两相体系中酶促合成异槲皮苷的分段流微反应工艺的制作方法
【专利摘要】两相体系中酶促合成异槲皮苷的分段流微反应工艺，将芦丁溶于甘氨酸-氢氧化钠或磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液中，加入离子液体[Bmim][BF4]和橙皮苷酶构成芦丁反应液，分别将芦丁反应液和萃取液三乙酸甘油酯通过微量注射泵输入到微反应器的微管道中，进行酶促水解芦丁制备异槲皮苷。该工艺有效地实现了反应与分离的耦合，降低了反应后期的纯化成本，所选用的萃取剂三乙酸甘油酯价格低廉且安全无毒。利用微反应器能够大大加快反应速率，缩短时间，减少耗能。本发明中的微反应器装置简单，操作容易，只需将数目放大即可等比例的扩大生产能力，具有良好的工业化应用前景。
【专利说明】两相体系中酶促合成异槲皮苷的分段流微反应工艺
【技术领域】
[0001]本发明涉及生化 制药领域，具体涉及两相体系中酶促合成异槲皮苷的分段流微反应工艺。
【背景技术】
[0002]异槲皮苷是一种具有抗肿瘤、抗氧化和降血糖等多种优良药理活性的天然黄酮类化合物(Jo μ rnal of Ethnopharmacology, 2011, 134, 363-372),但其在天然产物中含量极低，化学合成复杂且成本高，因此获得困难导致价格昂贵，远远无法满足市场需求(CN102827220A)。近年来，以价格低廉的芦丁为底物，经酶法选择性水解获得异槲皮苷，为异槲皮苷的生产提供了新的思路。
[0003]专利CN101985639A公开了一种利用a -L-鼠李糖苷酶定向水解芦丁合成异槲皮苷的方法，反应48h后得率为86%。然而反应时间过长，底物浓度过低，不利于工业化生产。本课题组在离子液体共溶剂体系中，用橙皮苷酶水解芦丁产异槲皮苷，反应IOh转化率就可达93.4%，离子液体共溶剂体系这种新型的反应体系不仅大大的提高了水解速率，同时也提高了底物浓度 10 倍(Bioreso μ rce.Technology, 2013, 128, 156-163);但是该体系仍然存在着反应时间偏长、产物对底物有抑制、后期生物分离纯化成本高等缺点。因此，急需寻找一种新的反应体系及技术来更加高效、低廉的制备高纯度的异槲皮苷。
[0004]目前，两相催化体系为解决均相体系中的存在的问题，如产物对酶的抑制、反应速率低、催化剂与产物难分离等，提供了一条新的有效途径。通常，使用的两相体系是水相/有机相，酶和底物都溶解在水相中并在其中进行反应，反应生成的产物被实时转移到有机相中，可以实现反应与分离耦合一体化过程。Wang等报道了在“水/环己醇”两相体系中酶促合成环己糖苷，在反应的同时，产物同时转移到萃取相中，消除了底物的抑制作用，提高了产物的得率(Jo μ rnal of Molec μ Iar Catalysis B:Enzymatic, 2009, 56, 131-135)；Braun等报道了在“水/油酸乙酯”两相体系中进行生物转化类固醇，与单纯的水相相比，提高了催化剂的稳定性和产物的得率(Microbial cell factories, 2012, 11，106-118)。然而，目前尚未见到利用两相体系来酶促水解芦丁合成异槲皮苷的报道。
[0005]近年来，微反应器由于其优异的传质特性加速反应过程而在生物催化中受到国内外的广泛关注(Chemical Engineering Jo μ rnal, 2013, 223, 497-506)。在微反应器中进行两相反应建立分段流体系，其优点是两种互不相溶的液体之间的界面面积增大，界面液滴的中心的扩散距离缩短。此外，在液滴内部存在内部循环，近一步增加了界面质量和热量的传递，促进了酶促反应的发生。T μ s Y ek等在Y型微反应器中建立了 “水-正己烷”两相体系来酶促催化己醇氧化，反应速率比传统的间歇式反应器提高了 33倍(Engineering inLife Sciences，2012，12,49-56)。然而，目前尚未见到利用分段流微反应器来酶促水解芦丁合成异槲皮苷的报道。
[0006]本专利利用“缓冲溶液-离子液体共溶剂/三乙酸甘油酯”两相体系来酶促合成异槲皮苷的工艺及微反应器技术。该方法操作简便，反应效率高，易于大量制备高纯度异槲皮苷，为推动其在医药工业中的广泛应用具有十分重要的意义。
【发明内容】
[0007]技术问题:
[0008]为了克服现有技术中的上述不足，本发明的目的提供了一种两相体系中酶促合成异槲皮苷的分段流微反应工艺，以解决反应中底物对酶的抑制作用，缩短时间，提高酶促反应效率，降低生产成本。
[0009]技术方案:两相体系中酶促合成异槲皮苷的分段流微反应工艺，将芦丁溶于pH3~10的甘氨酸-氢氧化钠或磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液中，分别加入上述溶液体积10%的离子液体[Bmim] [BF4]和橙皮苷酶构成芦丁反应液，分别将芦丁反应液和萃取液三乙酸甘油酯通过微量注射泵输入到微反应器的微管道中，芦丁反应液中的芦丁浓度范围为0.0036g/L-3.6g/L，反应液中橙皮苷酶浓度范围为0.09g/L_l.8g/L，反应温度范围为20~60°C，芦丁反应液流速范围为2 μ L/min~20 μ L/min,萃取液流速范围为2 μ L/min~80 μ L/min，进行酶促水解芦丁制备异槲皮苷。
