α-L-鼠李糖苷酶Rha1及其表达基因和应用的制作方法
【专利摘要】α-L-鼠李糖苷酶Rha1及其表达基因和应用，氨基酸序列如SEQIDNO.2所示；编码所述α-L-鼠李糖苷酶Rha1的基因，核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。该α-L-鼠李糖苷酶在酶用量13U/mL，pH6.5，35℃的条件下水解1.5g/L的芦丁20min,水解效率高达98%以上；该酶能在低温下生物催化和转化芦丁、柚皮苷等黄酮类化合物，大大降低了能耗。
【专利说明】a -L-鼠李糖苷酶Rhal及其表达基因和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程及酶工程【技术领域】，具体涉及对黑曲霉来源的a -L-鼠李糖 苷酶Rhal及其表达基因和应用。
【背景技术】
[0002] a -L-鼠李糖苷酶（a -L-rhamnosidase，EC3. 2. 1. 40)广泛存在于动物、植物和 微生物中，能够特异性地水解许多糖苷类物质，如柚皮苷、芦丁、橙皮苷等糖苷类物质末端 a -L-鼠李糖基，可用于食品、医药等领域。主要的功能和作用包括：
[0003] (1)脱苦作用：黄烷酮糖苷类物质是柑桔中的主要苦味物质，a -L-鼠李糖苷酶可 以作用于黄烷酮糖苷类物质，脱去一个鼠李糖分子之后，转化为单糖苷，其苦味为原来的三 分之一。
[0004] (2)增香作用：葡萄糖中存在大量键合态芳香物质，键合态芳香物质本身并没有 呈香功能，但可以在糖苷酶的作用下裂解糖苷键释放糖苷配基，产生游离态芳香物质。许多 品种葡萄键合态芳香物质含量多于游离态芳香物质，因为键合态芳香物质构成了葡萄中重 要的、潜在的芳香成分，6-0-a-L-鼠李吡喃-β-D-葡萄吡喃糖苷是葡萄中主要的键合态 芳香物质。利用a-L-鼠李糖苷酶可以有效释放这些香气物质。
[0005] (3)生物转化：a -L-鼠李糖苷酶还可用于黄酮类物质的生物转化。不同的糖链决 定了黄酮类物质的不同生理功能，a-L-鼠李糖苷酶可以专一性的水解黄酮类物质糖链中 的鼠李糖苷，如a-L-鼠李糖苷酶可以转化芦丁生产药用价值更高的异斛皮素。
[0006] 黑曲霉具有产生α-L-鼠李糖苷酶的能力，但其产量不高，而且直接通过菌株发 酵获得a-L-鼠李糖苷酶一般和β-葡萄糖苷酶紧密结合在一起形成柚苷酶，分离得到 纯的a-L-鼠李糖苷酶用于生物转化具有一定的难度。另一方面，黑曲霉来源的a-L-鼠 李糖苷酶还没有被克隆和表达，本实验室在前期的研究中发现了黑曲霉NL-I发酵生产的 a -L-鼠李糖苷酶能有效应用于芦丁的生物转化，因此对黑曲霉NL-I来源的a -L-鼠李糖 苷酶展开了研究。
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【发明内容】
[0010] 解决的技术问题：直接通过黑曲霉菌株发酵获得的a -L-鼠李糖苷酶，不仅酶活 力低，而且粗酶液富含β_葡萄糖苷酶。针对目前还没有黑曲霉来源的α-L-鼠李糖苷酶 基因被克隆表达，且难以低成本大规模获得用于黄酮类物质生物转化的黑曲霉a-L-鼠李 糖苷酶纯酶的缺点，本发明提供一种来源于黑曲霉的a -L-鼠李糖苷酶Rhal及其表达基因 和应用。
[0011] 技术方案：a -L-鼠李糖苷酶Rhal，氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0012] 编码所述a -L-鼠李糖苷酶Rhal的基因，核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0013] 一种插入了 SEQ ID NO. 1所示a -L-鼠李糖苷酶Rhal基因的重组质粒。
[0014] 所述重组质粒的制备方法，其特征在于：
[0015] (1)按照真菌鼠李糖苷酶的同源性设计简并引物Pl和Ρ2,以黑曲霉菌株 (Aspergillus niger)NL-l的mRNA反转录的cDNA为模板，以Pl和Ρ2为引物进行PCR扩 增，得到鼠李糖苷酶Rhal基因的PCR扩增产物，所述引物为 ：
[0016] Pl :5, -ATGGCS(G/C)2(A/G/T)GCCAAATCTI(C/T)TM(A/C)TTGAA-3,；
