槐角苷抗雌鼠生育的方法
【专利摘要】以槐角苷为活性成分的抗雌鼠生育灭鼠剂，属于生物防治【技术领域】。鼠害问题一直以来都是一个严重的世界性灾害问题，它在对农林牧业造成损害的同时，也严重破坏了生态环境，威胁着人类的健康。长久以来，人们采用多种方法对其种群数量加以控制，其中运用抗生育技术对害鼠种群数量进行控制是近些年发展起来的一项新技术。本发明涉及一种以槐角苷为活性成分的雌性不育灭鼠剂用于控制鼠类繁殖。相较于传统的生态灭鼠法及化学毒饵法，抗生育技术具有作用时间长、控制效果明显、环境毒副作用小等优点，能更有效地抑制害鼠种群的超补偿性效应。本发明若能应用于农林牧业生产，将能有效控制害鼠种群数量，具有广阔的经济效益。
【专利说明】槐角苷抗雌鼠生育的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及用于鼠害控制的抗生育灭鼠剂，具体涉及一种以槐角苷为活性成分的雌性不育剂用于控制鼠类繁殖。
【背景技术】
[0002]鼠害问题一直以来都是一个严重的世界性灾害问题，它在对农林牧业造成损害的同时，也严重破坏了生态环境，威胁着人类的健康。全世界鼠类有2000多种，我国记载的鼠类为130种，其中农业害鼠达112种。
[0003]鼠害也是我国草原上的“三害”之首，是草地主要的生物灾害，作为草地生态系统退化的一个重要因素正在严重威胁着草地畜牧业的存在和发展。我国草原总面积近60亿亩(为国土总面积的40%，为全国农耕地总面积的四倍)，其中可利用的草原面积约33亿亩，据农业部统计，全国现有牧业鼠害面积5.6亿亩，每年损失牧草2800亿多斤，价值8亿多元。在川、青藏高原草原，鼠害尤为严重。调查资料表明，西藏草原鼠害面积达1.2亿亩，川西北草原鼠害面积达3000万亩，这两地区每年因鼠害造成天然牧草损失达3000万羊单位全年饲料供应量，价值数亿元。鼠害严重地区，造成大片鼠荒地，使草场退化乃至沙化，仅四川石渠县的鼠荒地已达近1000万亩。因此，有效控制鼠害，是一件具有全面性、长远性的大事，有着重要的经济意义。
[0004]由于鼠类种类多、数量大、分布广、适应性强，与人类争地、争粮、同生境、共疾病，严重威胁着人类社会文明健康发展，成为世界性的一大公害。有效控制鼠害是保障农、林、牧业可持续发展的关键技术环节之一。
`[0005]目前，鼠害是国内外农.林.牧经济作物的严重危害者，是一种难于防治的祸患。单纯使用传统的机械逮捕和化学急性杀灭法，如第一代化学直接杀灭法:主要是运用剧毒化合物制成毒饵，通过鼠类的误食导致死亡。通过化学诱饵直接杀灭，在灭鼠过程中由于老鼠临死之前反应较为激烈，容易引起其它鼠的警觉，导致传统的化学杀灭方法并不能有效的控制鼠害，由于鼠的繁殖能力强、生殖周期非常短的特点，致使残存的鼠很快就会生态恢复到原有的种群数量，即所谓超补偿性增殖，恢复后的鼠的种群密度可能比直接杀灭前的密度还要高，有些地区的鼠害问题不但没有缓解，反而有“越灭越多”之势；其次，由于鼠类的天敌误食由化学灭鼠剂毒死的死鼠，造成二次中毒，大量的鼠类天敌被毒死；控制鼠类生态平衡天敌大量减少，达不到有效控制鼠类危害的作用，从而鼠类数量得以快速增长。
[0006]第二代抗凝血灭鼠药:是通过作用于血管壁使其通透性增加容易出血和干扰凝血酶原等凝血因子合成使血液不易凝固这两种途径发挥作用来达到杀灭害鼠的，相对第一代剧毒化学试剂而言，毒性小，较为安全。由于快速杀灭造成鼠类许多“种群真空”环境，刺激残鼠迅速繁殖，也会出现超补偿性增殖现象，因此不利于大规模使用。
[0007]为了能够较长期地控制害鼠数量、减少鼠害程度，避免出现超补偿性增殖。近年来，利用鼠不育技术来控制鼠害是避免超补偿性增殖的有效方法。按照其来源划分，可分为化学不育剂、植物源不育剂和免疫不育剂三类。不育剂具有的理想灭鼠效果、灭鼠的持久性以及对环境污染少等特点。
[0008]槐角苷，是一种植物源抗生育剂，主要来源于豆科植物槐树的果实槐角。《中华本草》中记载:槐角中含的槐角甙、染料木素和山柰酚对小鼠具有抗生育作用和雌激素活性。近些年的研究中，对槐角苷的化学结构已有了一定的研究报道，且动物实验也阐明了槐角苷呈现出雌激素样活性，具有显著的抗生育作用。作为一种潜在的新型植物源抗生育剂，槐角苷具有产量高、价格低廉、毒副作用小等优点，在农业、林业及畜牧业的鼠害防治方面，展现出了广阔的应用前景。
