开放阅读框的5’-3’取向相反的方向。在本实施方案的方面，开放阅读框之一的5’-3’取向相对于另一个开放阅读框的5’-3’取向是收敛的(convergent)。在本实施方案的另一个方面,开放阅读框之一的5’-3’取向相对于另一个开放阅读框的5’-3’取向是发散的(divergent)。本说明书中公开的方法部分地包括包含包含外源蛋白酶裂解位点的双链环区域的蛋白质。如本文中所用，术语“双链环区域”意指包含用于将梭菌毒素的单链形式转化成双链形式的蛋白酶裂解位点的梭菌毒素的氨基酸序列。梭菌毒素双链环区域的非限定性实例包括包含SEQIDNO1的氨基酸430-454的BoNT/A的双链环区域；包含SEQIDNO2的氨基酸437-446的BoNT/B的双链环区域；包含SEQIDNO3的氨基酸437-453的BoNT/Cl的双链环区域；包含SEQIDNO4的氨基酸437-450的BoNT/D的双链环区域；包含SEQIDNO5的氨基酸412-426的BoNT/E的双链环区域；包含SEQIDNO6的氨基酸429-445的BoNT/F的双链环区域；包含SEQIDNO:7的氨基酸436-450的BoNT/G的双链环区域；包含SEQIDNO8的氨基酸439-467的TeNT的双链环区域；包含SEQIDNO9的氨基酸421-435的BaNT的双链环区域；和包含SEQIDNO10的氨基酸412-426的BuNT的双链环区域(表2)。表2.梭菌毒素的双链环区域权利要求1.一种将包含双链环区域的单链梭菌毒素转化成其双链形式的细胞内方法，所述方法包括步骤a)将包含双重表达构建体的细胞在37°C下生长约3.5小时，所述双重表达构建体包含i)编码单链梭菌毒素的开放阅读框，所述单链梭菌毒素包含酶促结构域、转位结构域、结合结构域和包含TEV蛋白酶裂解位点的双链环区域；和)编码TEV蛋白酶的开放阅读框；b)将所述细胞在22°C下生长约16至约18小时，其中在步骤(b)中的生长诱导所述单链梭菌毒素和TEV蛋白酶从所述双重表达构建体的表达；以及其中所述产生的TEV蛋白酶在位于双链环区域内的TEV蛋白酶裂解位点上裂解所述单链梭菌毒素，从而将所述单链梭菌毒素转化成其双链形式。2.权利要求I所述的细胞内方法，其中所述单链梭菌毒素包含如下的线性氨基-至-羧基单链多肽顺序1)所述梭菌毒素酶促结构域、包含TEV蛋白酶裂解位点的所述双链环区域、所述梭菌毒素转位结构域和所述梭菌毒素结合结构域；2)所述梭菌毒素酶促结构域、包含TEV蛋白酶裂解位点的所述双链环区域、所述梭菌毒素结合结构域和所述梭菌毒素转位结构域；3)所述梭菌毒素结合结构域、所述梭菌毒素转位结构域、包含TEV蛋白酶裂解位点的所述双链环区域和所述梭菌毒素酶促结构域；4)所述梭菌毒素结合结构域、所述梭菌毒素酶促结构域、包含TEV蛋白酶裂解位点的所述双链环区域和所述梭菌毒素转位结构域；5)所述梭菌毒素转位结构域、包含TEV蛋白酶裂解位点的所述双链环区域、所述梭菌毒素酶促结构域和所述梭菌毒素结合结构域；或6)所述梭菌毒素转位结构域、包含TEV蛋白酶裂解位点的所述双链环区域、所述梭菌毒素结合结构域和所述梭菌毒素酶促结构域。3.权利要求I所述的细胞内方法，其中所述梭菌毒素酶促结构域为BoNT/A酶促结构域、BoNT/B酶促结构域、BoNT/Cl酶促结构域、BoNT/D酶促结构域、BoNT/E酶促结构域、BoNT/F酶促结构域、BoNT/G酶促结构域、TeNT酶促结构域、BaNT酶促结构域或BuNT酶促结构域。4.