专利名称：最佳酶制剂应用体系的制作方法
技术领域：
本发明属于饲料添加剂领域。特别涉及饲用复合酶制剂的定量和个性化应用。
背景技术：
酶制剂在饲料中添加和应用是生物技术在饲料工业中应用最受关注的领域。从20 世纪50年代酶制剂开始在饲料中添加，到90年代饲用酶制剂的普遍应用，酶制剂在畜禽养殖业中的作用日益突出。同时，调查显示全球所有单胃动物饲料中只有10%添加了酶制剂， 并且猪料中酶制剂的使用量远低于禽料中酶制剂的添加量。现有的研究资料显示，影响饲用酶快速发展的原因主要有两个一是单项酶制剂评估体系的标准化；二是复合酶制剂应用体系的建立。目前，关于饲用酶的研究报道很多，但大多集中在饲用酶作用机理和动物饲养效果的研究上，很少涉及饲用酶的活性评估，仅有的报道也是着重于不同测定方法对饲用酶活性的影响，而对于影响其催化活性和稳定性(有效酶活，Effective Activity)的研究资料很少。陆文清和李德发000 认为饲用酶的品质评定和选择涉及很多因素，远比普通工业用酶复杂。对于饲用酶，由于饲料原料、饲料加工和动物消化道PH值的多样性，使得酶制剂的评估和选择成为一个复杂的工程。Sh印py (2004)认为饲用酶发展缓慢的原因是因为饲用酶在使用过程中受到如下薄弱环节的制约——标准化、公开有效的质量控制体系、良好的热稳定性、更加准确的液体应用系统，较为明确的技术信息公示，以及使生产性能反应更加一致的产品。欧盟最先颁布了饲料中禁止使用某些抗生素作为促生长剂的规定，这个决定迫使饲料生产企业不得不开始寻找抗生素的替代品，而在饲料中添加酶制剂成为各饲料企业的首选。但事实并未象人们所期望的那样，酶制剂在单胃动物饲料特别是在猪饲料中的使用并不广泛。主要原因可能是在添加酶制剂以后，原来的饲料数据库和动物营养需要参数并不适合实际情况(冯定远和沈水宝，2005)，从而导致酶制剂添加效果不明显或添加成本过高。他们认为饲料在添加酶制剂后，现有的饲料原料数据库甚至饲养标准可能不完全适合使用酶制剂的日粮配方设计。因而如何确定添加特定酶制剂后饲料原料的有效营养值 (Effective Nutrient Value)成为解决酶制剂有效利用的限制步骤。
发明内容
一种最佳酶制剂应用体系(OEATM)，其特征在于，包括两方面的内容有效酶活评估和有效营养值评估。有效酶活评估包括6个指标标示酶活、pH阈值、过胃酸测定、过蛋白酶测定、耐高温测定、三个月酶活存留率；有效营养值评估包括4个指标饲料粘度测定、饲料能值测定、 饲料蛋白质消化率测定、动物生长表现。标示酶活的测定方法为取一定量酶样品溶液，用pH 5.5的0. lmol/L的 NaAc-HAc缓冲溶液溶解后定容至IOOmL,然后根据酶活将样品溶液稀释适当倍数，使稀释好的待测酶液中酶活力控制在0. 04-0. 08U/mL之间；再将稀释好的酶液和配制好的底物溶液在37°C水浴30min后，加DNS试剂终止酶的反应，沸水浴5min，冷却定容；标准空白调零， 用分光光度计在MOnm下测定吸光值，最后根据吸光值计算酶活。pH阈值测定方法为将单酶用不同PH值缓冲液溶解，测定其活性，测定酶活结果与原始酶活相比，得到其在不同PH值条件下的酶活表现(％ )；不同PH值缓冲液梯度设置为2. 0,2. 5,3. 0,3. 5,4. 0,4. 5,5. 0,5. 5,6. 0,6. 5,7. 0 ；也可根据不同动物消化道不同消化位点的消化液PH值而设定。