专利名称：细胞核质转移受体蛋白13多克隆抗体制备方法
技术领域：
本发明涉及一种蛋白抗体的制备，尤其是涉及一种细胞核质转移受体蛋白13(importin13简称imp 13)的多克隆抗体的制备方法。
背景技术：
真核细胞中大分子(蛋白质和核酸)在细胞核与细胞质之间的转移，是细胞最重要的功能之一。现已发现，许多疾病的产生和发育的紊乱与细胞中蛋白质的正确定位有极大的关联。imp 13蛋白质是细胞核质转移蛋白受体家族(importinβsuperfamily)中的一个新成员(Mingot et al.，Importin 13a novel mediator of nuclear import and export，The EMBO Journal，2001，20(14)3685-3694)，它指导细胞内多个功能蛋白的入核及出核过程。它也是目前在importinβ家族中所发现的唯一受发育时期和激素调控的细胞核质受体蛋白(Zhang et al.，A Novel Karyopherin-βHomolog Is Developmentally and HormonallyRegulated in Fetal Lung，American Journal of Respiratory Cell Molecular Biology，2000，22451-459)，同时也是唯一发现的其细胞核质转移速度受发育调控的细胞核质转移受体蛋白(Tao et al.，Nucleocytoplasmic Shuttling of lgl2 Is DevelopmentallyRegulated in Fetal Lung，American Journal of Respiratory Cell Molecular Biology，2004，30350-359)。获得imp 13的相应的抗体，对精确定位内源的imp 13蛋白质在组织和细胞中的分布有着重要的作用，从而更真实地反映它的生物学功能。
发明内容
本发明的目的在于针对现有的核质转移受体蛋白13抗体制备方法存在的不足，至今已知得到的imp 13的抗体是用体外合成的C端的20个左右氨基酸的多肽(Mingot et al.，Importin 13a novel mediator of nuclear import and export，The EMBO Journal，2001，20(14)3685-3694)作为抗原得到的抗体，因而它只能识别imp 13蛋白C端的氨基酸序列，为此提供一种以在生物体内表达的具有生物活性的imp 13的全长蛋白做抗原制备抗imp 13多克隆抗体的方法。
本发明所述的细胞核质转移受体蛋白13的多克隆抗体制备方法，其步骤为1)将表达全长细胞核质转移受体蛋白13蛋白质的重组表达质粒pGEX-4T-2-imp 13转化到大肠杆菌BL21中；2)培养转化重组质粒的BL21到0D值为0.5～1.0；3)在培养的大肠杆菌BL21中加入IPTG至0.1-0.5mM，诱导；4)将诱导后的菌体离心收集，用PBS重悬，先加入DTT至终浓度1～10mM，后加溶菌酶溶菌，再超声波破碎，把破碎后的菌液离心，收集上清；5)将上清与Glutathione-Sepharose-4B的beads混合，孵育后离心收集beads；6)用谷胱甘肽洗脱下细胞核质转移受体蛋白13；7)用纯化后的细胞核质转移受体蛋白13作为抗原免疫兔子，得到细胞核质转移受体蛋白13的抗体，用不完全福氏佐剂加强；8)测抗细胞核质转移受体蛋白13的血清效价，取血，得到相应的抗血清。
在步骤2)中，所述的培养其温度为37℃。
在步骤3)中，所述的诱导其温度最好为25℃，时间最好为2.5～5h。
在步骤4)中，所述的PBS其pH值为8.0，加入的DTT浓度最好为5mM，加溶菌酶溶菌的时间为30～60min，超声波破碎最好35次，每次6s；然后把破碎后的菌液在4℃下，10000rpm离心10min，收集上清。
在步骤5)中，把上清与Glutathione-Sepharose-4B的beads混合，最好在4℃下孵育过夜，第二天4℃下，500rpm离心5min收集beads。
在步骤6)中，用10mM谷胱甘肽洗脱下细胞核质转移受体蛋白13。
在步骤7)中，所述的用纯化后的细胞核质转移受体蛋白13作为抗原免疫兔子最好采用每只兔子每次用抗原蛋白200μg，间隔1周后用不完全福氏佐剂加强，连续4次。
在步骤8)中，所述的取血是在免疫第4次后1周取血，所测血清效价应＞10000，若所测血清效价≤10000，则需再进行免疫。
