酶制剂的制作方法

专利名称：酶制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及具有增加的稳定性、优选是热稳定性的固体或液体酶制剂，该制剂通过添加单细胞蛋白质得到。
对于饲料用途，稳定的、优选是热稳定的酶通常为人们所关注，以避免可能在配制(例如喷雾干燥、制粒)和饲料处理工艺(例如制丸、挤出、膨化)过程中发生的问题，在所述过程中的瞬时高温(高达80-120℃)、湿气和剪切应力可能影响蛋白质结构，和导致不希望的活性损失。
由于多种原因，通常将酶添加到饲料和食品中。对于食品应用，例如在烘焙或酿酒中添加酶。在饲料应用中酶的功能常使是为了改进饲料的转化速度，例如通过降低粘度或通过减少一些饲料化合物的抗营养作用。还可以使用饲料酶，例如以减少肥料中对环境有害的化合物的量。
在所有多种应用中，酶通常受到热挑战，如热、湿气或温度，这些可以使酶部分或全部失活。
尽管大量的磷酸盐以植酸磷的形式存在于饲料中，但是单胃动物如猪和家禽缺乏使用这种形式的磷酸盐的能力。植酸的碱性或碱土盐主要是天然存在于谷类中。由于单胃动物不能利用此形式的磷酸盐，因此通常的做法是向动物饲料中添加无机磷酸盐。
另一方面，已知被称作植酸酶(肌醇六磷酸磷酸水解酶)的酶存在于植物中和一些微生物中。由于植酸酶可以通过发酵产生，本领域已知使用植酸酶作为动物饲料添加剂从而通过从植酸(肌醇六磷酸)中释放无机磷酸盐来增强植物物质的营养价。通过向动物饲料中添加植酸酶，由于动物能够通过使用植酸酶利用从植酸中释放的磷酸盐，所以降低了环境磷污染的水平。
Gist-Brocades的国际专利申请WO 93/16175(EP 626 010)描述了植酸酶的稳定的液体制剂。建议尿素和水溶性的多羟基化合物用作稳定剂，对此提到了山梨糖醇、甘油和分子量为6000的聚乙二醇。
Hoffmann-La Roche的欧洲专利申请EP-A1 0 969 089描述了包含植酸酶和至少一种选自下列的稳定剂的稳定酶制剂a)包含五个碳原子的多羟基化合物，优选是C5糖，更优选是木糖醇或核糖醇，b)分子量为600-4000Da的聚乙二醇，c)丙二酸、戊二酸和琥珀酸的二钠盐，d)羧甲基纤维素，以及e)藻酸钠。它另外描述了通过交联得到的稳定植酸酶制剂，所述交联通过a)与戊二醛的化学反应进行；或b)通过与高碘酸钠的氧化并且随后与己二酸二酰肼加成而进行。
WO 98/54980描述了包含颗粒的植酸酶并且WO 98/55599描述了高活性的植酸酶液体以及包含它们的饲料制品。
EP 0 758 018描述了盐稳定的酶制品，其中酶是通过添加无机盐如硫酸锌、硫酸镁和/或硫酸钙来稳定的。
本发明的目的是提供可供选择的稳定剂以及改进酶的稳定性，优选是改进热稳定性，其中稳定性定义为在多种条件下保持活性的能力。此稳定性方面涉及酶的完整生命周期，其包括产生(发酵、下游加工和配制)、分销(运输和储存)以及最终应用(饲料和/或食品的生产和储存)。对于商业目的的酶，例如对于植酸酶，重要的是能承受在多种饲料和/或食品处理工艺(如制丸、挤出和膨化)中达到的高温和高湿(高达80-120℃)，并且在添加到饲料和/或食品中后的储存过程中是稳定的，尤其当长期储存时。本发明的另一目的是提供可供选择的稳定剂，其可以按照比本领域已知的那些稳定剂小的量应用，这是因为稳定剂在最终制剂中的量限制了可以添加到含酶制剂中的其它成分。本发明的再一目的是提供尤其可用于酶混合物的稳定剂。如果酶制品是从多于一种发酵肉汤中制备的，那么可以添加到最终制剂中的稳定剂的量受到限制。特别要注意的是，如果在最终产品中需要高的酶浓度，则可以添加到最终制剂中的稀释剂的量受到限制。在本发明的另一方面，如果使用酶的混合物，稳定剂还优选应当不只稳定一种酶，而是稳定在混合物中的所有酶。
本发明用到的术语“稳定性”是指工业酶的所有指标，其包含的方面如活性、特异性、保存期稳定性、机械稳定性、微生物稳定性、毒性、化学组成和物理参数如密度、粘度、湿度，以及还有颜色、气味和粉尘。本发明优选的方面涉及酶、优选是植酸酶和/或糖苷酶在配制及饲料和/或食品处理工艺如制丸、挤出和彭化过程中抵抗热钝化的稳定性。
酶，尤其是植酸酶、木聚糖酶和内切葡聚糖酶广泛应用的主要障碍是这些酶在饲料和/或食品处理工艺过程中抵抗钝化所需要的热稳定性(80-120℃)的限制。大多数现在可利用的用于饲料和/或食品应用的工业酶对热钝化具有不足的固有抵抗性。作为选择或除分子生物学方法外，本发明通过添加不同的添加剂增强了酶的稳定性，特别是热稳定性。
本发明的又一目的是提供将酶制剂稳定并且同时贡献酶制剂的营养价的试剂。这在动物和人类营养学领域中的酶应用中是特别有意义的。
本发明公开了单细胞蛋白质的用途，其作用为酶或酶混合物的稳定性、优选热稳定性的稳定剂。
本文用到的术语“酶”包括单一种酶以及不同酶(例如植酸酶和木聚糖酶)的混合物，以及不同来源的同一种酶(例如真菌植酸酶和细菌植酸酶)的混合物。
用于本发明制剂的优选的酶包括可用于食品(包括烘焙)和饲料工业中的那些酶。
此类酶包括但不限于蛋白酶(细菌、真菌、酸性、中性或碱性)，优选是具有中性和/或酸性最佳pH的酶。
此类酶包括但不限于脂酶(真菌、细菌、哺乳动物)，优选是磷脂酶如哺乳动物胰磷脂酶A2或任何三酰甘油脂酶(E.C.3.1.1.3)。
此类酶包括但不限于糖苷酶(E.C.3.2，也已知为糖酶)，例如淀粉酶(α或β)、纤维素酶(全纤维素酶或其功能性部分)，特别是木聚糖酶、内切葡聚糖酶、半乳糖苷酶、果胶酶和β-半乳糖苷酶。
此类酶包括但不限于磷酸酶，如植酸酶(3-植酸酶和6-植酸酶)和/或酸式磷酸酶。
此类酶包括但不限于葡糖氧化酶。
蛋白酶(蛋白水解酶)可以是微生物酶，优选的蛋白酶来自细菌或真菌菌株或者蛋白酶可以是胃蛋白酶或胰蛋白酶。在优选的实施方案中，蛋白水解酶是来自芽孢杆菌属(Bacillus)菌株的细菌蛋白酶，所述菌株优选是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)。商业可得的芽孢杆菌蛋白酶是AlcaseTM和NeutraseTM(Novozymes，丹麦)。在另一优选的实施方案中，蛋白水解酶是来自曲霉属(Aspergillus)菌株的真菌蛋白酶，所述菌株优选是棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)的菌株、黑曲霉(Aspergillus niger)的菌株、米曲霉(Aspergillus oryzae)的菌株。商业可得的曲霉蛋白酶是FlavourzymeTM(Novozymes，丹麦)。
糖苷酶可以是任何糖苷酶(EC 3.2.1，也已知为糖酶)。优选的是，糖苷酶是淀粉酶，特别是α-淀粉酶或β-淀粉酶；纤维素酶，特别是内切-1，4-β-葡聚糖酶(E.C.3.2.1.4))或内切-1，3-β-葡聚糖酶(E.C.3.2.1.6)；木聚糖酶，特别是内切-1，4-β-葡聚糖酶(E.C.3.2.1.8)或木聚糖-内切-1，3-β-木糖苷酶(E.C.3.2.1.32)；α-半乳糖苷酶(E.C.3.2.1.22)；多聚半乳糖醛酸酶(E.C.3.2.1.15，也已知为果胶酶)；纤维素-1，4-β-cellobiosidase(E.C.3.2.1.91，也已知为纤维二糖水解酶)；内切葡聚糖酶，特别是内切-1，6-δ-葡聚糖酶(E.C.3.2.1.75)、内切-1，2-β-葡聚糖酶(E.C.3.2.1.71)、内切-1，3-β-葡聚糖酶(E.C.3.2.1.39)或内切-1，3-α-葡聚糖酶(E.C.3.2.1.59)。