过胃酸测定方法为将单酶用不同PH值缓冲液在37°C条件下处理1.紐或池后测定其活性，测定酶活结果与标示酶活相比，得到其酶活性存留率(％)；不同PH值缓冲液梯度设置为2. 0,2. 5,3. 0,3. 5 ；以此可得到胃中酸性环境对酶样品活性的破坏程度(％ )。过蛋白酶测定方法为配制单酶样品溶液，取等量的酶液和胃蛋白酶液及胰酶溶液在37°c条件下水浴2_4h，之后将经过蛋白酶处理的单酶样品溶液按照单项酶制剂酶活测定方法测定其酶活，测定酶活结果与标示酶活相比，得到其酶活性存留率(％ )，以此确定外源酶制剂对蛋白酶的耐受性。耐高温测定方法为测定酶样品的水分含量，根据酶样品中水分含量通过加蒸馏水调节待测酶样品中的水分至16%，然后在烘箱中放置一定时间后取出冷却备用，烘箱温度设置为65°C、75°C、85°C、9(TC、95°C等5个温度梯度；通过单酶酶活测定方法测定酶活力，测定不同温度处理后酶样品活性与标示酶活相比，得到其酶活存留率(％ )，以此可评估酶样品的耐高温性(％)。三个月酶活存留率测定方法为酶制剂从生产之日起开始计算，常温贮存三个月后再取样，按照酶制剂酶活测定方法测定酶活，结果与标示酶活相比，得到其三个月常温贮存后的酶活存留率(％)。饲料粘度测定和饲料能值测定方法为准确称取1. 25g粉碎饲料样品于三角瓶中，所述粉碎饲料过Imm筛，分别加入不同梯度外源酶制剂后，再加入lmg/mL新鲜胃蛋白酶盐酸溶液，所述胃蛋白酶盐酸溶液为0. IN并且pH = 2. 0，在40°C恒温水浴锅中振荡，消化时间为池；胃消化阶段结束后，向溶液中加入ImL新鲜胰酶溶液，所述胰酶溶液为5mg/mL， 调节溶液PH值为6. 5 (1M NaOH溶液)，于40°C恒温水浴中振荡，消化时间为4h ；同时以未加酶饲料为对照组，进行同样的消化程序；体外消化结束后，将试管取出于3000g离心15min， 取上清液测定其粘度；消化残渣在烘箱中烘至恒重，测定其能量；饲料粘度变化(％ )=加酶组食糜粘度/对照组食糜粘度*100 ；饲料能值变化(％ )=加酶组消化能/对照组消化能 *100。基于饲用酶制剂评估和应用中的问题，我们提出了最佳酶制剂应用体系(0ΕΑ ) 的概念。该体系的核心有两点通过对有效酶活和加酶饲粮有效营养值的评估，达到酶制剂合理配比和定量添加的目的。0ΕΑ 体系综合评估全球单酶的有效酶活，针对饲料配方、饲料加工过程和动物消化生理特点进行有效营养值的评估，提供定量的个性化复合酶制剂方案。0ΕΑ 体系可以解构为六大方面1. 0ΕΑ 是“最佳酶制剂应用体系”的英文缩写，即Optimum Enzyme Application, 是饲用复合酶定量的、个性化、动态方案；
2. 0ΕΑ 是根据目标动物消化生理特点、饲料加工工艺和饲料中NSP种类与含量制定的定量的、个性化、动态方案；3. 0ΕΑ 是在四个数据库基础上制定的定量的、个性化、动态方案四个数据库分别是有效酶活数据库、抗营养因子数据库、产品试验数据库、同类产品数据库；4. 0ΕΑ 包括两方面的内容有效酶活评估和有效营养值评估；5.有效酶活评估包括6个指标标示酶活、pH阈值、过胃酸测定、过蛋白酶测定、耐高温测定、三个月酶活存留；有效营养值评估包括4个指标饲料粘度测定、饲料能值测定、饲料蛋白质消化率测定、动物生长表现；6. 0ΕΑ 是为解决复合酶应用中出现的六大问题而制定的定量的个性化方案，即 有效酶活评估不清晰、有效营养值模糊、针对性不强、添加不定量、效果不明显、成本不经济。