[0009]到目前为止，仅有文献报道了槐角苷对实验动物具有抗生育现象，但是对于其具体的抗生育作用机制及应用却还未见报道。本发明旨在基于对槐角苷的具体抗生育作用机制研究基础上，构建新型鼠雌性不育剂，为我国鼠害的防控提供新的技术手段。
【发明内容】
[0010]本发明的目的在于提供一种雌性不育灭鼠剂槐角苷，通过阻断鼠类繁殖途径达到灭杀和控制鼠类的雌性不育灭鼠剂。
[0011]本发明通过如下技术方案实现。
[0012]本发明提供一种雌性不育灭鼠剂，其特征是采用不育剂槐角苷作为活性成分用于对鼠类的杀灭。
[0013]1、实验方法。
[0014]将性成熟的雄性小鼠与性成熟的雌性小鼠于晚上8-10点按雌雄比例为2:1进行合笼，次日早上8-9点对雌鼠进行妊娠检查，发现阴栓或精子则为受孕成功，记为妊娠第一天(Dl )，并按下述方法进行处理。
`[0015]1.1生育力实验
取妊娠第一天(Dl)的小鼠48只，随机分为4组，每组12只，自Dl起按照0，150，300，600 mg/kg/day的槐角苷剂量分别进行灌胃处理,连续给药6天(D6),第8天(D8)解剖检验，统计各组胚胎数量。
[0016]1.2扫描电子显微镜(SEM)
将妊娠第一天(Dl)的雌性小鼠6只，平均分为2组，每组3只。第一组作为空白对照组，第二组按照600 mg/kg/day的槐角苷剂量进行灌胃，至第五天(D5)解剖，取出子宫。将子宫切成合适长度的片段后置于4%的多聚甲醛固定液中固定2小时，取出后用一定浓度梯度的乙醇溶液(50%、70%、80%、90%、95%)依次进行脱水处理，每次15分钟，再用乙酸异戊酯洗脱15分钟。处理后的样品进行CO2临界点干燥I小时，之后利用SEM(JSM-5900LV，JE0L)检视其子宫内膜表面(每个样品取10个不同的视野进行分析)。
[0017]1.3免疫组化研究
为了对小鼠子宫内膜中雌激素受体(ERα )及孕激素受体(PR)的表达水平及位置做进一步研究，进行了免疫组化研究。将妊娠第一天(Dl)的36只小鼠随机分为6组，每组6只，按以下方法进行处理。3组作为对照组，另外3组为600 mg/kg/day的槐角苷灌胃处理的实验组。灌胃至第四天(D4)时，处死一组对照组与一组实验组小鼠，取出子宫切成适当长度的片段后置于4%的多聚甲醛固定液中保存；同法，第五天(D5)与第六天(D6)各处死一组对照组与实验组小鼠，子宫于4%的多聚甲醛固定液中保存。将处理组样品包埋于石蜡之中，切片(厚度4 ym至10 μπι)常规脱蜡至水。95 °C条件下，用0.01 M柠檬酸钠缓冲液(pH
6.0)进行抗原修复20 min，冷却至室温。3% H2O2孵育10 min后，加山羊血清封闭，37°C湿盒中温育20min。随后，将切片与用PBS稀释的兔抗ERa (1:400，SC-542，Santa Cruz)、PR (1:300，SC-538, Santa Cruz)分别结合，4 °C孵化过夜。切片经PBS洗涤之后，用辣根过氧化物酶标记的二抗(ZSGB ΒΙ0，中国)在37°C条件下孵育lh。之后用3，3’ - 二氨基联苯胺溶液(ZSGB ΒΙ0,中国)进行检测，随后加入伊红溶液进行成像检测。除一抗用PBS代替之外，对照组的其余过程与处理组完全相同。最后，使用Image-Pro Plus 6.0软件分析，每个样品取5个视野，其平均光密度值视为该样品的光密度值。
[0018]2.1槐角苷对雌性小鼠胚胎着床的影响
对于不同浓度槐角苷处理的受孕小鼠，随着药物浓度的提高，其胚胎着床平均数量呈现出下降的趋势，当槐角苷浓度达到600 mg/kg/day时,胚胎着床平均数量与对照组相比，呈现出极显著差异(P〈0.01)。
[0019]2.2槐角苷对小鼠子宫内膜结构的影响
SEM扫描电镜结果表明，对照组子宫内膜上含有大量胞饮突、微绒毛，并且呈现出规则性的分布；处理组中胞饮突、微绒毛含量则相对较少，且分布极不规则，散乱地分布于子宫内膜上。
[0020]2.3槐角苷对小鼠子宫内ERa及PR表达水平的影响