本发明优选的内切-1，4-β-葡聚糖酶(E.C.3.2.1.4)是WO 01/70998(BASF AG)中描述的内切-1，4-β-葡聚糖酶，前述文献据此引入本文作为参考。
在本发明优选的实施方案中，酶是至少一种木聚糖酶。木聚糖酶可以是从微生物来源得到的，例如从黑曲酶(Aspergillus niger)、热纤维梭菌(Clostridium thermocellum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、微紫青霉(Penicillium janthinellum)，以及芽孢杆菌属和链霉菌属(Streptomyces)的物种得到。木聚糖酶还可以通过在例如EP 121 138中描述的重组表达得到。在优选的实施方案中，根据本发明可以使用在EP 0 463 706 B1(BASF AG)和/或在WO 02/24926 A1(BASF AG)中描述的木聚糖酶。
根据本发明适合的木聚糖酶可以是内切-木聚糖酶和/或木聚糖外切酶。
适合的酶是那些可包含在动物饲料(其包括宠物食品)中和/或人营养品中的酶。这些酶的功能通常是改进食品转化速度，例如通过降低粘度或通过减少某些饲料化合物的抗营养作用。饲料酶还可以用来例如减少肥料中对环境有害的化合物的量。
当本发明的酶制剂用于食品应用时，酶必须是食品质量级别的。
在本发明范围内的是使用至少一种、优选是两种、更优选是三种或更多不同的酶。这些可以是来自同类的酶，例如两种不同的植酸酶，或来自不同类的酶，例如植酸酶和木聚糖酶。应该理解的是，当提到酶时，酶的混合物也包括在前述术语中，而不必考虑此类混合物是可在单一发酵中直接得到的还是可通过混合可在不同发酵中得到酶而得到的；并且另外包括可通过重组生物的发酵得到的酶。
在优选的实施方案中，酶选自植酸酶、木聚糖酶和内切葡聚糖酶及其混合物。
在优选的实施方案中，酶是至少一种植酸酶。
术语“植酸酶”不仅指天然存在的植酸酶，还指具有植酸酶活性的任何酶，所述活性例如为催化涉及从肌醇磷酸盐中移除或释放无机磷(磷酸盐)的反应的能力。优选的植酸酶属于类EC 3.1.3.8。植酸酶可以是3-植酸酶和/或6-植酸酶。
将植酸酶活性的一个单位(＝FTU)定义为在pH为5.5和37℃下，每分钟从0.0051mol/l的植酸钠中释放1微摩尔无机磷的酶量。
分析方法基于从过量添加的植酸钠中释放无机磷酸盐。在pH 5.5和37℃下的培育时间是60分钟。释放的磷酸盐通过黄钼-钒复合物确定并且在415nm波长下以光度法评估。平行进行具有已知活性的植酸酶标准用于比较。将所测的样品吸光度的增加表示为对标准的比值(相对方法，官方AOAC方法)。
植酸酶活性可以根据“Determination of Phytase Activity in Feed by aColorimetric Enzymatic Method”Collaborative Interlaboratory Study，Engelen等人Journal of AOAC International第84卷，No.3，2001测定。
根据本发明的植酸酶可以是微生物来源的和/或它可以通过天然存在的植酸酶的遗传修饰和/或通过重新构建(遗传工程)来得到。
在优选的实施方案中，植酸梅是植物植酸酶、真菌植酸酶、细菌植酸酶或可通过酵母产生的植酸酶。
植酸酶优选来自如细菌、真菌和酵母的微生物来源，还有植物来源。在优选的实施方案中，植酸酶来自真菌菌株，特别是曲霉属的菌株，例如黑曲霉、米曲霉、无花果曲霉(Aspergillus ficuum)、泡盛曲霉(Aspergillusawamori)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)和土曲霉(Aspergillus terreus)。最优选的是来自黑曲霉菌株或米曲霉菌株的植酸酶。
在另一优选的实施方案中，植酸酶来自细菌菌株，特别是芽孢杆菌属的菌株或假单胞菌属(Pseudomonas)的菌株。优选的是，植酸酶来自枯草芽孢杆菌的菌株。
在再一优选的实施方案中，植酸酶来自细菌菌株，特别是大肠杆菌(E.coli)的菌株。
在又一优选的实施方案中，植酸酶来自酵母，特别是克鲁维酵母属(Kluveromyces)的菌株或酵母属(Saccharomyces)的菌株。优选植酸酶来自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的菌株。
在本发明的上下文中，“来源的酶”包括具体菌株天然产生的酶，可以是从该菌株中回收的或通过从此菌株中分离的DNA序列编码并且在用所述DNA序列转化的宿主生物中产生的。
植酸酶可以通过使用任何适合的技术来自所讨论的微生物。特别地，植酸酶可以通过在适合的营养培养基中发酵能产生植酸酶的微生物，随后通过本领域已知的方法分离酶来得到。
用于培养的肉汤或培养基可以是适合于所讨论的宿主细胞生长的任何常规培养基，并且可以根据本领域的原则来构成。培养基优选包含碳源和氮源以及其它无机盐。适合的培养基，例如基本培养基或复合培养基可以市购，或可以根据公开的方案(例如菌株的美国模式培养物保藏所(ATCC)目录)来制备。
培养后，将植酸酶通过从培养肉汤中分离和纯化蛋白质的常规方法回收。众所周知的纯化方法包括用离心或过滤从培养基中分离细胞，通过盐如硫酸铵沉淀培养基的蛋白质成分，以及层析方法如离子交换层析法、凝胶过滤层析法、亲和层析法等。
作为选择，优选使用重组DNA技术如在EP-A1-0 420 358中描述的重组DNA技术大量产生植酸酶，所述文献据此引入本文作为参考。
优选的是，将用从物种无花果曲霉或黑曲霉得到的植酸酶编码基因转化的物种曲霉属的真菌在EP-A1-0 420 358中描述的有益于植酸酶编码基因表达的条件下培养。
在本发明配制中，优选将包含植酸酶的发酵肉汤在使用前通过过滤和超滤处理。
在本发明另外的优选实施方案中，使用来自分子工程的植酸酶，例如如在WO 94/03072(Rhm)、WO 99/49022(Novozymes)、WO 00/43503(Novozymes)或在WO 03/102174(BASF AG)中描述的遗传修饰的植酸酶。
优选用于本发明的另一植酸酶是所谓的共有植酸酶。这是根据理论分子生物学方法开发的植酸酶，其比曲霉属植酸酶具有更高的固有稳定性，见欧洲专利申请公开第897 985号。在本发明的实践中，还可以使用在实施例3-13中具体描述的共有植酸酶。
还可以通过遗传工程产生此类植酸酶，其中将从真菌中得到的基因转移到诸如细菌(例如大肠杆菌)、酵母或其它真菌的宿主生物中，详细情况见欧洲专利申请公开第684 313号和欧洲专利申请公开第897 010号。
在本发明优选的实施方案中，可以使用根据EP-B1 420 358的植酸酶。
本发明说明书通篇使用的术语“单细胞蛋白质”、“单细胞蛋白质材料”、“SCP”包括来自单一来源(例如酵母)的单细胞蛋白质以及来自不同来源(例如酵母和真菌)的单细胞蛋白质的混合物。