权利要求I所述的细胞内方法，其中所述梭菌毒素转位结构域为BoNT/A转位结构域、BoNT/B转位结构域、BoNT/Cl转位结构域、BoNT/D转位结构域、BoNT/E转位结构域、BoNT/F转位结构域、BoNT/G转位结构域、TeNT转位结构域、BaNT转位结构域或BuNT转位结构域。5.权利要求I所述的细胞内方法，其中所述梭菌毒素结合结构域为BoNT/A结合结构域、BoNT/B结合结构域、BoNT/Cl结合结构域、BoNT/D结合结构域、BoNT/E结合结构域、BoNT/F结合结构域、BoNT/G结合结构域、TeNT结合结构域、BaNT结合结构域或BuNT结合结构域。6.一种将单链蛋白质转化成其双链形式的细胞内方法，所述方法包括步骤a)将包含双重表达构建体的细胞在37°C下生长约8小时，所述双重表达构建体包含；i)编码单链蛋白质的开放阅读框，所述单链蛋白质包含酶促结构域、转位结构域、整合的TEV蛋白酶裂解位点-阿片样物质结合结构域；和)编码TEV蛋白酶的开放阅读框；b)将所述细胞在约12至约16°C下生长约16至约18小时，其中在步骤(b)中的生长诱导所述单链蛋白质和所述TEV蛋白酶从所述双重表达构建体表达；和其中所述产生的TEV蛋白酶在位于所述整合的TEV裂解位点阿片样物质结合结构域内的TEV蛋白酶裂解位点上裂解所述单链蛋白质，从而将所述单链蛋白质转化成其双链形式。7.权利要求6所述的细胞内方法，其中所述蛋白质包含如下的线性氨基-至-羧基单链多肽顺序1)所述梭菌毒素酶促结构域、所述梭菌毒素转位结构域和所述整合的TEV蛋白酶裂解位点-阿片样物质结合结构域，2)所述梭菌毒素酶促结构域、所述整合的TEV蛋白酶裂解位点-阿片样物质结合结构域和所述梭菌毒素转位结构域，3)所述整合的TEV蛋白酶裂解位点-阿片样物质结合结构域、所述梭菌毒素转位结构域和所述梭菌毒素酶促结构域，4)所述整合的TEV蛋白酶裂解位点-阿片样物质结合结构域、所述梭菌毒素酶促结构域和所述梭菌毒素转位结构域，5)所述梭菌毒素转位结构域、所述整合的TEV蛋白酶裂解位点-阿片样物质结合结构域和所述梭菌毒素酶促结构域；或6)所述梭菌毒素转位结构域、所述梭菌毒素酶促结构域和所述整合的TEV蛋白酶裂解位点-阿片样物质结合结构域。8.权利要求I所述的细胞内方法，其中所述梭菌毒素酶促结构域为BoNT/A酶促结构域、BoNT/B酶促结构域、BoNT/Cl酶促结构域、BoNT/D酶促结构域、BoNT/E酶促结构域、BoNT/F酶促结构域、BoNT/G酶促结构域、TeNT酶促结构域、BaNT酶促结构域或BuNT酶促结构域。9.权利要求I所述的细胞内方法，其中所述梭菌毒素转位结构域为BoNT/A转位结构域、BoNT/B转位结构域、BoNT/Cl转位结构域、BoNT/D转位结构域、BoNT/E转位结构域、BoNT/F转位结构域、BoNT/G转位结构域、TeNT转位结构域、BaNT转位结构域或BuNT转位结构域。10.权利要求I所述的细胞内方法，其中所述整合的TEV蛋白酶裂解位点-阿片样物质结合结构域为整合的TEV蛋白酶裂解位点-痛敏肽结合结构域、整合的TEV蛋白酶裂解位点-强啡肽结合结构域、整合的TEV蛋白酶裂解位点-脑啡肽结合结构域、整合的TEV蛋白酶裂解位点-BAM22结合结构域、整合的TEV蛋白酶裂解位点-内吗啡肽结合结构域、整合的TEV蛋白酶裂解位点-内啡肽结合结构域区域、整合的TEV蛋白酶裂解位点-血衍吗啡素结合结构域或整合的TEV蛋白酶裂解位点-强啡肽B(rimorphin)结合结构域。11.