[0010]替代方案之一，用间歇式反应器替换微反应器。所述的间歇式反应器为IOmL的离心管，放入摇床中进行反应。
[0011]在间歇式反应器中，芦丁反应液中的芦丁浓度范围为0.0036g/L-3.6g/L，反应液中酶液浓度范围为0.09g/L-l.8g/L，反应温度范围为20~60°C，pH为3~10，反应液与萃取液两相体积比为3:1~1:6,反应时间为I~20h。
[0012]所述微反应器 设有依次连接的进样口、微管道和出样口，反应器的进样口端有两个，分别与微量注射泵连接，反应器的出样口端与收集器连接，微管道为蛇形通道，通过热注塑法或是蚀刻法刻出，通道的尺寸内径为长0.25m-2m,宽100-500 μ m,深50 μ m。
[0013]所述微反应器材质为玻璃、PDMS(polydimethylsiloxane)或 PMMA(Poly (methylmethacrylate))。
[0014]有益效果:采用两相体系酶促合成异槲皮苷能够消除产物对酶的抑制，有效地实现反应与分离的耦合，降低反应后期的纯化成本。所选用的萃取剂三乙酸甘油酯价格低廉，安全无毒。利用微反应器能够大大加快反应速率，缩短时间，减少耗能。本发明中的微反应器装置简单，操作容易，只需将数目放大即可等比例的扩大生产能力，具有良好的工业化应用前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0015]图1为本发明中所使用的分段流微反应器装置示意图。图中I微量注射泵，2微管道，3收集器。
【具体实施方式】
[0016]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。[0017]本发明实施例中使用HPLC法同时检测芦丁和异槲皮苷，色谱条件:Alltima C18(250X4.6mm, 5 μ m),流动相:0.02% 磷酸-乙腈(80:20，V/V);检测波长:360nm;流速:
1.0mL/min ;进样量:20 μ L。
[0018]其中，异槲皮苷摩尔得率的计算方法如下:
[0019]
【权利要求】
1.两相体系中酶促合成异槲皮苷的分段流微反应工艺，其特征在于，将芦丁溶于pH3~10的甘氨酸-氢氧化钠或磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液中，分别加入上述溶液体积10%的离子液体[Bmim] [BF4]和橙皮苷酶构成芦丁反应液，分别将芦丁反应液和萃取液三乙酸甘油酯通过微量注射泵输入到微反应器的微管道中，芦丁反应液中的芦丁浓度范围为0.0036g/L-3.6g/L，反应液中橙皮苷酶浓度范围为0.09g/L_l.8g/L，反应温度范围为20~60°C，芦丁反应液流速范围为2 μ L/min~20 μ L/min,萃取液流速范围为2 μ L/min~80 μ L/min，进行酶促水解芦丁制备异槲皮苷。
2.根据权利要求1所述的两相体系中酶促合成异槲皮苷的分段流微反应工艺，其特征在于，用间歇式反应器替换微反应器。
3.根据权利要求2所述的两相体系中酶促合成异槲皮苷的分段流微反应工艺，其特征在于所述的间歇式反应器为IOmL的离心管，放入摇床中进行反应。
4.根据权利要求3所述的两相体系中酶促合成异槲皮苷的分段流微反应工艺，其特征在于，在间歇式反应器中，芦丁反应液中的芦丁浓度范围为0.0036g/L-3.6g/L，反应液中酶液浓度范围为0.09g/L-l.8g/L，反应温度范围为20~60°C，pH为3~10，反应液与萃取液两相体积比为3:1~1:6，反应时间为I~20h。
5.根据权利要求1所述的两相体系中酶促合成异槲皮苷的分段流微反应工艺，其特征在于，所述微反应器设有依次连接的进样口、微管道(2 )和出样口，反应器的进样口端有两个，分别与微量注射泵(I)连接，反应器的出样口端与收集器(3)连接，微管道为蛇形通道，通过热注塑法或是蚀刻法刻出，通道的尺寸内径为长0.25m-2m,宽100-500 μ m,深50 μ m。
6.根据权利要求2所述的两相体系中酶促合成异槲皮苷的分段流微反应工艺，其特征在于，所述微反应器材质为玻璃、PDMS(polydimethylsiloxane)或PMMA(Poly (methylmethacrylate))。
【文档编号】C12P19/60GK103667403SQ201310694293
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年12月17日 优先权日:2013年12月17日
【发明者】王俊, 顾双双, 崔红生, 吴福安 申请人:江苏科技大学