单细胞蛋白质(缩写为SCP)包括由微生物如显微藻类、真菌、酵母和/或细菌的微生物获得的蛋白质。SCP的蛋白质含量可以为SCP从其获得的微生物的生物质干重的40-90重量％。在优选的实施方案中，SCP的蛋白质含量为60-90％之间，优选为70-90重量％。
在本发明的一个实施方案中，通过微生物发酵得到单细胞蛋白质，其中微生物选自藻类、真菌、酵母和/或细菌。
在本发明的一个实施方案中，将藻类用作微生物以通过发酵得到SCP。使用异养的以及光自养的藻类作为单细胞蛋白质的来源是在本发明范围内的。适合的藻类的实例是小球藻属(Chlorella)、栅藻属(Scenedesmus)、螺旋藻属(Spirulina)、空星藻属(Coelastrum)、尾丝藻属(Uronema)、杜氏藻属(Dunaliella)。
在本发明的一个实施方案中，将真菌用作微生物以通过发酵得到SCP。适合的真菌包括镰孢霉(Fusarium venenatum)、拟青霉(Paecilomycesvariotii)和毛壳菌(Chaetomium cellulolyticum)。在优选的实施方案中，使用所谓的Pekilo方法从拟青霉中得到单细胞蛋白质(“真菌蛋白”)。
在本发明优选的实施方案中，通过细菌和/或酵母发酵得到单细胞蛋白质。可以使用允许在食品产品中使用的任何细菌或酵母，并且本领域技术人员可以容易地选择适合的物种。特别优选的是，用于本发明的单细胞蛋白质材料是由甲烷营养型细菌和/或异养菌组成的微生物培养物。在优选的实施方案中，用于本发明的单细胞蛋白质材料是由甲烷营养型细菌任选地与一种或多种异养菌组合组成的微生物培养物，特别优选的是甲烷营养型细菌和异养菌的组合。如本文用到的，术语“甲烷营养型”包括利用甲烷或甲醇进行生长的任何细菌。术语“异养”用于利用不同于甲烷或甲醇的有机底物进行生长的细菌。
方便的是，可以通过发酵方法产生单细胞材料，其中将氧气和适合的底物如液体或气态的烃、醇或碳水化合物(例如甲烷、甲醇或天然气)与营养的矿物质溶液一起供给到包含微生物的管状反应器中。大量此类方法在本领域中是众所周知的并且描述过。
特别优选用于本发明中的是来自在烃级分或在天然气上发酵的单细胞蛋白质材料。尤其优选的是来自天然气发酵的单细胞蛋白质。当发酵罐中微生物的浓度增加时，取出反应器内容物或肉汤的一部分并且通过本领域熟知的技术如离心和/或超滤分离微生物。方便的是，在此类发酵方法中，将肉汤连续从发酵罐中取出，其具有的细胞浓度将为1-5重量％，例如约3重量％。
可以使用、处理由两种或更多种微生物产生的单细胞材料。尽管这些可以在同一个发酵罐中或分开的发酵罐中产生，但是通常将这些在相同发酵条件下在同一个发酵罐中产生。可以将从分开的发酵过程中产生的材料混合在一起。
用于本发明的优选的细菌包括荚膜甲基球菌(Methylococcuscapsulatus)(Bath)，它是最初从英国Bath的温泉中分离的嗜热菌，并且以NCIMB 11132储存在The National Collections of lndustrial and MarineBacteria，Aberdeen，Scotland。荚膜甲基球菌(Bath)在约45℃下最佳生长，尽管生长可以在37℃-52℃下发生。它是革兰氏阴性、不动的球形细胞，通常成对存在。胞内膜是以泡状盘束排列的，其特征为I类甲烷营养菌。
荚膜甲基球菌(Bath)在遗传上是非常稳定的生物，没有已知的质粒。它可以利用甲烷或甲醇进行生长，以及利用氨、硝酸盐或分子氮作为氮源进行蛋白质合成。
适合用于本发明的其它细菌包括异养菌食酸产碱菌(Alcaligenesacidovorans)DB3(菌株NCIMB 12387)，坚强芽孢杆菌(Bacillusfirmus)DB5(菌株NCIMB 13280)和短芽孢杆菌(Bacillusbrevis)DB4(菌株NCIMB 13288)，它们每种都是在温度为约45℃时最优生长。
食酸产碱菌DB3是革兰氏阴性、需氧的、运动的杆菌，属于假单胞菌科(Pseudomonadaceae)，其利用乙醇、乙酸盐、丙酸盐和丁酸盐进行生长。短芽孢杆菌DB4是革兰氏阴性、形成内生孢子、需氧的杆菌，属于芽孢杆菌属，其可以利用乙酸盐、D-果糖、D-甘露糖、核糖和D-塔格糖。
坚强芽孢杆菌DB5是芽孢杆菌属的革兰氏阴性、形成内生孢子、运动的需氧杆菌，其可以利用乙酸盐、N-乙酰基-葡糖胺、柠檬酸盐、葡糖酸盐、D-葡萄糖、甘油和甘露糖醇。
用在本发明方法中的适合的酵母可以选自酵母属和假丝酵母属(Candida)。
在EP-A-306466(Dansk Bioprotein)中描述了使用天然气作为唯一碳源和能量源的发酵方法的一个实例。此方法基于在甲烷上生长的甲烷营养型细菌荚膜甲基球菌的连续发酵。将空气或纯氧气用于氧合作用，并且将氨用作氮源。除了这些底物，细菌培养物一般需要水、磷酸盐(例如磷酸)和一些矿物质，其可以包括镁、钙、钾、铁、铜、锌、锰、镍、钴和钼，它们通常用作硫酸盐、氯化物或硝酸盐。用于产生单细胞材料的所有矿物质应当是饲料或食品级别质量的。
天然气主要由甲烷组成，尽管其组成由于不同的天然气田而不同。通常而言，可以期望天然气包含约90％的甲烷、约5％的乙烷、约2％的丙烷和一些高级烃。在天然气发酵过程中，通过甲烷营养型细菌将甲烷氧化为生物质和二氧化碳。甲醇、甲醛和甲酸是代谢中间体。甲醛以及多少有一点的二氧化碳被吸收到生物质中。但是，甲烷营养型细菌不能利用包含碳-碳键的底物进行生长，并且通过甲烷营养型细菌将天然气的剩余成分，即乙烷、丙烷以及多少有一点的高级烃氧化，产生相应的羧酸(例如将乙烷氧化成乙酸)。此类产物可以是甲烷营养型细菌的抑制剂并且因此重要的是在生物质产生过程中，将它们的浓度维持在低水平，优选低于50mg/l。
此问题的一个解决方法是，组合使用一种或多种能够利用甲烷营养型细菌产生的代谢物的异养菌。此类细菌还能够利用细胞裂解释放到发酵肉汤中的有机材料。这对于避免泡沫形成是重要的，并且还用于将培养物被不希望的细菌所污染的危险性降至最低。异养菌和甲烷营养型细菌的组合产生了稳定和高产的培养物。
在单细胞材料产生过程中，通常将发酵混合物的pH调节为约6至7，例如6.5±0.3(6.5 f 0.3)。本领域的技术人员可以容易地选择用于pH调节的适合的酸/碱。
特别适合用于此方面的是氢氧化钠和硫酸。在发酵过程中，发酵罐中的温度应优选保持为40℃-50℃，最优选为45℃±2℃(45℃ f 2℃)。
特别优选用于本发明的是这样的微生物培养物，其包含甲烷营养型细菌荚膜甲基球菌(Bath)(菌株NCIMB 11 132)以及异养菌食酸产碱菌DB3(菌株NCIMB 12387)和坚强芽孢杆菌DB 5(菌株NCIMB 13280)的组合，并任选与短芽孢杆菌DB4(菌株NCIMB 13288)组合。食酸产碱菌DB3的作用是利用荚膜甲基球菌(Bath)从天然气中的乙烷和丙烷中产生的乙酸盐和丙酸盐。食酸产碱菌DB3可以占所得生物质的总细胞计数的不超过10％，例如为约6-8％。短芽孢杆菌DB4和坚强芽孢杆菌DB5的作用是利用培养基中的裂解产物和代谢物。通常而言，在连续发酵过程中，短芽孢杆菌DB4和坚强芽孢杆菌DB5每种不到所述细胞计数的1％。