一种将单链蛋白质转化成其双链形式的细胞内方法，所述方法包括步骤a)将包含双重表达构建体的细胞在37°C下生长约8小时，所述双重表达构建体包含；i)编码单链蛋白质的开放阅读框，所述单链蛋白质包含酶促结构域、转位结构域、非-梭菌毒素结合结构域和包含TEV蛋白酶裂解位点的双链环区域；和)编码TEV蛋白酶的开放阅读框；b)将所述细胞在约12至约16°C下生长约16至约18小时，其中在步骤(b)中的生长诱导所述单链蛋白质和所述TEV蛋白酶从所述双重表达构建体表达；和其中所述产生的TEV蛋白酶在位于所述双链环区域的TEV蛋白酶裂解位点上裂解所述单链蛋白质，从而将所述单链蛋白质转化成其双链形式。12.权利要求11所述的细胞内方法，其中所述单链梭菌毒素包含如下的线性氨基-至-羧基单链多肽顺序1)所述梭菌毒素酶促结构域、包含TEV蛋白酶裂解位点的所述双链环区域、所述梭菌毒素转位结构域和所述非-梭菌毒素结合结构域；2)所述梭菌毒素酶促结构域、包含TEV蛋白酶裂解位点的所述双链环区域、所述非-梭菌毒素结合结构域和所述梭菌毒素转位结构域；3)所述非-梭菌毒素结合结构域、所述梭菌毒素转位结构域、包含TEV蛋白酶裂解位点的所述双链环区域和所述梭菌毒素酶促结构域；4)所述非-梭菌毒素结合结构域、所述梭菌毒素酶促结构域、包含TEV蛋白酶裂解位点的所述双链环区域和所述梭菌毒素转位结构域；5)所述梭菌毒素转位结构域、包含TEV蛋白酶裂解位点的所述双链环区域、所述梭菌毒素酶促结构域和所述非-梭菌毒素结合结构域；或6)所述梭菌毒素转位结构域、包含TEV蛋白酶裂解位点的所述双链环区域、所述非-梭菌毒素结合结构域和所述梭菌毒素酶促结构域。13.权利要求11所述的细胞内方法，其中所述梭菌毒素酶促结构域为BoNT/A酶促结构域、BoNT/B酶促结构域、BoNT/Cl酶促结构域、BoNT/D酶促结构域、BoNT/E酶促结构域、BoNT/F酶促结构域、BoNT/G酶促结构域、TeNT酶促结构域、BaNT酶促结构域或BuNT酶促结构域。14.权利要求11所述的细胞内方法，其中所述梭菌毒素转位结构域为BoNT/A转位结构域、BoNT/B转位结构域、BoNT/Cl转位结构域、BoNT/D转位结构域、BoNT/E转位结构域、BoNT/F转位结构域、BoNT/G转位结构域、TeNT转位结构域、BaNT转位结构域或BuNT转位结构域。15.权利要求11所述的细胞内方法，其中所述非-梭菌毒素结合结构域为阿片样物质肽结合结构域、黑皮质素肽结合结构域、甘丙肽肽结合结构域、乌尿素(granin)肽结合结构域、速激肽结合结构域、神经肽Y相关肽结合结构域、神经激素肽结合结构域、细胞因子肽结合结构域、激肽结合结构域、成纤维细胞生长因子肽结合结构域、神经营养因子肽结合结构域、肿瘤坏死因子肽结合结构域、胶质细胞源性神经营养因子肽结合结构域、转化生长因子β肽结合结构域、骨形态发生蛋白肽结合结构域、生长和分化因子肽结合结构域、激活蛋白肽结合结构域、血管内皮生长因子肽结合结构域、胰岛素生长因子肽结合结构域、表皮生长因子肽结合结构域、高血糖素样激素肽结合结构域、垂体腺苷酸环化酶激活肽结合结构域、生长激素释放激素肽结合结构域、血管活性肠肽结合结构域、肠抑胃肽结合结构域、降钙素-相关肽脑肠肽结合结构域或蛋白酶激活受体肽结合结构域。全文摘要本说明书公开了包含含有双链环区域(所述双链环区域包含外源蛋白酶裂解位点)和可裂解位于双链环内的外源蛋白酶裂解位点的蛋白酶的单链蛋白质的表达构建体、包含这样的表达构建体的细胞组合物以及将单链蛋白质转化成其双链形式的细胞内方法。文档编号C12N15/866GK102822196SQ201180014965公开日2012年12月12日申请日期2011年1月24日优先权日2010年1月25日发明者S·甘沙尼,L·Q·勒,刘漪,L·E·斯图尔德申请人:阿勒根公司