D4、D5及D6的免疫组化结果表明，ERa及PR广泛地表达于子宫内膜腔上皮细胞、腺体细胞以及基质细胞中。但与对照组相比，在600 mg/kg/day的药物处理组中ERa的表达水平呈现出明显的下降趋势，PR的表达水平则显著提高。
[0021 ] 本发明与现有技术相比具有以下优点。
`[0022]1、本发明中雌性不育剂槐角苷对雌鼠生育能力的控制极其显著。实验证明，对交配受孕成功后的雌性小鼠，以600mg/kg/day的剂量进行灌胃给药，连续给药5天，其不育率可达到70%以上。
[0023]2、本发明中雌性不育剂槐角苷对鼠类的子宫有一定的损伤作用。病理学检测表明，经600mg/kg/day槐角苷处理后的小鼠，子宫内膜病理学增生、子宫厚度增加，子宫内膜结构发生改变。
[0024]3、本发明中雌性不育剂槐角苷对鼠类子宫内胚胎着床的关键受体ERa及PR表达水平产生影响。免疫组化实验表明，ERa及PR广泛地表达于子宫内膜腔上皮细胞、腺体细胞以及基质细胞中。但与对照组相比，经600mg/kg/day槐角苷处理后的小鼠，子宫内ERa的表达水平显著下降(P〈0.05)，PR的表达水平则显著上升(P〈0.05)。这一结果表明槐角苷能对雌鼠胚胎着床期间的关键受体产生影响，这一影响最终导致了雌鼠子宫内胚胎着床的失败。这就意味着槐角苷能够通过影响胚胎的着床从而导致雌鼠不育，控制鼠类的繁殖从而达到对鼠类种群的控制。
【专利附图】
【附图说明】
[0025]图1槐角苷对雌性小鼠胚胎着床的影响A:不同浓度槐角苷处理下小鼠胚胎平均着床数量(p〈0.01) ； B:对照组小鼠胚胎着床情况(D8) ；C:600mg/kg/day槐角苷处理组小鼠胚胎着床情况(D8) ；D:正常小鼠子宫形态；E:600mg/kg/day槐角苷处理小鼠子宫形态(D8)。
[0026]图2槐角苷对小鼠子宫内膜结构的影响A:正常妊娠小鼠第五天(D5)子宫内膜内部结构情况；B:经600 mg/kg/day槐角苷处理后妊娠小鼠第五天(D5)子宫内膜内部结构。
[0027]图3槐角苷对小鼠子宫内ERa及PR表达水平的影响(200X) *P〈0.05，**Ρ〈0.01。
【具体实施方式】
[0028]下文将通过实施实例对本发明做进一步说明，但实施实例不以任何方式限制本发明。
[0029]实例1:
选用纯度为98%的槐角苷为不育剂药物，以受孕第一天的ICR雌性小鼠为研究对象，以150mg/kg/day的剂量连续灌胃给药5天,发现胚胎着床平均数量与对照组相比减少达20%。
[0030]实例2:
选用纯度为98%的槐角苷为不育剂药物，以受孕第一天的ICR雌性小鼠为研究对象，以300mg/kg/day的剂量连续灌胃给药5天，发现胚胎着床平均数量与对照组相比减少超过30%。
[0031]实例3:
选用纯度为98%的槐角苷为不育剂药物，以受孕第一天的ICR雌性小鼠为研究对象，以600mg/kg/day的剂量连续灌胃给药5天，发现胚胎着床平均数量与对照组相比减少达到70%，具有显著的统计学意义(P〈0.05)`。病理学研究发现，槐角苷处理后子宫内膜病理学增生、厚度增加，子宫内膜结构发生改变，子宫内影响胚胎着床的关键受体ERa的表达水平显著降低(P〈0.05)，PR的表达水平显著上升(P〈0.05)。实验结果为不育率可达到70%。
【权利要求】
1.一种抗生育灭鼠剂，其特征在于，所述抗生育灭鼠剂是以槐角苷作为活性组分的抗生育剂。
2.权利要求1所述的抗生育灭鼠剂，其特征在于，所述鼠类为雌鼠类动物。
3.权利要求1或2中所述的抗生育灭鼠剂，其特征在于，所述槐角苷主要来源于豆科植物槐树的果实槐角，尼泊尔黄花木茎，漆树科植物宽叶尚乳香叶等。
4.一种灭鼠方法，其特征在于，通过使用权利要求1-3任一项所述的抗生育灭鼠剂，控制雌鼠的生育及其种群的数量。
5.权利要求4所述的方法，包括在鼠类繁殖开始或繁殖期内，每鼠每天按照150mg/kg-1000 mg/kg体重进行口服/灌胃给药的方法，连续给药5— 7天，即可控制雌性鼠类生育及其数量。`
【文档编号】A01P23/00GK103858876SQ201410084288
【公开日】2014年6月18日 申请日期:2014年3月10日 优先权日:2014年3月10日
【发明者】杨志荣, 张 杰, 周建宏, 瞿成权, 赵建, 孙群, 冯甦, 侯若彤 申请人:四川大学