用于制备单细胞材料的合适发酵罐是环形的那些，如在DanskBioprotein的DK 1404/92、EP-A-418187和EP-A-306466中所描述的那些，或者气升式反应器。由于发酵罐的活塞式流动特征，具有静态混合器的环形发酵罐结果导致高效利用气体(例如高达95％)。气体在沿环的一些位置上被引入并且保持与液体接触，直到它们在环末端被分离到液面上空间中。可以使用2-3％生物质(基于干重)和每小时0.02-0.50，例如每小时0.05-0.25的稀释速度来实现连续发酵。
其它发酵罐可以用在制备单细胞材料中并且这些包括管状发酵罐和搅拌釜发酵罐。
理想地，天然气发酵产生的生物质将会包含60-80重量％的粗蛋白质；5-20重量％的粗脂肪；3-10重量％的灰；3-15重量％的核酸(RNA和DNA)；10-30g/kg的磷；不超过350mg/kg的铁；以及不超过120mg/kg的铜。特别优选的是，生物质将会包含68-73重量％、例如约70重量％的粗蛋白质；9-11重量％、例如约10重量％的粗脂肪；5-10重量％、例如约7重量％的灰；8-12重量％、例如约10重量％的核酸(RNA和DNA)；10-25g/kg的磷；不超过310mg/kg的铁；以及不超过110mg/kg的铜。蛋白质含量的氨基酸分布在具有高比例的更重要的如下氨基酸的情况下应该在营养上是有利的半胱氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸、赖氨酸、色氨酸和精氨酸。通常这些可以分别以约0.7％、3.1％、5.2％、7.2％、2.5％和6.9％的量存在(表示为氨基酸总量的百分数)。
通常脂肪酸将主要包含饱和的棕榈酸(约50％)和单不饱和的棕榈油酸(约36％)。产品的矿物质含量通常包含高含量的磷(约1.5重量％)、钾(约0.8重量％)和镁(约0.2重量％)。通常而言，将从连续发酵过程中得到的单细胞蛋白质材料进行离心和过滤，例如超滤，即移除大多数存在的水并且在均化前形成含水糊或浆体的方法。在离心过程中，生物质的干料含量通常从约2重量％增加到约15重量％，例如增加到约12重量％。可以在40-50℃、例如42-46℃的温度下进行的超滤进一步将生物质浓缩到包含10-30重量％、优选15-25重量％、例如15-22重量％单细胞材料的产品。在超滤过程中使用的大小排阻通常在约100,000道尔顿的范围内。
超滤后，可将生物质冷却，优选冷却到10-30℃的温度，例如冷却到约15℃，例如通过将来自超滤单元的浓缩的蛋白质浆体通过换热器，之后可将其在恒温下保存在缓冲罐中，例如在10-20℃、更优选5-15℃的温度下于pH 5.5-6.5下保存1-24小时、优选5-15小时、例如5-12小时。
在本发明优选的实施方案中，单细胞蛋白质将以均化的生物质使用。
如本文用到的，术语“均化的”或“均浆”等意欲指已经被制造或变均匀的任何产物，优选进行了均化过程的产物。
术语“均匀的”意欲涵盖细胞成分的任何基本均匀的分散体、悬液体或乳状液。一般来说，可以将均一性程度为至少60％、或更优选至少70或80％的任何产物认为是基本均匀的。例如，基本均匀的分散体、悬液体或乳状液可以具有超过90％、优选超过95％的均一性程度。
通常而言，根据本发明的均化过程将涉及处理可流动的含水的糊或浆体形式的微生物单细胞材料。总体上，这基本上由完整细胞材料组成，但是还可以存在部分破裂的细胞材料。
单细胞生物如细菌由大量极小的细胞组成，每个细胞包含包被在细胞壁结构中的蛋白质。细胞壁是较刚性的，用于提供机械支撑。在本发明的均化过程中，将微生物细胞壁破坏，从而从细胞结构内释放部分蛋白质。这可以通过例如顺序地施压和减压单细胞材料来实现。可以通过将材料加压到不超过150MPa(1500bar)、优选不超过140MPa(1400巴)、例如不超过120MPa(1200巴)的压力实施均化。但是，据信用来确定该方法效率的实际压降以及典型的压降为40-120MPa，更优选50-110MPa，例如60-100MPa。
通常而言，所述方法将在受控制的温度条件下、优选在低于50℃的温度下、特别优选在25-50℃、例如25-35℃的温度下、在工业均化器(例如可从APV Rannie，Denmark得到)中进行。
本领域已知的其它方法可以用来进行根据本发明的均化。例如，均化可以通过使单细胞材料收到能够破坏细胞壁的剪切力来进行。这可以使用这样的混合器来实现，在所述混合器中，使材料通过借助彼此相对的表面移动向其施加剪切力的区域。总体上，剪切力将在移动的表面如转动的表面与静止表面之间产生，即，如在WO99/08782中描述的转子-定子中产生。
已知用于机械细胞碎裂方法的其它技术，例如高速球磨法也可以用来实现均化。还可以使用超声方法。
均化可以在常规高压均化器中进行，其中将细胞通过第一次加压例如加至压力不超过150MPa(1500巴)而使其破裂，之后将均化器内部减压。优选的是，施加到生物质上的总压降为40-120MPa(400-1200巴)。例如约80MPa(800巴)。压力的下降可以是逐步的，即，这可以包括一步或多步，但是这通常包括一步或两步，优选一步。在用两步方法实现的均化情况下，优选在第二步中的压降应当小于均化器中总压降的1/5，优选小于1/10，例如约为1/20。均化过程中材料的温度优选应当不超过50℃。
本文描述的均化方法使得产生了这样的产物，其包含、优选是基本上由破裂的细胞材料组成。例如，破裂的细胞材料可以以至少80％、优选至少90重量％的量存在。通常而言，产物将会是包含可溶性和颗粒状细胞成分的较粘稠的蛋白质浆体。尽管这可以直接用作食品和/或饲料产品中的添加剂，但这通常会进行另外加工，从而从产品中除去过量的水。任何额外的干燥步骤的选择将取决于均化后产品的水含量以及最终产物所需的湿含量。
通常而言，根据本领域众所周知的喷雾干燥技术将产物进一步加工。可以使用有或没有流动床单元的任何常规喷雾干燥器，例如可从丹麦APVAnhydro市购的3-SPD型喷雾干燥器。优选的是，喷雾干燥器中空气的入口温度可以是约300℃，并且出口温度可以是约90℃。优选的是，所得产物将具有约2-10重量％、例如6-8重量％的水含量。所得产物的粒度通常为0.1-0.5mm。
特别优选的是，均化步骤之后紧接着进行喷雾干燥。作为选择，可能必要的是或者实际上希望的是，在进一步加工前将均化的产物储存或保存在例如储罐或缓冲罐中。在此类情况下，已经发现产物储存的条件可以减少喷雾干燥后最终产物的胶凝性能。均化材料的胶凝性能可以通过将其在温度低于20℃以及pH＜7、优选＜6.5特别优选pH 5.5-6.5、例如5.8-6.5下储存来保持。在这些条件下，可以将产物储存24小时，而不会有胶凝性能的任何显著损失。
在本发明范围内的是使用已经另外修饰或改良了性能的单细胞蛋白质。例如US-A-3843807(Standard Oil Company)描述了构造包含蛋白质的单细胞微生物的方法，其中将包含完整细胞和破裂细胞的混合物的含水酵母糊挤出。经过随后的加热和干燥步骤，得到具有所需性能如咀嚼性、松脆性和抵抗在水中分散性的产物，这使其特别适合于用作人食品的添加剂。还可以通过含水酵母浆体的热处理来得到具有改良功能性性能的单细胞蛋白质(见Standard Oil Company的US-A-4192897)。经热处理的产物提高了人食品中的香味，并且增加了平滑的口感。
