一种橙皮苷酶的生产方法及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及微生物发酵领域，具体涉及一种橙皮苷酶的生产方法及应用。
【背景技术】
[0002] 橙皮苷酶是水解橙皮苷关键酶，具有很高的应用价值。利用橙皮苷酶水解橙皮苷 可以得到橙皮素单糖苷、橙皮素、鼠李糖和葡萄糖。此外将橙皮苷酶添加到桔瓣罐头中，水 解其中的橙皮苷，可以防止柑桔罐头产生白色沉淀。
[0003] 橙皮苷酶可由多种微生物产生，如青霉菌、米曲霉、黑曲霉和拟杆菌属等。目前国 内关于产橙皮苷酶菌株的研究还比较少，已有报道的产橙皮苷酶的菌株多为霉菌。
[0004] 在现有采用霉菌生产橙皮苷酶的方法中，由于生产的橙皮苷酶的酶活低、热稳定 性差导致生产橙皮苷酶成本比较高，很难达到工业化生产的要求。而橙皮苷酶的酶活的高 低与热稳定性的优劣与菌株的选择、培养方法和发酵条件等有关，进而，选择具有优势的菌 株，以及设计合适的培养方法和发酵条件是生产酶活高、热稳定性好的橙皮苷酶的关键。
【发明内容】
[0005] 本发明目的在于提供一种反应条件温和、选择性好、工艺简单优化的橙皮苷酶的 生产方法，解决现有橙皮苷酶的酶活低、酶热稳定性差的问题。
[0006] 此外，本发明还涉及橙皮苷酶的应用。
[0007] 本发明通过下述技术方案实现：
[0008] -种橙皮苷酶的生产方法，包括以下步骤：
[0009 ] 1 )、将黑曲霉在培养基中进行产孢培养形成黑曲霉孢子；
[0010] 2)、黑曲霉孢子在产酶培养基中进行发酵产酶生产橙皮苷酶；
[0011] 3)、分离提取获得酶液；
[0012] 所述黑曲霉保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏名称为 KH005,其保藏号为:CGMCC12101。
[0013]现有的橙皮苷酶的在生产方法通产是采用微生物（主要是指霉菌和真菌）降解橙 皮苷获得，虽然能生产橙皮苷酶的菌株有很多，但是现有发现的菌株产橙皮苷酶的能力弱， 即生产的橙皮苷酶的酶活低，且橙皮苷酶的热稳定性差，影响橙皮苷酶的酶活和热稳定性 的因素除了菌株的选择外，还与发酵反应条件有关。
[0014] 本申请人通过多次试验，发现了一株新的黑曲霉菌株KH005,将其通过本发明所述 工艺步骤生产的橙皮苷酶的效率高，生产的橙皮苷酶的酶活高、热稳定性好;橙皮苷酶的酶 活的测定过程如下：
[0015] 试管中加入5ml pH4.5的醋酸-醋酸钠缓冲液、4.5ml浓度为0.2%的橙皮苷底物溶 液，在45 °C水浴下保温5min，然后加入，0.5ml上述粗酶液，充分摇匀，准确计时，45 °C反应 20min，再迅速移入沸水浴中灭活lOmin，采用高效液相色谱法测得剩余底物量，得出底物减 少量，从而测出酶活。
[0016] 计算公式如下：
[0017] 粗酶液的酶活力〇]/!111) = (13-&)/(20\0.5);其中，&化8)为酶解后剩余底物含量； b(yg)为反应前的底物含量。
[0018] 测定结果表明该粗酶液橙皮苷酶活性为2349-2647U。
[0019] 对于酶活的计算方式主要包括两种:一种是按照液体体积计算U/ml;另一种是按 照所投原料的质量计算U/g，本发明所述的酶活经过优化后3-4天酶活(按照液体体积计算 U/ml)便可以达到2000U以上，如果按照所投原料的质量计算，我们的菌株酶活可以达到 80000U/g 以上。
[0020]橙皮苷酶的酶活定义:在45°C、pH4.5的条件下，每分钟转化1微克橙皮苷底物所需 的酶量为一个酶活力单位(U)。
[0021] 酶活的定义不同文章或者专利有一定的差异，但是我们酶活的定义采用的是目前 比较公认的一种定义。可以参见文献（申丽静，汪钊.橙皮苷酶的制备及其催化性质的研究 [D].浙江工业大学，2006:63;孟娜，魏胜华，郑长龙.黑曲霉发酵产橙皮苷酶的工艺优化 [J]·生物技术，2011,21(2): 77-80)。
[0022] 并且，对制备的粗酶液中的橙皮苷酶的热稳定性进行测定：