与现有的制备方法相比，由于用此方法得到的抗体是用在生物体内自然合成的全长imp13蛋白做抗原得到的，imp 13蛋白的结构没有改变，因此得到的imp 13抗体不仅可以免疫变性后的imp 13线性蛋白，而且可以免疫有活性的具天然构象imp 13蛋白，同时特异性很强。在以下的实施例中将结合图1和图2用Western blot和免疫荧光反应来鉴定本发明的imp 13抗体不仅可以免疫变性的imp 13线性蛋白，而且还可以免疫具活性的imp 13蛋白以及此抗体的特异性。
图1为用自制的imp 13抗体和抗HA的抗体(对照)所做的Western blot图。在图1A中，用自制的imp 13抗体抗细胞内源表达及转染pIMP13-HA质粒的293T细胞表达的IMP 13蛋白。其中，1、imp 13纯化蛋白；2、PC 12细胞；3、293T细胞；4、转染了pIMP13-HA质粒的293T细胞。在图1B中，用抗HA抗体做转染pIMP13-HA的293T细胞的Western blot检测，以此作为阳性对照。
图2为在PC 12细胞中用自制的imp 13的抗体所做的免疫荧光染色图。
图3为在HeLa细胞中用自制的imp 13的抗体所做的免疫荧光染色图。
图4为imp 13蛋白纯化电泳图。在图4中，1、marker；2、没有用IPTG诱导的菌体蛋白；3、用IPTG诱导后的菌体蛋白；4、菌体裂解后的上清；5、纯化的imp 13蛋白。
具体实施例方式
以下实施例将结合附图对本发明作进一步说明。
实施例11、培养BL21。把重组表达质粒转化到大肠杆菌BL21中，37℃培养转化了重组质粒的BL21到OD值0.7。图4第2道给出培养的未加IPTG诱导剂的转化了表达重组质粒的BL21全菌蛋白电泳图。
2、在BL21中诱导表达细胞核质转移受体蛋白13。在培养的大肠杆菌BL21培养液中加入IPTG至0.15mM，25℃诱导4h。图3第3道给出诱导后的目的蛋白表达的BL21全菌蛋白电泳图。
3、裂解表达细胞核质转移受体蛋白13的BL21。把诱导后的菌体离心收集后，用PBS(pH8.0)重悬，加DTT至终浓度5mM，加溶菌酶溶菌1h，再超声波破碎35次，每次6s。然后把破碎后的菌液在4℃条件下，10000rpm离心10min，收集上清。图4第4道给出表达目的蛋白的BL21裂解后上清中的蛋白电泳图。
4、细胞核质转移受体蛋白13与Glutathione-Sepharose-4B亲合结合。将上清与Glutathione-Sepharose-4B的beads混合，4℃孵育过夜后再于4℃500rpm离心5min，收集beads。
5、层析法纯化得到有生物活性的细胞核质转移受体蛋白13。用10mM谷胱甘肽从beads上洗脱下细胞核质转移受体蛋白13。图4第5道给出细胞核质转移受体蛋白13纯化后的情况。
6、用纯化的细胞核质转移受体蛋白13做抗原去免疫兔子。每只兔子每次用抗原蛋白150μg，间隔1周后用不完全福氏佐剂加强。连续4次。
7、得到了细胞核质转移受体蛋白13的抗体。于免疫第4次后1周取少量血清，测效价＞10000，取血，得到相应的抗血清。
所得到的抗体是用在生物体内自然合成的全长imp 13蛋白做抗原得到的，imp 13蛋白的结构没有改变，不仅可以免疫变性后的imp 13线性蛋白，而且可以免疫有活性的具天然构象imp 13蛋白，而且特异性很强。图1和图2就是用Western blot和免疫荧光反应来鉴定本发明imp 13抗体的，不仅可以免疫变性的imp 13线性蛋白，而且还可以免疫具活性的imp 13蛋白以及此抗体的特异性。
实施例2与实施例1类似，其不同在于把重组表达质粒转化到大肠杆菌BL21中，37℃培养转化了重组质粒的BL21到OD值0.5。在培养的大肠杆菌BL21培养液中加入IPTG至0.5mM，25℃诱导2.5h。裂解表达细胞核质转移受体蛋白13的BL21。把诱导后的菌体离心收集后，用PBS(pH8.0)重悬，加DTT至终浓度1mM，加溶菌酶溶菌30min，再超声波破碎30次，每次6s。然后把破碎后的菌液在4℃条件下，11000rpm离心8min，收集上清。细胞核质转移受体蛋白13与Glutathione-Sepharose-4B亲合结合。将上清与Glutathione-Sepharose-4B的beads混合，4℃孵育过夜后再于4℃500rpm离心5min，收集beads。用纯化的细胞核质转移受体蛋白13做抗原去免疫兔子。每只兔子每次用抗原蛋白200μg，间隔1周后用不完全福氏佐剂加强，连续4次。得到了细胞核质转移受体蛋白13的抗体。于免疫第4次后1周取少量血清，测效价＞10000，取血，得到相应的抗血清。