在优选的实施方案中，根据EP 1 265 982 B1中描述的方法均化单细胞蛋白质，所述文献据此引入本文作为参考。
应该理解的是，对于酶从微生物来源获得的情形，单细胞蛋白质优选从不同的微生物来源得到，或者将其以在分离出酶的微生物中所不存在的量添加。
术语“酶制剂”包含所有的液体和固体制剂，其中酶可以是商业化的。优选的是，用于此类制剂的酶来源是从发酵肉汤中得到的相当自然的液体制品。对于根据本发明制备液体酶制剂，可以将SCP直接添加到发酵肉汤中或者可以纯化发酵肉汤，例如通过过滤或超滤，并且之后在过滤步骤后添加SCP剂。
为了得到稳定的、优选热稳定的固体制剂，可以在SCP存在下将酶喷雾干燥或制粒。
固体制剂优选是包含少于15重量％、优选少于10重量％、尤其少于8重量％的水的制剂。
在本发明优选的实施方案中，固体制剂是颗粒。
本发明说明书通篇使用的术语“颗粒”无区别地包括单颗粒以及多颗粒。
在本发明的另外方面中，提供了包含至少一种酶和至少一种单细胞蛋白质的颗粒。
单细胞蛋白质的存在量基于待加工混合物的总重量通常为0.01-30重量％，如1-20重量％，例如3-10重量％。
在另外的实施方案中，颗粒额外包含至少15重量％的碳水化合物载体。
至少15重量％的固体载体由食用的碳水化合物聚合物构成。但是优选的是，至少30重量％的固体载体包含碳水化合物，最优是至少40重量％。有利的是，固体载体的主要成分是碳水化合物(例如淀粉)，例如50重量％，优选至少60重量％，适合地至少70重量％，最优是至少80重量％。这些重量百分数基于最终干燥颗粒中非酶成分的总重量。
可食用碳水化合物聚合物的选择应使得，它能够为意图分别使用饲料或食品的动物或人所食用，并且还优选是可消化的。聚合物优选包含葡萄糖(例如包含葡萄糖的聚合物)或(C6H10O5)n单元。优选的是，碳水化合物聚合物包含α-D-吡喃型葡萄糖单元、直链淀粉(线性(1-＞4)α-D-葡聚糖聚合物)和/或支链淀粉(具有α-D-(1-＞4)和α-D-(1-＞6)键的支链D-葡聚糖)。淀粉是优选的碳水化合物聚合物。可以用来替代淀粉或除淀粉外其它适合的包含葡萄糖的聚合物包括α-葡聚糖、β-葡聚糖、果胶(如原果胶)和糖原。还可以想到的是这些碳水化合物聚合物的衍生物，如其醚和/或酯。合适的是，碳水化合物聚合物是水不溶性的。
适合的碳水化合物聚合物是玉米、马铃薯和稻淀粉。但是，从其它(例如植物，如蔬菜或农作物)来源如木薯(tapioca)、木薯(cassava)、小麦、玉米、西米、黑麦、燕麦、大麦、薯蓣、高粱或竹芋得到的淀粉是可同等应用的。类似地，天然或经修饰(例如糊精)类型的淀粉可以用于本发明。优选碳水化合物(例如淀粉)包含很少或不包含蛋白质，例如少于5重量％，例如少于2重量％，优选少于1重量％。不考虑淀粉(或其它碳水化合物聚合物)类型，它应当呈允许用于动物饲料的形式，换句话说，是可食用或可消化的形式。
本发明的另一方面涉及使用单细胞作为添加剂用于生产固体和/或液体植酸酶制剂。在本发明的此实施方案中，将SCP作为固体化合物优选添加到标准的制粒混合物中。此类制剂可以导致在高剪切制粒过程后确定的植酸酶活性增加复原率(高达20％)，所述方法包括在流化床干燥器上于45℃下将颗粒干燥15分钟的步骤。另外，当与饲料和/或食品混合时，此类包含本发明SCP的颗粒与不含所述添加剂的颗粒相比，可以表现出在饲料和/或食品处理(例如在85℃下制丸过程)后增加酶活性的复原率。
在本发明另外的实施方案中，提供了一种用于制备含酶颗粒的方法，该方法包括加工至少一种酶和至少一种单细胞蛋白质，以及任选地至少一种包含至少15重量％可食用碳水化合物聚合物的固体载体。
可以在加工中添加水。在本发明另外的实施方案中，在加工后干燥颗粒。应理解的是，在一个实施方案中，不管在加工中是否添加水，都可以干燥颗粒。
优选作为含酶(优选含水)液体如溶液或浆体提供酶和水，所述液体可以与单细胞蛋白质混合。SCP可以作为生物质或由生物质得到的纯化蛋白质添加。将这些成分与固体载体混合，并且允许这些成分吸收到载体上。应理解的是，如果在最终制剂中需要不同酶的混合物，则可以混合不同的含酶(优选含水)液体。
在混合过程中或者之后，将含酶液体和载体加工成颗粒，随后可将其干燥。使用碳水化合物载体可以允许吸收大量的含酶液体(并因此吸收酶)。混合物可以用来形成塑料浆体或非弹性面团，它们可以容易地加工成颗粒，例如可以将其挤出。
在本发明方法中，酶和水可以在接触固体载体前存在于同一组合物中。在此方面中，人们可以提供含酶的含水液体。该液体可以是来自或衍生自发酵过程的溶液或浆体。此发酵方法通常是产生酶的一种。发酵方法可以产生包含微生物(其产生酶)和水溶液的肉汤。该水溶液当从微生物中分离时(例如通过过滤)，它可以是用于本发明的含酶的含水液体。因此，在优选的实施方案中，含酶的含水液体是滤液，尤其是来自产生酶的发酵过程的滤液。在本发明的一个实施方案中，可以将根据本发明的单细胞蛋白质添加到此液体中。
可以吸收到载体上的含酶液体(以及因此酶)的量通常受到可以吸收的水量的限制。优选的是，添加到固体载体中的液体量是这样的量(基本上)，即，在(含水)液体中的所有水都被存在于固体载体中的碳水化合物吸收。
在温度升高时，淀粉和其它碳水化合物聚合物可以在溶胀下吸收更大量的水。由于此原因，碳水化合物聚合物理想的是能够吸收水(或含酶的含水液体)。例如，玉米淀粉在60℃下可以吸收多达三倍于其重量的水，并且在70℃下吸收多达十倍于其重量的水。因此，使用更高的温度来吸收更大量的含酶液体是本发明所预期的，并且确实是优选的，尤其是当处理热稳定的酶时。因此对于这些酶，可以在升高的温度下(例如高于环境温度)，如高于30℃、优选高于40℃，并且最优是高于50℃时，进行固体载体和液体(或酶和水)以及单细胞蛋白质的混和。作为选择或另外，可以在此温度下提供液体。
但是，通常而言，在较低(例如环境)温度下的非溶胀条件是优选的。这可以使在更高温度下(热敏感性)酶的不稳定性引起的活性损失降至最低。合适的是，酶和水的混合温度为10-60℃，如10-50℃，优选20-40℃，优选20-25℃。
用于本发明中以将酶、任选的水(例如含酶液体)、SCP和固体载体的混合物制备成颗粒(换句话说，制粒)的机械加工可以使用在食品、饲料和酶配制方法中常用的已知技术。这可以包含膨化、挤出、滚圆、制丸、高剪切制粒、鼓式制粒、硫化长附聚或其组合。这些方法通常具有输入机械能量的特征，如螺杆的驱动、混合机构的旋转、制丸设备转动机构的压力、通过流化床附聚器的转动底盘的颗粒移动或通过气流的颗粒移动，或其组合。这些方法使得固体载体(例如呈粉末形式)与酶和任选的水例如含酶液体(水溶液或浆体)、SCP混合，并随后制粒。
作为选择，可以将固体载体与酶(例如呈粉末形式)和单细胞蛋白质混合，然后可向其中添加任选的水，如液体(或浆体)(其可用作制粒液体)。
在本发明另一实施方案中，通过将含酶液体喷雾或包被在载体上来形成颗粒(例如附聚物)，所述的载体预先在例如流化床附聚器中与SCP混合。在此得到的颗粒可能包含可以在硫化床附聚器中产生的附聚物。