图1为pH值对木聚糖酶活性的影响；图2为饲料调质模拟条件对木聚糖酶的影响；图3为胃蛋白酶/胰酶对木聚糖酶活性的影响；图4为木聚糖酶对小麦和豆粕粘度的影响。
具体实施例方式本发明主要有两个内容有效酶活评估、有效营养值评估。1.有效酶活评估(1)酶制剂标示酶活测定取一定量酶样品溶液，用pH 5. 5的0. lmol/L的NaAc-HAc缓冲溶液溶解后定容至 lOOmL，然后根据酶活将样品溶液稀释适当倍数(最好使稀释好的待测酶液中酶活力能控制在0. 04-0. 08U/mL之间)。再将稀释好的酶液和配制好的底物溶液在37°C水浴30min后， 加DNS试剂终止酶的反应，沸水浴5min，冷却定容。标准空白调零，用分光光度计在540nm 下测定吸光值，最后根据吸光值计算酶活。(2)酶制剂pH阈值测定将单酶用不同pH值缓冲液溶解，测定其活性，测定酶活结果与原始酶活相比，得到其在不同PH值条件下的酶活表现(％ )。一般情况下不同pH值缓冲液梯度设置为2. 0、 2. 5,3. 0,3. 5,4. 0,4. 5,5. 0,5. 5,6. 0,6. 5,7. 0 ；同时也可根据不同动物消化道不同消化位点的消化液PH值而设定。(3)酶制剂耐酸性测定(过胃酸测定)将单酶用不同pH值缓冲液在37°C条件下处理1. 5h或池后测定其活性，测定酶活结果与标示酶活相比，得到其酶活性存留率(％)。一般情况下不同PH值缓冲液梯度设置为2.0、2.5、3.0、3.5。以此可得到胃中酸性环境对酶样品活性的破坏程度(％)。(4)酶制剂对胃蛋白酶/胰酶的耐受性(过蛋白酶测定)
配制单酶样品溶液，取等量的酶液和胃蛋白酶液及胰酶溶液在37°C条件下水浴 2_4h。之后将经过蛋白酶处理的单酶样品溶液按照单项酶制剂酶活测定方法测定其酶活， 测定酶活结果与标示酶活相比，得到其酶活性存留率(％)。以此确定外源酶制剂对蛋白酶的耐受性。(5)饲料调质过程对酶制剂活性的影响(耐高温测定)测定酶样品的水分含量，根据酶样品中水分含量通过加蒸馏水调节待测酶样品中的水分至16% (实际调质和制粒时配合饲料通入蒸汽后的湿度)，然后在烘箱中(温度一般设置为651、751、851、901、951等5个温度梯度)放置一定时间后取出冷却备用。通过单酶酶活测定方法测定酶活力，测定不同温度处理后酶样品活性与标示酶活相比，得到其酶活存留率(％ )。以此可评估酶样品的耐高温性(％ )。(6)三个月酶活存留率测定酶制剂从生产之日起开始计算，常温贮存三个月后再取样，按照酶制剂酶活测定方法测定酶活，结果与标示酶活相比，得到其三个月常温贮存后的酶活存留率(％ )。2.有效营养值评估操作方法根据Bedford和Classen (1993)的方法稍作修改。具体操作如下准确称取1.25g粉碎(过Imm筛)饲料样品于三角瓶中，分别加入不同梯度外源酶制剂后，再加入lmg/mL新鲜胃蛋白酶盐酸溶液(0. IN, pH = 2. 0)，在40°C恒温水浴锅中振荡，消化时间为池。胃消化阶段结束后，向溶液中加入ImL新鲜胰酶溶液(5mg/mL)，调节溶液pH值为 6. 5(1M NaOH溶液)，于40°C恒温水浴中振荡，消化时间为4h。同时以未加酶饲料为对照组， 进行同样的消化程序。体外消化结束后，将试管取出于3000g离心15min，取上清液测定其粘度。消化残渣在烘箱中烘至恒重，测定其能量。