[0017] P2 :5' -GGCAATATCCTCCGGTTCAGGTTCA-3' ；
[0018] (2)将步骤⑴所得PCR扩增产物与pMD-19T克隆载体在16°C下过夜连接；将连 接产物转化大肠杆菌ToplOF'感受态细胞，筛选阳性克隆，进行序列分析；挑选序列正确的 克隆提取质粒，获得含有a -L-鼠李糖苷酶基因的重组质粒pMD-19T_Rhal ;
[0019] (3)通过对鼠李糖苷酶Rhal全序列分析，设计引物P3和P4 :
[0020] P3 :5' -GGAATTCCATATGGCCAGCCAAATCTTCATTGAAA-3'，下划线表示 Nde I 位点；
[0021] P4 :5' -CCCAAGCTTGGCAATATCCTCCGGTTCAGGTTCA-3'，下划线表示 Hind III位点；
[0022] 以P3和P4为引物，以pMD-19T-Rhal为模板进行PCR ;将所得的PCR扩增产物和 pET20b分别用Nde I和Hind III双酶切，并分别割胶回收，16°C连接4h ;将连接产物转化 大肠杆菌ToplOF'感受态细胞，筛选阳性克隆，进行序列分析；挑选序列正确的克隆提取质 粒，获得含有a -L-鼠李糖苷酶基因的重组质粒pET20b_Rhal。
[0023] 包含所述的重组质粒的大肠杆菌宿主细胞。
[0024] 所述a -L-鼠李糖苷酶Rhal在柚皮苷、芦丁生物催化转化中的应用。
[0025] 有益效果：本发明首次克隆并重组表达了黑曲霉菌株（Aspergillus niger) a -L-鼠李糖苷酶Rhal的基因，重组酶Rhal可以水解柚皮苷和芦丁。该a -L-鼠李糖苷 酶在酶用量13U/mL，pH6. 5,35°C的条件下水解1.5g/L的芦丁 20min，水解效率高达98%以 上；该酶能在低温下生物催化和转化芦丁、柚皮苷等黄酮类化合物，大大降低了能耗。
【专利附图】
【附图说明】
[0026] 图1为重组a -L-鼠李糖苷酶电泳图；图1中M :Mark ;1 :粗酶液；2 :纯化后酶液。
[0027] 图2为重组a -L-鼠李糖苷酶Rhal水解柚皮苷的HPLC图谱。其中，⑴图谱为 使用灭活的a -L-鼠李糖苷酶水解柚皮苷的HPLC图谱，（2)图谱为加 a -L-鼠李糖苷酶水 解柚皮苷的HPLC图谱。
[0028] 图3为重组a -L-鼠李糖苷酶Rhal水解芦丁的HPLC图谱；第一个峰为芦丁（保 留时间为3. 630)，第二峰为异槲皮苷（保留时间为3. 788)。
[0029] 图4为重组a -L-鼠李糖苷酶水解芦丁条件的优化结果。其中，图a为温度对芦 丁水解率的影响，图b为pH对芦丁水解率的影响，图c为时间对芦丁水解率的影响，图d为 酶用量对芦丁水解率的影响。
【具体实施方式】
[0030] 下述实施例中的实验方法仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明， 凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的 保护范围之内，如无特殊说明，均为常规方法。本发明的实施例中所用到的材料包括：大肠 杆菌（Escherichia coli)ToplOF' ；pMD-19T克隆载体试剂盒，限制性内切酶、修饰酶、连接 酶等（购自 Takara 公司）；pET2〇b vector (购自 Invitrogen 公司）、p-NPR 购自 Sigma 公 司。
[0031] 实施例1
[0032] 1.黑曲霉菌株（Aspergillus niger)总 RNA 的获得
[0033] I. 1 黑曲霉菌株（Aspergillus niger)的培养
[0034] 黑曲霉菌株（Aspergillus niger)NL-I由本实验室筛选获得（黑曲霉cbhl基因 和耐高糖bgll基因克隆表达及定向改造，李国庆，南京林业大学，硕士论文，2012年），保 藏在南京林业大学微生物菌种保藏库， 申请人:保证从申请日起二十年内向公众发放生物材 料。黑曲霉菌株（Aspergillus niger)的培养基配方为：葡萄糖30g/L，K2HPO4 ·3Η2018/1， KC10. 5g/L，MgSO4O. 5g/L，FeSO4O. 01g/L，NaNO3O. 2g/L，pH 调至 4· 8,接种新鲜的黑曲霉孢子 悬液，30°C下180rpm培养3-4天过滤收集菌丝体。