优选的是，含酶液体、固体载体和稳定剂的混和额外包括捏合该混合物。这可以改进混合物的塑性，以便于制粒(例如挤出)。
在优选的实施方案中，通过挤出，优选通过在低压下挤出来形成颗粒。这可能提供了这样的优势，即，挤出的混合物温度将不会增加或仅略微增加。低压挤出包括例如在Fuji Paudal篮式或圆顶状挤出机中的挤出。该挤出可以自然产生颗粒(在通过口模后，颗粒可以脱落)或可以使用切断机。
合适的是，颗粒在干燥前具有15-50％、如20-40％、如25-35％、优选33-37％的水含量。颗粒的酶含量在干燥前优选是1-25％，如3-15％，如5-12％(例如至少50,000ppm)。(通常以基于颗粒总重量的重量％来计算)。
可以将所得到的颗粒进行修圆(例如滚圆)，如在滚圆器中，例如在MARUMERISERTM机器中，和/或进行压实。如果得到的颗粒是干燥的，滚圆优选在干燥前进行。颗粒可以在干燥前滚圆，因为这可以减少在最终颗粒中形成粉尘和/或促进颗粒的任何包被。
之后可以将颗粒在例如流化床干燥器中干燥，或者在流化床附聚的情况下，可以立即干燥(在附聚器中)以得到(固体)颗粒。技术人员可以使用在食品、饲料或酶工业中干燥颗粒的其它已知方法。合适的是，颗粒是可流动的。干燥优选在25-60℃，如30-50℃的温度下发生。在此干燥可以持续10分钟到几小时。所需时间的长度无疑将取决于待干燥的颗粒量。
在干燥颗粒后，得到的干燥颗粒优选具有3-10％，如5-9重量％的水含量。
在本发明优选的实施方案中，提供了这样一种方法，该方法包括a)混合包含至少一种酶的含水液体与固体载体和单细胞蛋白质；b)机械加工在a)中得到的混合物以得到含酶颗粒；以及c)干燥在b)中得到的含酶颗粒。
在本发明另外的实施方案中，将颗粒涂布。可以将涂料施用于颗粒，以提供额外的(例如有利的)特性或性能，比如低粉尘含量、颜色、保护酶不受周围环境影响，在一种颗粒中的不同酶活性或其组合。颗粒可以经在先干燥或不经在先干燥就进行涂布。颗粒可以用脂肪、蜡、聚合物、盐、油膏和/或软膏，或者包含(另一种)酶的涂料(例如液体)或其组合来涂布。明显如果需要的话，可以施用几层(不同的)涂层。为了在颗粒上施用涂料，可以采用各种已知方法，其包括使用流化床、高剪切制粒机、混合制粒机或Nauta混合器。
在一个实施方案中，优选在干燥到例如残余湿含量低于约10重量％后，用适合于饲料和/或食品的有机聚合物涂布颗粒，该涂布通过如下方式实施a)在流化床中用有机聚合物的熔体、溶液或分散体喷雾颗粒，或者在流化床中用有机聚合物进行粉末涂布；或b)在混合器中，通过在有机聚合物上熔融来涂布颗粒，或用有机聚合物的熔体、溶液或分散体来喷雾粗颗粒，或者用有机聚合物进行粉末涂布。
并且必要的话，后干燥、冷却和/或从分别得到的聚合物涂布的颗粒中除去粗颗粒级分。
根据本发明方法的优选实施方案，将颗粒装入流化床中，流化并且用有机聚合物的含水或不含水(优选含水)的溶液或分散体通过喷雾进行涂布。为此，使用尽可能高浓度的但仍旧可以喷雾的液体，例如至少一种聚合物的10-50重量％浓度的含水或不含水溶液或分散体，所述聚合物选自a)聚亚烷基二醇，特别是数均分子量为约400-15,000、例如约400-10,000的聚二醇。
b)数均分子量为约4000-20,000、例如约7700-14,600)的聚氧化烯聚合物或共聚物；特别是聚氧乙烯和聚氧丙烯的嵌段共聚物；c)数均分子量为约7000-1,000,000、例如约44,000-54,000的聚乙烯吡咯烷酮d)数均分子量为约30,000-100,000、例如约45,000-70,000的乙烯吡咯烷酮/乙酸乙烯酯共聚物；e)数均分子量为约10,000-200,000、例如约20,000-100,000的聚乙烯醇；以及f)数均分子量为约6000-80,000、例如约12,000-65,000的羟丙基甲基纤维素。
根据另外优选的方法变型，使用至少一种聚合物的10-40重量％浓度、优选约20-35重量％浓度的可喷雾的含水或不含水溶液或分散体，所述聚合物选自g)数均分子量为约100,000-1,000,000的(甲基)丙烯酸烷基酯聚合物和共聚物；特别是丙烯酸乙酯/甲基丙烯酸甲酯共聚物和丙烯酸甲酯/丙烯酸乙酯共聚物；以及h)数均分子量为约250,000-700,000的聚乙酸乙烯酯，其可以用聚乙烯吡咯烷酮稳定。
通常而言，由于下列原因优选水溶液或含水分散体对于使用或回收溶剂没有特别的措施；对于防爆不需要特别的措施；一些涂料材料优选以水溶液或含水分散体提供。
但是，对于特定情况，使用非水溶液或分散体也可能是有利的。涂料材料非常容易溶解，或者有利地高比例的涂料材料可以被分散。以这种方式，可以喷雾具有高固体含量的喷雾液体，这导致加工时间缩短。非水溶性溶剂的较低蒸发焓也使得加工时间缩短。
可根据本发明使用的分散体通过在含水或非水(优选含水)液相中用或不用常规分散剂分散上述聚合物而得到。将聚合物溶液或分散体优选以这样的方式喷雾，即，将颗粒装入到流化床设备或混合器中，将喷雾材料喷雾到其上面，并同时加热进料。在流化床设备中通过与加热的干燥气体—通常是空气—接触来提供能量，而在混合器中通过与加热的壁和需要的话，加热的混合工具接触来提供能量。如果结果是喷雾材料可以以高的干燥物质含量喷雾，可能有利的是预先加热溶液或分散体。当使用有机液相时，溶剂回收是有利的。涂布过程中产物温度应当为约35-50℃。原则上以底部喷雾方法(喷嘴在气体分布器盘中并且向上喷雾)或以顶部喷雾方法(涂布是从顶部向流化床中喷雾)在流化床设备中进行涂布。
适合的聚亚烷基二醇a)的实例是聚丙二醇，特别是不同摩尔质量的聚乙二醇，例如可从BASF AG以商品名Lutrol E 4000和Lutrol E 6000得到的PEG 4000或PEG 6000。
上述聚合物b)的实例是聚氧化乙烯和聚氧化丙烯、氧化乙烯/氧化丙烯混合的聚合物以及由聚氧化乙烯和聚氧化丙烯嵌段构成的嵌段共聚物，例如可从BASF AG得到的商品名为Lutrol F 68和Lutrol F127的聚合物。可有利地使用聚合物a)和b)的优选高度浓缩的溶液，其浓度基于溶液的总重量不超过约50重量％，例如约30-50重量％。
上述聚合物c)的实例是聚乙烯吡咯烷酮，如例如由BASF AG以商品名Kollidon或Luviskol销售的那些。可有利地使用这些聚合物的高度浓缩的溶液，该溶液具有的固含量基于该溶液的总重量为约30-40重量％。
上述聚合物d)的实例是乙烯吡咯烷酮/乙酸乙烯酯共聚物，其由BASFAG以商品名Kollidon VA64销售。可特别有利地使用这些共聚物的高度浓缩的溶液，其浓度基于溶液的总重量为约30％-40重量％。
上述聚合物e)的实例是例如由Hoechst以商品名Mowiol销售的产品。可有利地使用这些聚合物的固含量为约8-20重量％的溶液。
适合的聚合物f)的实例是羟丙基甲基纤维素，例如由Shin Etsu以商品名Pharmacoat销售的那些。
上述聚合物g)的实例是其烷基具有1-4个碳原子的(甲基)丙烯酸烷基酯聚合物和共聚物。合适的共聚物的具体实例是丙烯酸乙酯/甲基丙烯酸甲酯共聚物，其例如由BASF AG以商品名Kollicoat EMM 30D销售，或者由Rhm以商品名Eutragit NE 30D销售；还有甲基丙烯酸酯/丙烯酸乙酯共聚物，其例如由BASFAG以商品名Kollicoat MAE 30DP销售，或者由Rhm以商品名Eutragit 30/55销售。根据本发明可以将此类共聚物加工为例如10-40重量％浓度的分散体。