[0023] 通过将橙皮苷酶置于一定温度下进行培养，每隔一段时间测量橙皮苷酶的酶活， 以最初的橙皮苷酶的酶活进行比较来判断橙皮苷酶的热稳定性，申请人通过实验证明：通 过本发明所述的黑曲霉KH005生产的橙皮苷酶的热稳定性好:在50-55°C条件下反应72h后， 酶活可以保存50 %左右;在60-65 °C条件下反应24h酶活依然可以保存50 %左右，即在50-55 °C条件下，酶的半衰期为72h，在60-65Γ条件下半衰期为24h，而现有的菌株所产酶的热稳 定性较差，当在大于45°C的水浴中处理30min左右，酶活便出现了明显的下降，超过2h酶基 本失活。
[0024] 本发明中涉及保藏的黑曲霉的保藏信息如下:保藏单位：中国微生物菌种保藏管 理委员会普通微生物中心;地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究 所；保藏日期：2016年1月25日；保藏编号：CGMCC12101，保藏名称为KH005 ;分类命名： Aspergillus niger〇
[0025] 黑曲霉菌株KH005的获得：
[0026] 黑曲霉是以枳实(通过市场购买获得)为原料，在培养基中经过初筛选挑选出产橙 皮苷酶能力大的菌株，将初筛选出的菌株在培养基中经过多次转接筛选获得。
[0027] 黑曲霉KH005的筛选过程：
[0028] 1)、培养基的制备：将2.0g硝酸钠、0.05g氯化钾、1.0g磷酸二氢钾、18.0g橙皮苷、 20. g琼脂溶解与1L蒸馏水中，并用1M的盐酸调pH为6.0-6.5，分装三角瓶，121°C灭菌15min， 待培养基冷至50-55 °C时，倒平板，冷却后备用。
[0029] 2)、菌株的初筛:无菌条件下取20克枳实于装有200mL无菌水三角瓶中，置摇床上 室温振荡30分钟。取菌液按10倍的梯度稀释到10'取各稀释度菌液lmL放入无菌平皿中，倒 入灭菌后冷却至50°C的培养基，混匀，待凝固后放入30 °C培养箱培养5天，观察菌落周围透 明圈的大小进行初筛，挑取有透明圈的菌株保经进一步纯化后保存到斜面培养基;然后将 纯化后的菌株接种到平板培养基上培养5天，测量透明圈的直径，结果如表1所示。因为橙皮 苷酶分解橙皮苷产生在菌落周围形成透明圈，所以通过透明圈的大小可以初步判断菌株产 橙皮苷酶能力的大小。挑选菌落周围有透明圈的单菌落保存。初筛得到的菌株经形态观察 发现均为霉菌。
[0030] 表1初筛得到菌株的菌落形态及透明圈直径
[0031]
[0032]
[0033] 3)、菌株的复筛：
[0034] 将初筛的菌株经过多次转接后发现，大部数菌株菌落生长逐渐变得缓慢，形成的 透明圈也越来越小。经过多代筛选，最终获得了一株生长迅速、色素少且产橙皮苷酶能力稳 定的菌株KH005,根据形态初步鉴定为霉菌。
[0035] KH005菌株的鉴定：
[0036] 1)、DNA 提取：
[0037] 收集菌体，溶于5mL提取缓冲液（lOOmMTris · Cl，100mM Na2EDTA，200mM NaCl，2% CTAB，pH8.0)中，37°C振荡45min。加入0.75mL 20%SDS，65°C水浴lh<a2,000rpm，离心 lOmin，收集上清。上清用等体积的酚:氯仿:异戊醇（25:24:1)抽提2次，加入终浓度0.3M的 NaAC(pH5.2)及2倍体积的无水乙醇，室温沉淀1 h。4 °C，12，OOOrpm，离心20min，收集沉淀，用 70%乙醇漂洗2次，晾干后溶于50yL TE( 10mmTris-Hcl，lmmNa2EDTA)中，即得总DNA。
[0038] 2)、扩增 ITS序列：
[0039] 以上述总DNA为模板，真菌通用引物ITS1(SEQ ID No.2:TCCGTAGGTGAACCTGCGG)和 ITS4(SEQ ID No. 3:TCCTCCGCTTATTGATATGC)分别为正向引物和反向引物扩增ITS序列。扩 增反应体系为50yL: 10 X Buf f er 5yL，dNTP lyL，Taq酶0.5yL( 2U)，正反向引物各ly