粘度变化(％ )=加酶组食糜粘度/对照组食糜粘度*100 (饲料粘度测定)能量变化(％ )=加酶组消化能/对照组消化能*100 (饲料能值测定)例证下面以酶活相同的两种木聚糖酶(A 2. 40X 105U/g，B :2. 37X 105U/g)为例，阐释 0ΕΑ 体系中“有效酶活”评估的必要性和重要性，以此说明0ΕΑ 体系的优点。1.酶活单位定义酶活单位定义采用国际标准，即在pH5. 5和37°C条件下，每分钟内从燕麦木聚糖底物溶液(SigmaX0627，1. 0% )中降解释放1 μ mol还原产物所需要的酶量，定义为一个酶活单位。酶活测定按照陆文清等000 提供的方法进行。2.酶制剂耐酸性试验从图1可以看出，在所有测定的PH值条件下，两种木聚糖酶活性存留率均保持在 50%以上，但木聚糖酶B活性存留率高于木聚糖酶A。木聚糖酶A在pH 5. 5时有一个高峰值，高于和低于此PH值，酶活均降低。而木聚糖酶B在不同pH值条件下，活性变化较为缓和，酶活存留率均在80%以上。3.饲料调质模拟试验从图2中可以看出，木聚糖酶A和B的活性随着调质温度升高而降低，特别是调质温度高于85°C时，二者活性均迅速降低到50%以下；但温度低于85°C时，木聚糖酶活性存留率均较高，且木聚糖酶B的活性存留率在所有测定温度下均高于木聚糖酶A。4.胃蛋白酶/胰酶耐受性试验本试验中木聚糖酶B活性不受消化道中胃蛋白酶/胰酶的影响，而木聚糖酶A在胃蛋白酶/胰酶作用下活性降低了 20% (图幻。由此可见，二者对于内源蛋白酶的耐受性有较大差异，以相同量添加于饲料中，木聚糖酶B的作用效果会更显著。5.木聚糖酶对饲料粘度的影响饲料配方中高含量的阿拉伯木聚糖最显著的特点就是提高了食糜的粘滞性，而木聚糖酶则可以将木糖聚合物分解成短链，降低食糜粘度并释放被其包裹的营养物质。试验中分别测定了两种木聚糖酶对小麦和豆粕粘度的影响，发现木聚糖酶B对小麦和豆粕粘度的降低程度要优于木聚糖酶A (图4)，其中饲料中添加木聚糖酶A，小麦和豆粕粘度分别降低了 3. 77%和3. 57% ；而饲料中添加木聚糖酶B，小麦和豆粕的粘度则分别降低了 9. 18% 和 5. 00%。从以上试验数据可以看出，木聚糖分子结构的复杂性决定了在选择木聚糖酶时， 仅仅通过酶制剂标示活性这一单一指标是远远不够的，以模拟调质过程和体外模拟消化技术为手段，综合考察酶制剂高温稳定性、耐酸稳定性、对内源蛋白酶降解作用的耐受性以及对饲料的降解程度，才能更准确的选择和合理利用酶制剂。发明特点0ΕΑ 体系的建立与提出最大程度上解决了现在饲用复合酶应用过程中出现的六大问题，从复合酶原料选择、配方优化和加工工艺三个关键控制点提出相应标准，初步改变了饲用酶制剂应用效果不明显的弊端。0ΕΑ 体系首次在实验室条件下通过体外模拟消化技术评估复合酶效果并将评估结果用于指导实际生产，开创出一条复合酶应用研发的新思路。根据大量的试验例证，归结出0ΕΑ 体系的特点定量、个性化、动态性。0ΕΑ 复合酶针对性强量身订做。针对各企业饲料配方、饲料加工工艺和饲料产品适用动物及其生理阶段，改变了现存市场酶制剂产品“泛泛而谈”的现状；0ΕΑ 复合酶适用性好动态化调整。随着饲料配方调整而调整复合酶配方，保证复合酶作用效果的一致性，改变了现存市场酶制剂产品“僵化”的现状；0ΕΑ 复合酶性能显著效果可重复。