上述聚合物h)的实例是用聚乙烯吡咯烷酮稳定的聚乙酸乙烯酯，并且例如由BASF AG以商品名为Kollicoat SR 30D销售(分散体的固体含量为约20-30重量％)。
根据本发明方法的优选的实施方案，将颗粒装入流化床并且粉末涂布。粉末涂布优选使用固体聚合物的粉末进行，所述固体聚合物选自数均分子量为约6000-80,000的羟丙基甲基纤维素(HPMC)，并且呈与增塑剂的混合物形式。适合的粉末涂布材料还有所有其它涂布材料，该其它涂布材料可以以粉状形式存在，并且不可以作为熔体或高度浓缩的溶液施用(例如用HPMC的情形)。
粉末涂布优选以这样的方式进行，即，将涂布材料连续添加到装入流化床中的颗粒中。涂布材料的精细微粒(粒度为约10-100μm)铺在较粗糙的粗颗粒表面。通过以增塑剂溶液喷雾，涂布材料颗粒粘在一起。适合的增塑剂实例是聚乙二醇溶液、柠檬酸三乙酯、山梨糖醇溶液、石蜡油等。为了除去溶剂，利用轻微加热进行涂布。在此情况下，产品温度低于约60℃，例如为约40-50℃。原则上，粉末涂布还可以在混合器中进行。在此情况下，添加粉末混合物并且还将增塑剂经由喷嘴注射。通过经由混合器壁并且合适的话，经由混合工具提供能量来进行干燥。同样，如在流化床中的涂布和干燥那样，必须保持低产物温度。
根据本发明方法的另外优选的实施方案，装入流化床或混合器中的颗粒使用至少一种聚合物的熔体进行涂布，所述聚合物选自a)数均分子量为约1000-15,000的聚亚烷基二醇，特别是聚乙二醇；以及b)数均分子量为约4000-20,000的聚氧化烯聚合物或共聚物，特别是聚氧乙烯和聚氧丙烯的嵌段共聚物。
熔融涂布优选以这样的方式在流化床中进行，即，将待涂布的颗粒装入流化床设备中。将涂布材料在外部储罐中熔融，并经过例如可加热的管线泵送到喷雾喷嘴。加热喷雾气体是有利的。喷雾速度和熔体入口温度的限定必须使得涂布材料在颗粒表面上仍旧容易流动并且将其涂布均匀。可以在喷雾熔体前预先加热颗粒。在涂布材料具有高熔点的情况下，必须要注意这样的事实不必将产品温度设定得过高，以使酶活性的损失最小化。产物温度应当为约35-50℃。原则上还可以通过底部喷雾方法或通过顶部喷雾方法进行熔融涂布。可以在混合器中以两种不同的方式进行熔融涂布。或者将待涂布的颗粒装入合适的混合器中并且将涂布材料的熔体喷雾到混合器中，或者在另一种可能性中，将固体形式的涂布材料与产物混合。通过经由容器壁或经由混合工具提供能量，涂布材料被熔融，并因此涂布粗颗粒。需要的话，可以不时添加一些脱模剂。适合的脱模剂是例如水杨酸、滑石、硬脂酸盐和磷酸三钙。
用于涂布的聚合物溶液、聚合物分散体或聚合物熔体可以接受其它添加剂，例如微晶纤维素、滑石或高岭土。
在本发明的另一实施方案中，如WO 03/059087第2页第19行到第4页第15行所述，颗粒可以用聚烯烃涂布。
在本发明的另一实施方案中，如WO 03/059087第2页第18行到第4页第8行中所述，颗粒可以用包含分散在适合溶剂中的疏水物质的颗粒的分散体涂布。在此涂布的优选实施方案中，使用聚烯烃，尤其优选聚乙烯和/或聚丙烯。
在其它实施方案中，例如可以将额外的成分掺入到颗粒中作为加工助剂，以用来进一步改进颗粒制丸的稳定性和/或储存稳定性。在下文中讨论了大量此类优选的添加剂。
盐可以包含在颗粒中(例如与固体载体或水)。优选(如在EP-A-0,758,018所提出的)可以添加无机盐，其可以改进干燥酶制品的加工和储存稳定性。优选的无机盐是水溶性的。它们可以包含二价阳离子，如锌(特别是)、镁和钙。硫酸根是最有利的阴离子，但是也可以使用其它产生水溶性的阴离子。可以以固体形式添加盐(例如添加到混合物中)。但是，可以在与固体载体混合前将盐溶解在水中或者含酶液体中。合适的是，盐以至少15重量％(基于酶)如至少30重量％的量提供。但是，它可以高达至少60重量％或甚至70重量％(同样基于酶)。可以在干燥前或干燥后将这些量应用于颗粒。因此，颗粒可以包含少于12重量％的盐，例如2.5-7.5重量％的盐，例如4-6重量％的盐。如果盐在水中提供，那么它可以是5-30重量％，如15-25重量％。
可以通过掺入疏水的、形成凝胶的或缓慢溶解(例如在水中)的化合物得到制丸稳定性的进一步增强。这些可以提供为1-10重量％，如2-8重量％，优选4-6重量％(基于水和固体载体成分的重量)。适合的物质包括衍生的纤维素，如HPMC(羟丙基甲基纤维素)、CMC(羧甲基纤维素)、HEC(羟乙基纤维素)；聚乙烯醇(PVA)和/或食用油。食用油如大豆油或低芥酸菜子油可以添加(到例如待粒化的混合物)作为加工助剂。
另外期望已知稳定剂可以添加到固体制剂中，如尿素、甘油、山梨糖醇、聚乙二醇—优选分子量为6000的聚乙二醇，或其混合物。其它可以添加到固体制剂中的稳定剂的另一实例是C5糖，优选是木糖醇或核糖醇，分子量为600-4000Da、优选1000-3350Da的聚乙二醇，丙二酸、戊二酸和琥珀酸的二钠盐，羧甲基纤维素以及藻酸盐，优选藻酸钠。
优选颗粒具有较窄的粒度分布(例如它们是单分散的)。这可以促进在动物饲料和/或食品颗粒中酶的均匀分布。本发明方法意图产生具有窄粒度分布的颗粒。但是必要的话，额外的步骤可以包括在方法中以进一步缩小颗粒的粒度分布，例如过筛。颗粒的平均粒度分布适合为100μm-2000μm，优选为200μm-1800μm，优选为300μm-1600μm。颗粒可以是不规则形状的(但优选是规则的)，例如大致是球形的。在优选的实施方案中，颗粒的平均粒度分布为500-2000μm，优选为500-1800μm，优选为600-1000μm。平均粒度分布通过使用Mastersizer S-Malvern Instruments GmbH的机器—序列号32734-08来确定。平均粒度分布通过D(v，0.1)、D(v，0.5)和D(v，0.9)以及分布的平均粒度D(4，3)来表征。
在优选的实施方案中，颗粒将包含至少一种磷酸酶，优选至少一种植酸酶。在此类实施方案中，最终颗粒将优选具有的植酸酶活性为3,000-25,000，如5,000-15,000，如5,000-10,000，如6,000-8,000FTU/g。
在优选的实施方案中，最终颗粒将具有超过6,000FTU/g、优选超过8,000FTU/g、尤其超过10,000FTU/g的活性。
在本发明的另一方面，本发明的酶制剂是液体。
液体制剂可以是用于食品、饲料和酶制剂方法中的常规技术来制备。在一个实施方案中，可以将稳定剂直接添加到其中溶解或分散了酶的液体中。在本发明另一实施方案中，将稳定剂首先溶解在额外的水中，任选地可以调节得到溶液的pH，并且将这样得到的溶液随后与酶或酶浓缩物或液体酶制品混合。这样得到的混合物的pH调节是任选的。可以用有机或无机盐和/或酸调节pH。
在优选的实施方案中，液体制剂包含植酸酶。在此实施方案中，植酸酶优选存在于液体制剂中，其活性超过10,000FTU/g液体溶液，尤其超过14,000FTU/g液体溶液。
