专利名称：强化酶促合成异槲皮苷的方法
技术领域：
本发明属于酶法合成食品添加剂领域，具体涉及一种超声波场致强化酶促合成异槲皮苷的方法。
背景技术：
现有技术异槲皮苷(Isoquercitrin)，即槲皮素-3-0- β -D-葡萄糖苷 (Quercetin-3-glucose)，在自然界中非常罕见，是一种具有显著抗氧化性、抗肿瘤等生物活性的黄酮类高级食品添加剂和天然药物有效成分，也是近年来国际上新型功能性食品添加剂 EMIQ (Enzymatically Modified Isoquercitrin)的合成原料(Toxicology, 2010， 268(3) :213-218)。专利CN 101985639 A以自然界分布广泛、来源丰富的芦丁为原料，经糖苷酶催化水解反应制备异槲皮苷，建立了生物转化芦丁定向合成异槲皮苷的酶促水解工艺；酸水解制备异槲皮苷的水解温度较高，酸类催化剂对设备腐蚀严重，并产生大量的酸性废水，且芦丁的水解过程中槲皮素和异槲皮苷共存，必须对水解产物采用分离手段才能获得异槲皮苷 (African Journal of Biotechnology, 2011,10(8) : 1460-1466)。在此基础上，酶促水解芦丁被公认是制备异槲皮苷最有前景的方法，其中a_L-鼠李糖苷酶催化的酶促芦丁定向水解反应是生产异槲皮苷的关键，也是提高酶法生产效率的重要途径。因此，提高a_L-鼠李糖苷酶酶促反应的速度和强度是提高异槲皮苷转化率、芦丁原料利用率和生产效率的关键技术之一。大量的研究表明超声波场致作用对酶的活性有影响，选择适宜的超声处理条件可提高酶促反应速度(Journal of Cleaner Production, 2008,16(5) :591-597)。超声作用对于酶促反应的影响依赖于反应中酶的活性的变化，反应酶活力的表现必须依赖酶分子的构象。超声波场致作用提高酶活主要有两方面的原因一方面超声波产生的微流效应可促进底物迅速进入酶的催化部位及产物进入介质，从而提高了酶的催化效率；另一方面， 超声波的空化作用所产生的冲击波改变了酶分子的空间构象，从而改变了酶促反应的进程 (Ultrasonics Sonochemistry, 2011,18 (1) :303-309)。超声波用于强化酶促反应份内源酶和外源酶两种类型(1)作用于内源酶，如专利ZL 200610152149. 7和CN101696435 A公开了超声强化内源蒜氨酸酶促反应和水相酶促反应连续制备大蒜风味物质的方法，有效提高了大蒜特征风味成分的产量；(2)作用于外源酶，如CN 101979642 A公开了超声波辅助纤维素酶解过程的方法，较大地提高了秸秆纤维素酶解后还原糖的转化率。目前生物合成异槲皮苷目前尚未实现工业化大规模应用，原因在于传统以水为溶剂的反应体系中，芦丁等大多天然糖苷底物的溶解性差，且α-L-鼠李糖苷酶的催化效率较低。因此，本专利在酶促合成异槲皮苷过程中采用超声波场致强化，该方法操作简便，反应条件温和，产物得率高，对环境友好，从而可以克服传统糖苷酶催化合成效率较低和底物溶解度较低的缺点，易于工业化生产高纯度异槲皮苷，对推动其在医药、食品、化妆品等工业中的广泛应用具有十分重要的意义。
发明内容
技术问题针对现有技术中所述的不足，本发明提供了一种超声波场致强化酶促合成异槲皮苷的方法。该方法在酶促合成异槲皮苷过程中采用超声波场致强化，可大大提高异槲皮苷的合成效率。技术方案在10 150kHz范围内选定强度为不超过1. 5w/cm2的超声波，1 60min/h连续作用于α -L-鼠李糖苷酶催化水解芦丁合成异槲皮苷的反应体系。以浓度为0. 01 lmol/L 磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，配制pH = 5 9的0. 01 lg/L的芦丁母液。在芦丁母液中按体积比1 50%加入0. 1 100g/La -L-鼠李糖苷酶液，在10 60°C、50 200r/min 条件下振荡反应1 48h。反应结束后HPLC检测表明，超声波场致强化酶促合成产物异槲皮苷的转化率要高于在相同条件下但未经过超声强化的方法。有益效果在酶促合成异槲皮苷的体系中采用超声波场致强化，异槲皮苷的产物得率比未经超声强化的方法高，因此超声波场致强化a -L-鼠李糖苷酶的酶促反应技术为异槲皮苷的生产提供了新的途径。该方法反应条件温和，对环境友好，易于工业化生产高纯度异槲皮苷。此外，整个酶促反应工艺基本上无废弃物产生，无环境污染，具有非常良好的工业化应用前景。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。本发明实施例中使用同时检测芦丁和异槲皮苷的测定方法为高效液相色谱法，色谱条件Alltima Cw Q50mmX 4. 6mm，5 μ m)，流动相0. 02%磷酸-乙腈(80 20, ν/ν)；检测波长:360nm ；流速1. OmL/min ；进样量20 μ L。其中，产物异槲皮苷的转化率计算方法为