通过实验室评估试验，可以预测酶制剂作用效果(能量、粘度及蛋白质消化利用率等)，为饲料配方的调整与饲料配方成本下降提供科学依据，改变了现存市场酶制剂产品“纯粹经验化”的现状；0ΕΑ 复合酶性价比高成本经济。0ΕΑ 单酶性能优良，复合酶酶谱全面、科学、经济，有效降低复合酶添加成本，改变市场酶制剂产品“投入产出较差”的现状。具体应用下面结合应用实例详细介绍本发明，所述的实例用来理解而并非限制本发明。目前饲用酶制剂应用过程中存在以下六方面的问题(1)有效酶活不清晰；(2)有效营养值模糊；C3)针对性不强；(4)添加不定量；(5)效果不明显；(6)成本不经济。针对以上六大问题，本发明通过“有效酶活”和“有效营养值”的评估手段，提供的复合酶方案可完全解决上述问题。“有效酶活”评估包括六个方面⑴标示酶活测定；(2)耐高温性测定；⑶常温贮存酶活损失测定；阈值测定；( 耐酸性测定；(6)耐蛋白酶测定。“有效营养值”评估包括四个方面⑴粘度改善测定；(2)能值变化测定；(3)蛋白质消化率变化测定；(4)动物生产性能改善评估。通过以上流程和方法制作的0ΕΑ 复合酶方案已经与市场常见复合酶产品做过多次动物饲养对比试验。试验结果表明与对照产品相比，0ΕΑ 复合酶针对性强，效果稳定， 一般饲料效率可改善0. 05-0. 1，极大提高养殖户效益。通过0ΕΑ 这一评估体系制作的饲用复合酶不仅可有效改善动物生产性能，同时还可降低粮食作物在饲料中的使用量，提高非常规原料在饲料中的应用，改善人畜争粮的紧张局面。畜禽饲料中添加0ΕΑ 复合酶后一般可提高动物饲料能值1. 0-3. 0%，以畜禽饲料平均能值为^OOKcal/kg计算，则添加0ΕΑ 复合酶后可提高饲料能值^-84Kcal/kg，提高的能量如果全部用来替换玉米(玉米代谢能按照3300Kcal/kg计算)，则每吨饲料可降低玉米用量8. 5-25. 5kgo中国年产饲料总量按照1. 5亿吨，其中加酶饲料0. 45亿吨计算，每年可降低饲料中玉米用量36万-112. 5万吨。这可极大缓解目前粮食产量降低而需求量日益增加的紧张局面，也有助于扭转粮食进口的贸易逆差。本发明以新的思路和方法解决了饲用酶制剂应用过程中出现的问题。经试验验证，0ΕΑ 复合酶针对性更强、成本更经济。
权利要求
1.一种最佳酶制剂应用体系(0ΕΑ )，其特征在于，包括两方面的内容有效酶活评估和有效营养值评估。
2.如权利要求1所述的酶制剂应用体系，其特征在于，有效酶活评估包括6个指标标示酶活、PH阈值、过胃酸测定、过蛋白酶测定、耐高温测定、三个月酶活存留率；有效营养值评估包括4个指标饲料粘度测定、饲料能值测定、饲料蛋白质消化率测定、动物生长表现。
3.如权利要求2所述的酶制剂应用体系，其特征在于，标示酶活的测定方法为取一定量酶样品溶液，用PH 5. 5的0. lmol/L的NaAc-HAc缓冲溶液溶解后定容至IOOmL,然后根据酶活将样品溶液稀释适当倍数，使稀释好的待测酶液中酶活力控制在0. 04-0. 08U/mL之间；再将稀释好的酶液和配制好的底物溶液在37°C水浴30min后，加DNS试剂终止酶的反应，沸水浴5min，冷却定容；标准空白调零，用分光光度计在540nm下测定吸光值，最后根据吸光值计算酶活。
4.如权利要求2所述的酶制剂应用体系，其特征在于，pH阈值测定方法为将单酶用不同PH值缓冲液溶解，测定其活性，测定酶活结果与原始酶活相比，得到其在不同pH值条件下的酶活表现(％ )；不同PH值缓冲液梯度设置为2. 0、2. 5、3. 0、3. 5、4. 0、4. 5、5. 0、5. 5、 6. 0,6. 5,7. 0 ；也可根据不同动物消化道不同消化位点的消化液pH值而设定。