进一步希望的是，可以将已知稳定剂添加到液体制剂中。此类稳定剂例如是在EP 0,758,018中描述的盐。这些盐可以包含在液体制剂中。优选(如在EP-A-0,758,018所提出的)可以添加无机盐。优选的无机盐是水溶性的。它们可以包含二价阳离子，如锌(特别是)、镁和钙。硫酸根是最有利的阴离子，但是也可以使用其它产生水溶性的阴离子。可以以固体形式添加盐(例如添加到混合物中)。但是，可以将盐溶解在水中或者含酶液体中。合适的是，盐以至少15重量％(基于酶)如至少30重量％的量提供。但是，它可以高达至少60重量％或甚至70重量％(同样基于酶)。
进一步希望的是，可以将已知稳定剂添加到液体制剂中，如尿素、甘油、山梨糖醇、聚乙二醇—优选分子量为6000的聚乙二醇，或其混合物。其它可以添加到液体制剂中的稳定剂的另一实例是C5糖，优选是木糖醇或核糖醇，分子量为600-4000Da、优选1000-3350Da的聚乙二醇，丙二酸、戊二酸和琥珀酸的二钠盐，羧甲基纤维素以及藻酸盐，优选藻酸钠。
本发明的另一方面涉及制备单胃动物的饲料组合物的方法，其中对饲料补充本发明热稳定的固体或液体酶制剂。
可对补充了酶的饲料进行饲料加工的几种方法，如挤出、膨化和制丸，其中可以存在瞬时高温，并且热稳定化作用是有利的。
例如可以将本发明稳定的酶制剂应用到饲料丸上。可以用自来水稀释经热稳定的液体酶制剂来产生具有所需酶活性的溶液。在所述酶或所述酶之一是植酸的情况下，优选将溶液稀释，从而得到100-500、优选300-500FTU/g溶液的活性。可以将饲料丸转移到机械混合器中。并且在搅动同时将稀释的酶制剂喷雾到饲料丸上，以产生具有添加的酶活性的均匀产物。包含植酸酶的饲料丸的实例优选产生约500FTU/kg饲料丸的活性。
作为选择，可以将固体或液体酶制剂直接与捣碎的饲料混合，随后将此混合物进行诸如制丸、膨胀化或挤出之类的工艺。
在另一方面中，本发明涉及一种为单胃动物提供其饮食所需磷的方法，其中用本发明的饲料喂养动物并且不向饲料中添加额外的磷酸盐。
在又一方面中，本发明涉及用于人营养的食品组合物，其特征在于该食品组合物包含根据权利要求1-12中任一项的稳定的固体或液体酶制剂。
实施例1
将1重量％的六水合硫酸锌(涉及浓缩物量)溶解在含水植酸酶浓缩液中，所述浓缩液具有的干料含量为约25-35重量％，pH值为3.7-3.9，并且在4-10℃下效力为26000-36000FTU/g。
将玉米淀粉(900g)添加到具有切碎刀的混合器中并且均化。于10-30℃下在连续均化下将包含硫酸锌的植酸酶浓缩液(380g)和140g的10重量％聚乙烯醇溶液(水解度87-89％)缓慢添加到玉米淀粉中。在10-50℃下将混合物均化另外5分钟。将得到的面团转移到Dome挤出机中，并且于30-50℃下挤出(模具的孔径为0.7mm并且得到的线材长5厘米)。
将得到的挤出物在面团成圆机(来自Glatt的Typ P50)中于350rpm下(转盘的转速)修圆5分钟。随后，将材料在流化床干燥机中，在低于40℃(产品温度)下干燥，直到残余湿含量为约6重量％。
得到的粗颗粒的效力为约13200FTU/g。颗粒的最大粒度为1300μm并且平均粒度是约650μm(筛析)。
将粗制颗粒转移到实验室流化床(Aeromat Typ MP-1，Niro-Aeromatic)中以进行随后的涂布。施加入口直径为110毫米并具有凿孔底部(12％自由表面)的圆锥形塑料容器。涂布材料是市购的聚乙烯/(PE)分散体。
在环境温度下用35m3/h供应空气使700g粗制颗粒涡旋。使用利用供应空气(35℃和45m3/h)的双组分喷嘴(1.2mm)和软管泵(1.5巴)将PE分散体喷雾到酶颗粒上。涂布过程中的产物温度是30-50℃。利用顶部喷雾方法将分散体施加到颗粒上。这意味着，水蒸发，而PE颗粒围绕着粒状微粒，在其表面产生PE膜。在喷雾过程中，将供应空气的量逐渐增加到65m3/h以保证充分涡旋。在15分钟后喷雾工序完成。随后将产物在30-45℃(产物温度)下干燥30分钟。为了降低涂膜(PE膜)的磨损，将供应空气的量减少到55m3/h。
得到具有下列组成的产物玉米淀粉78.6重量％植酸酶(干燥物质)12.0重量％聚乙烯醇 1.4重量％硫酸锌(ZnSO4)0.5重量％
聚乙烯 4.0重量％残余湿分 3.5重量％效力，即植酸酶活性约12530FTU/g外观(显微镜) 颗粒具有平滑表面实施例2以与实施例1类似的方式进行制备。主要差异在于添加10％(单细胞)蛋白质溶液代替10％的PVA溶液。
得到具有下列组成的产物玉米淀粉78.6重量％植酸酶(干燥物质)12.0重量％蛋白质1.4重量％硫酸锌(ZnSO4)0.5重量％聚乙烯 4.0重量％残余湿分 3.5重量％效力，即植酸酶活性约12420FTU/g外观(显微镜) 颗粒具有平滑表面实施例3以与实施例1类似的方式进行制备。主要差异在于添加30％(单细胞)蛋白质溶液代替10％的PVA溶液。
玉米淀粉76.2重量％植酸酶(干燥物质)11.62重量％蛋白质4.2重量％硫酸锌(ZnSO4)0.48重量％聚乙烯 4.0重量％残余湿分 3.5重量％效力，即植酸酶活性约11820FTU/g外观(显微镜) 颗粒具有平滑表面
权利要求
1.一种包含至少一种酶和至少一种单细胞蛋白质的稳定的固体或液体酶制剂。
2.根据权利要求1的酶制剂，其中单细胞蛋白质是通过发酵得到的。
3.根据任意前述权利要求的酶制剂，其包含呈至少部分纯化的形式的或作为生物质的单细胞蛋白质，而该单细胞蛋白质是由产生单细胞蛋白质的微生物的发酵得到的。
4.根据任意前述权利要求的酶制剂，其中单细胞蛋白质是由选自藻类、酵母、真菌和/或细菌的至少一种微生物得到的。
5.根据任意前述权利要求的酶制剂，其包含作为均化的生物质的单细胞蛋白质。
6.根据任意前述权利要求的酶制剂，其中单细胞蛋白质包含40-90重量％的蛋白质。
7.根据任意前述权利要求的酶制剂，其中酶选自植酸酶和/或糖苷酶。
8.根据任意前述权利要求的酶制剂，其中酶选自植酸酶、木聚糖酶、内切葡聚糖酶和其混合物。
9.根据任意前述权利要求的酶制剂，其中酶是植酸酶，优选是植物植酸酶、真菌植酸酶、细菌植酸酶、可由酵母产生的植酸酶或共有植酸酶。
10.根据任意前述权利要求的酶制剂，其特征在于制剂是液体。
11.根据任意前述权利要求的酶制剂，其特征在于制剂是固体。
12.根据任意前述权利要求的酶制剂，其特征在于单细胞蛋白质材料在最终制剂中以0.01-30重量％、优选0.05-20重量％的浓度存在。
13.一种制备单胃动物的饲料组合物的方法，其特征在于用根据任意前述权利要求的稳定的固体或液体酶制剂处理饲料。
14.一种单胃动物的饲料组合物，其特征在于饲料包含根据权利要求1-12中任一项的稳定的固体或液体酶制剂。
15.一种人营养的食品组合物，其特征在于该食品组合物包含根据权利要求1-12中任一项的稳定的固体或液体酶制剂。
全文摘要
本发明涉及稳定的固体或液体酶制剂，其包含至少一种酶和至少一种单细胞蛋白质。
文档编号A23L1/305GK101065023SQ200580040902
公开日2007年10月31日 申请日期2005年11月26日 优先权日2004年11月29日
发明者J·费德图森延森, M·洛沙伊德特, A·哈比希 申请人:巴斯福股份公司