“初始芦丁原料的摩尔量力α -L-鼠李糖苷酶液的制备参见专利CN 101985639 Α。实施例1选定频率为10kHz、强度为0. lw/cm2的超声波，lmin/h作用于α -L-鼠李糖苷酶催化水解芦丁合成异槲皮苷的反应体系。以0. 01mol/L磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，配制 PH = 5的0. 01g/L的芦丁母液。在芦丁母液中按体积比加入0. lg/L α-L-鼠李糖苷酶液，在10°C条件下50r/min振荡反应lh。反应结束后HPLC检测，产物异槲皮苷的转化率比在相同条件下但未经过超声强化的方法提高了 0. 2%。实施例2
4
选定频率为150kHz、强度为1. 5w/cm2的超声波，60min/h作用于α -L-鼠李糖苷酶催化水解芦丁合成异槲皮苷的反应体系。以lmol/L磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，配制ρΗ =9的lg/L的芦丁母液。在芦丁母液中按体积比50%加入lOOg/La -L-鼠李糖苷酶液，在 60°C、200r/min条件下振荡反应48h。反应结束后HPLC检测，产物异槲皮苷的转化率比在相同条件下但未经过超声强化的方法提高了 2%。实施例3选定频率为40kHz、强度为0. 28w/cm2的超声波，10min/h作用于α -L-鼠李糖苷酶催化水解芦丁合成异槲皮苷的反应体系。以0. 2mol/L磷酸氢二钠-0. lmol/L柠檬酸缓冲液，配制PH = 7的0. 3g/L的芦丁母液。在芦丁母液中按体积比5%加入lOg/La -L-鼠李糖苷酶液，在40°C条件下120r/min振荡反应20h。反应结束后HPLC检测，产物异槲皮苷的转化率比在相同条件下但未经过超声强化的方法提高了 31%。实施例4选定频率为40kHz、强度为0. 28w/cm2的超声波，20min/h作用于α -L-鼠李糖苷酶催化水解芦丁合成异槲皮苷的反应体系。以0. 2mol/L磷酸氢二钠-0. lmol/L柠檬酸缓冲液，配制PH = 7的0. 3g/L的芦丁母液。在芦丁母液中按体积比5%加入lOg/La -L-鼠李糖苷酶液，在40°C条件下120r/min振荡反应20h。反应结束后HPLC检测，产物异槲皮苷的转化率比在相同条件下但未经过超声强化的方法提高了 40%。实施例5选定频率为40kHz、强度为0. 28w/cm2的超声波，30min/h作用于α -L-鼠李糖苷酶催化水解芦丁合成异槲皮苷的反应体系。以0. 2mol/L磷酸氢二钠-0. lmol/L柠檬酸缓冲液，配制PH = 7的0. 3g/L的芦丁母液。在芦丁母液中按体积比5%加入lOg/La -L-鼠李糖苷酶液，在40°C条件下120r/min振荡反应20h。反应结束后HPLC检测，产物异槲皮苷的转化率比在相同条件下但未经过超声强化的方法提高了 53%。
权利要求
1.强化酶促合成异槲皮苷的方法，其特征在于对α-L-鼠李糖苷酶催化水解芦丁合成异槲皮苷的反应体系施加超声波场。
2.权利要求1所述强化酶促合成异槲皮苷的方法，其特征在于选取的超声波频率范围为 10 150kHz O
3.权利要求1所述强化酶促合成异槲皮苷的方法，其特征在于选取的超声波强度范围为不超过1. 5w/cm2。
4.权利要求1所述强化酶促合成异槲皮苷的方法，其特征在于选取的超声波作用时间范围为1 60min/h。
5.权利要求1所述强化酶促合成异槲皮苷的方法，其特征在于配制芦丁母液的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液浓度为0. 01 lmol/L。
6.权利要求1所述强化酶促合成异槲皮苷的方法，其特征在于配制芦丁母液的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液PH值为5 9。
7.权利要求1所述强化酶促合成异槲皮苷的方法，其特征在于芦丁母液的浓度为 0. 01 lg/L。
8.权利要求1所述强化酶促合成异槲皮苷的方法，其特征在于在芦丁母液中按体积比 1 50%加入α -L-鼠李糖苷酶液。
9.权利要求1所述强化酶促合成异槲皮苷的方法，其特征在于在芦丁母液中加入 α -L-鼠李糖苷酶液的浓度为0. 1 100g/L。
10.权利要求1所述强化酶促合成异槲皮苷的方法，其特征在于芦丁酶促反应温度范围为10 60°C，振荡转速范围为50 200r/min，反应时间范围为1 48h。
全文摘要
强化酶促合成异槲皮苷的方法。该方法是在10～150kHz范围内选定强度为0～1.5w/cm2的超声波，1～60min/h连续作用于α-L-鼠李糖苷酶催化水解芦丁合成异槲皮苷的反应体系。以浓度为0.01～1mol/L磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，配制pH＝5～9的0.01～1g/L的芦丁母液。在芦丁母液中按体积比1～50％加入0.1～100g/L α-L-鼠李糖苷酶液，在10～60℃、50～200r/min条件下振荡反应1～48h。本发明的优点是超声波场致强化酶促合成产物异槲皮苷的转化率高于在相同条件下但未经过超声强化的方法，且操作简便，条件温和，可提高酶促反应的速度和强度。
文档编号C12P19/60GK102286577SQ20111027030
公开日2011年12月21日 申请日期2011年9月14日 优先权日2011年9月14日
发明者吴福安, 张旭东, 王俊, 许晏 申请人:江苏科技大学