5.如权利要求2所述的酶制剂应用体系，其特征在于，过胃酸测定方法为将单酶用不同PH值缓冲液在37°C条件下处理1. 5h或池后测定其活性，测定酶活结果与标示酶活相比，得到其酶活性存留率(％ )；不同PH值缓冲液梯度设置为2. 0,2. 5,3. 0,3. 5 ；以此可得到胃中酸性环境对酶样品活性的破坏程度(％ )。
6.如权利要求2所述的酶制剂应用体系，其特征在于，过蛋白酶测定方法为配制单酶样品溶液，取等量的酶液和胃蛋白酶液及胰酶溶液在37°C条件下水浴2-4h，之后将经过蛋白酶处理的单酶样品溶液按照单项酶制剂酶活测定方法测定其酶活，测定酶活结果与标示酶活相比，得到其酶活性存留率(％)，以此确定外源酶制剂对蛋白酶的耐受性。
7.如权利要求2所述的酶制剂应用体系，其特征在于，耐高温测定方法为测定酶样品的水分含量，根据酶样品中水分含量通过加蒸馏水调节待测酶样品中的水分至16 %，然后在烘箱中放置一定时间后取出冷却备用，烘箱温度设置为65°C、75°C、85°C、90°C、95°C等5 个温度梯度；通过单酶酶活测定方法测定酶活力，测定不同温度处理后酶样品活性与标示酶活相比，得到其酶活存留率(％ )，以此可评估酶样品的耐高温性(％ )。
8.如权利要求2所述的酶制剂应用体系，其特征在于，三个月酶活存留率测定方法为 酶制剂从生产之日起开始计算，常温贮存三个月后再取样，按照酶制剂酶活测定方法测定酶活，结果与标示酶活相比，得到其三个月常温贮存后的酶活存留率(％ )。
9.如权利要求2所述的酶制剂应用体系，其特征在于，饲料粘度测定和饲料能值测定方法为准确称取1. 25g粉碎饲料样品于三角瓶中，所述粉碎饲料过Imm筛，分别加入不同梯度外源酶制剂后，再加入lmg/mL新鲜胃蛋白酶盐酸溶液，所述胃蛋白酶盐酸溶液为0. IN 并且pH = 2. 0，在40°C恒温水浴锅中振荡，消化时间为池；胃消化阶段结束后，向溶液中加入ImL新鲜胰酶溶液，所述胰酶溶液为5mg/mL，调节溶液pH值为6. 5 (1M NaOH溶液)，于 40°C恒温水浴中振荡，消化时间为4h ；同时以未加酶饲料为对照组，进行同样的消化程序； 体外消化结束后，将试管取出于3000g离心15min，取上清液测定其粘度；消化残渣在烘箱中烘至恒重，测定其能量；饲料粘度变化(％ )=加酶组食糜粘度/对照组食糜粘度*100 ；饲料能值变化(％ )=加酶组消化能/对照组消化能*100。
全文摘要
一种最佳酶制剂应用体系(OEATM)，包括两方面的内容有效酶活评估和有效营养值评估。有效酶活评估包括6个指标标示酶活、pH阈值、过胃酸测定、过蛋白酶测定、耐高温测定、三个月酶活存留率；有效营养值评估包括4个指标饲料粘度测定、饲料能值测定、饲料蛋白质消化率测定、动物生长表现。本发明以新的思路和方法解决了饲用酶制剂应用过程中出现的问题。经试验验证，OEATM复合酶针对性更强、成本更经济。
文档编号C12Q1/00GK102242180SQ20111009922
公开日2011年11月16日 申请日期2011年4月20日 优先权日2011年3月22日
发明者唐茂妍, 孙鸣, 徐玲, 王海彦, 王纪亭, 陈旭东 申请人:北京华美源生物科技有限公司