[0035] 1. 2 黑曲霉菌株（Aspergillus niger)总 RNA 的提取
[0036] 取收集的黑曲霉菌株（Aspergillus niger)的菌丝体用PBS缓冲溶液清洗一次 后，用在液氮下研磨菌丝体至粉末状，收集到2mL离心管中，加入ImL Trizol后剧烈震荡， 4°〇下1200(^离心1〇1^11后转移上清液至21^离心管，加入2()(^1^氯仿震荡15 8混匀后 30°C下孵育2-3min，4°C下12000g离心IOmin取上层清夜，加入0. 8倍体积异丙醇混匀后 4°C下12000g离心lOmin，去净上清后用75wt. %乙醇水溶液（DEPC处理过的，去除了 mRNA 酶）清洗2次后4°C下7500g离心5min得到沉淀，使其自然干燥后，加入适量DEPC水溶解 RNA沉淀，作为模板RNA，-20°C下保存。
[0037] 2. a -L-鼠李糖苷酶Rhal编码基因的克隆
[0038] 2. 1 黑曲霉（Aspergillus niger) cDNA 的获得
[0039] 以黑曲霉（Aspergillus niger)菌株总RNA为模板，利用逆转录合成cDNA第一 链（以下各逆转录所用试剂均来自于试剂盒"PrimeScriptTMlstStrand cDNA Synthesis Kit"，购自 Takara 公司）。
[0040] 在微量离心管中配制下列模板RNA/Primer反应液：
[0041]
【权利要求】
1. a -L-鼠李糖苷酶Rhal，其特征在于氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
2. 编码权利要求1所述a-L-鼠李糖苷酶Rhal的基因，其特征在于核苷酸序列如SEQ ID NO. 1 所示。
3. -种插入了 SEQ ID NO. 1所示a -L-鼠李糖苷酶Rhal基因的重组质粒。
4. 权利要求3所述重组质粒的制备方法，其特征在于： (1) 按照真菌鼠李糖苷酶的同源性设计简并引物Pl和P2,以黑曲霉菌株（Aspergillus niger) NL-I的mRNA反转录的cDNA为模板，以Pl和P2为引物进行PCR扩增，得到鼠李糖苷 酶Rhal基因的PCR扩增产物，所述引物为： Pl :5, -ATGGCS(G/C)2(A/G/T)GCCAAATCI1 (C/T)TM(A/C)TTGAA-3,； P2 :5' -GGCAATATCCTCCGGTTCAGGTTCA-3' ； (2) 将步骤（1)所得PCR扩增产物与pMD-19T克隆载体在16°C下过夜连接；将连接产 物转化大肠杆菌ToplOF'感受态细胞，筛选阳性克隆，进行序列分析；挑选序列正确的克隆 提取质粒，获得含有Q-L-鼠李糖苷酶基因的重组质粒pMD-19T-Rhal ; (3) 通过对鼠李糖苷酶Rhal全序列分析，设计引物P3和P4 : P3 :5' -GGAATTCCATATGGCCAGCCAAATCTTCATTGAAA-3'，下划线表示 Nde I 位点； P4 :5' -CCCAAGCTTGGCAATATCCTCCGGTTCAGGTTCA-3'，下划线表示 Hind III位点；以 P3和P4为引物，以pMD-19T-Rhal为模板进行PCR ;将所得的PCR扩增产物和pET20b分 别用Nde I和Hind III双酶切，并分别割胶回收，16°C连接4h;将连接产物转化大肠杆菌 ToplOF'感受态细胞，筛选阳性克隆，进行序列分析；挑选序列正确的克隆提取质粒，获得含 有a-L-鼠李糖苷酶基因的重组质粒pET20b_Rhal。
5. 包含权利要求3所述的重组质粒的大肠杆菌宿主细胞。
6. 权利要求1所述a -L-鼠李糖苷酶Rhal在柚皮苷、芦丁生物催化转化中的应用。
【文档编号】C12N15/56GK104312996SQ201410504753
【公开日】2015年1月28日 申请日期:2014年9月26日 优先权日:2014年9月26日
【发明者】赵林果, 裴建军, 冯翊阳, 汤锋, 岳永德, 操海群, 余晓丹 申请人:南京林业大学