实施例3与实施例1类似，其不同在于把重组表达质粒转化到大肠杆菌BL21中，37℃培养转化了重组质粒的BL21到OD值1.0。在培养的大肠杆菌BL21培养液中加入IPTG至0.3mM，25℃诱导3h。把诱导后的菌体离心收集后，用PBS(pH8.0)重悬，加DTT至终浓度5mM，加溶菌酶溶菌40min，再超声波破碎40次，每次5s。然后把破碎后的菌液在4℃条件下，9500rpm离心12min，收集上清。将上清与Glutathione-Sepharose-4B的beads混合，4℃孵育过夜后再于4℃450rpm离心6min，收集beads。用纯化的细胞核质转移受体蛋白13做抗原去免疫兔子，每只兔子每次用抗原蛋白200μg，间隔1周后用不完全福氏佐剂加强，连续4次。得到了细胞核质转移受体蛋白13的抗体。于免疫第4次后1周取少量血清，测效价＞10000，取血，得到相应的抗血清。
实施例4与实施例1类似，其不同在于把重组表达质粒转化到大肠杆菌BL21中，37℃培养转化了重组质粒的BL21到OD值0.8。在培养的大肠杆菌BL21培养液中加入IPTG至0.1mM，25℃诱导5h。把诱导后的菌体离心收集后，用PBS(pH8.0)重悬，加DTT至终浓度10mM，加溶菌酶溶菌50min，再超声波破碎35次，每次6s。然后把破碎后的菌液在4℃条件下，10000rpm离心10min，收集上清。将上清与Glutathione-Sepharose-4B的beads混合，4℃孵育过夜后再于4℃500rpm离心5min，收集beads。用纯化的细胞核质转移受体蛋白13做抗原去免疫兔子，每只兔子每次用抗原蛋白200μg，间隔1周后用不完全福氏佐剂加强，连续4次。得到了细胞核质转移受体蛋白13的抗体。于免疫第4次后1周取少量血清，测效价＞10000，取血，得到相应的抗血清。
权利要求
1.细胞核质转移蛋白13抗体制备方法，其特征在于其步骤为1)将表达全长细胞核质转移受体蛋白13蛋白质的重组表达质粒pGEX-4T-2-imp 13转化到大肠杆菌BL21中；2)培养转化重组质粒的BL21到OD值为0.5～1.0；3)在培养的大肠杆菌BL21中加入IPTG至0.1～0.5mM，诱导；4)将诱导后的菌体离心收集，用PBS重悬，先加入DTT至终浓度1～10mM，后加溶菌酶溶菌，再超声波破碎，把破碎后的菌液离心，收集上清；5)将上清与Glutathione-Sepharose-4B的beads混合，孵育后离心收集beads；6)用谷胱甘肽洗脱下细胞核质转移受体蛋白13；7)用纯化后的细胞核质转移受体蛋白13作为抗原免疫兔子，得到细胞核质转移受体蛋白13的抗体，用不完全福氏佐剂加强；8)测抗细胞核质转移受体蛋白13的血清效价，取血，得到相应的抗血清。
2.如权利要求1所述的细胞核质转移蛋白受体13抗体制备方法，其特征在于在步骤2)中，所述的培养其温度为37℃。
3.如权利要求1所述的细胞核质转移蛋白受体13抗体制备方法，其特征在于在步骤3)中，所述的诱导其温度为25℃，时间为2～5h。
4.如权利要求1所述的细胞核质转移蛋白受体13抗体制备方法，其特征在于在步骤4)中，所述的PBS其pH值为8.0，加入的DTT浓度为5mM，加溶菌酶溶菌的时间为30～60min，超声波破碎35次，每次6s；然后把破碎后的菌液在4℃下，10000rpm离心10min，收集上清。
5.如权利要求1所述的细胞核质转移蛋白受体13抗体制备方法，其特征在于在步骤5)中，把细菌裂解上清与Glutathione-Sepharose-4B的beads混合，在4℃下孵育过夜，第二天4℃下，500rpm离心5min收集beads。
6.如权利要求1所述的细胞核质转移蛋白受体13抗体制备方法，其特征在于在步骤6)中，用10mM谷胱甘肽洗脱下细胞核质转移受体蛋白13。
7.如权利要求1所述的细胞核质转移蛋白受体13抗体制备方法，其特征在于在步骤7)中，每只兔子每次用抗原蛋白200μg，间隔1周后用不完全福氏佐剂加强，连续4次。
8.如权利要求1所述的细胞核质转移蛋白受体13抗体制备方法，其特征在于在步骤8)中，所述的取血是在免疫第4次后1周取血，所测血清效价应＞10000，若所测血清效价≤10000，则需再进行免疫。
全文摘要
核质转移蛋白受体13蛋白的表达、纯化及其抗体制备方法，涉及一种蛋白表达、纯化及抗体制备，尤其是涉及一种核质转移蛋白受体13(imp 13)抗体的制备方法。提供一种以在生物体内合成的有生物活性的imp 13的全长蛋白做抗原制备核质转移受体蛋白13抗体的方法。步骤为将全长importin 13基因插入到表达质粒pGEX－4T－2，然后转化到大肠杆菌中，在BL21中表达目的蛋白；经层析法纯化得到有生物活性的蛋白用纯化后的蛋白做抗原去免疫兔子，得到了imp 13的抗体，用不完全福氏佐剂加强，测效价，取血，得到相应的抗血清。
文档编号C07K16/18GK1807596SQ20061000538
公开日2006年7月26日 申请日期2006年1月19日 优先权日2006年1月19日
发明者陶涛, 彭梓 申请人:厦门大学