专利名称：α-L-鼠李糖苷酶在生物转化芦丁定向合成异槲皮苷中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于天然产物生物合成领域，具体涉及一种酶法生物转化芦丁定向合成异槲皮 苷的方法。背景技术：
现有技术异槲皮苷(Isoquercitrin, Quercetin-3-glucose)是声丁分子中α -L-鼠 李糖基水解后生成的次生苷，在抗氧化、降血压、抗炎、抗癌和抑制血小板聚集等方面具 有与芦丁(Rutin)和槲皮素(Quercetin)类似甚至更高效的生物活性和生物利用度，在 延缓人体老化和防治疾病方面具有重要作用。相关药理实验结果表明，异槲皮苷具有生 津止渴、清热解暑、降压强心及延年益寿的作用，还可有效地用于防治糖尿病、高血压、冠 心病、抑郁症及神经衰弱等疾病(CN101152201; CN101103121; Phytomedicine, 2009, 16: 761 767; Phytotherapy Research, 2008, 22: 1552 1556; European Journal of Pharmacology, 2005，522: 108 115;中草药,2009，40(4): 618 620)。因此，异槲皮苷 是目前药学界的热点新药化合物，一直也是国际上各大医药食品公司竞相开发的高级食品 添加剂、辅助药物或药物有效成分。异槲皮苷是芦丁的次生苷，几乎不溶于水，微溶于沸水，溶于碱溶液显深黄色，分 子式为C21H2tlO11,分子量为448. 38。异槲皮苷的制备方法主要有以下两种提取法和水解法。提取法通常是指从植物或植物提取物中采用溶剂萃取法提纯异槲皮苷，如 CN00808993公开的从生物类黄酮中回收异槲皮素方法，即从生物类黄酮浆(回收类黄酮的 母液残余物)中采用乙酸甲酯和水的混合溶剂提取，但由于类黄酮浆中含有槲皮素、异槲 皮素以及其他类似物，单纯采用溶剂萃取法难以低成本制备异槲皮苷。尽管芦丁在植物 资源中的分布广泛(如在槐花中芦丁含量最高可达28%)，然而其次生苷异槲皮苷在自然界 中的分布较少，其含量仅有几万分之一甚至是十万分之几(犬连轻工童学腐学痕，2007, 26(2): 112 115)，因此直接从自然界植物中提取难以制备异槲皮苷。由于本身结构式的多个活泼酚羟基，采用传统方式化学合成异槲皮苷的成本居高 不下，因而以芦丁等低成本糖苷为原料采用水解法制备在工艺可行性方面具有相对优势， 其水解反应过程常使用化学催化或酶催化水解法。(1)化学法水解文献报道最多，是由于芦丁苷键(鼠李糖苷键和葡萄糖苷键)为半 缩醛结构，对酸不稳定，对碱较稳定，易被酸催化水解，主要采用盐酸、硫酸等无机酸作催化 剂，水解反应机理是苷键原子先被质子化，然后苷键断裂形成糖基正离子或半椅型的中间 体，该中间体再与水结合形成糖，并释放催化剂质子。但是酸催化水解法的水解温度较高， 使用的酸对设备腐蚀严重，并产生大量的酸性废水，对环境造成污染。水解方式除前述常规 水解方法外，还有加压水解法，如CN1817876公开的用芦丁制备槲皮素和异槲皮苷的方法， 在高压反应釜中投入芦丁浆液，加热至沸，采用加压水解获得水解产物槲皮素和异槲皮苷， 但芦丁的水解过程中槲皮素和异槲皮苷共存，必须对水解产物采用分离手段才能获得异槲皮苷。(2)酶催化水解法主要以糖苷酶为催化剂，如CN03133636公开的酶法水解芦丁 制备异槲皮苷和槲皮素的方法，以槐米为高温好氧菌或曲霉菌或罗伦隐球酵母菌的发酵 产酶诱导物，液态或固态法产糖苷酶，通过调控反应条件水解芦丁产异槲皮苷和槲皮素的 混合物，但未实现异槲皮苷的定向转化；CN1685053公开从植物生物质提取和沉淀芦丁，采 用柚苷酶转化芦丁制备异槲皮苷和槲皮素。此外，采用鼠李糖苷酶水解芦丁制备异槲皮 苷的报道大多集中在该酶的酶学性质、基因重组等基础研究UrcAims of Biochemistry and Biophysics, 2003，415: 235^244； Enzyme and Microbial Technology, 2007，40: 1181 1187;大连轻工业学院学报,2007，26 (2): 112 115; Process Biochemistry, 2010, 45: 1226 1235)，尚未有采用鼠李糖苷酶生物催化水解芦丁高选择性定向制备异槲 皮苷的报道。综上，上述水解法均未能实现芦丁定向水解制备异槲皮苷。考虑到水解反应 的效率和对环境友好，采用酶法制备异槲皮苷更适合于工业化生产。因此，以自然界分布广 泛、来源丰富的芦丁为原料，经糖苷酶催化水解反应制备异槲皮苷，建立生物转化芦丁定向 合成异槲皮苷的酶促水解工艺是今后规模化制备异槲皮苷的唯一选择。因此，本专利首次应用α-L-鼠李糖苷酶催化水解芦丁分子中的鼠李糖，实现异 槲皮苷的定向生物合成。该方法具有条件温和，反应产物较单一，产物得率高，环境友好等 优点，从而可以克服传统的糖苷水解反应需要在高温高压下，由酸或碱催化完成，对设备要 求高，且对环境造成污染的缺点；此外，定向生物合成异槲皮苷可以克服以往酶促水解产 物多样性问题，易于工业化生产高纯度异槲皮苷，为今后大规模工业化生物合成异槲皮苷 的应用奠定了基础，为推动其在医药、食品、化妆品等工业中的广泛应用具有十分重要的意 义。
发明内容
技术问题针对现有技术中所述的不足，本发明提供了一种α-L-鼠李糖苷酶催化 水解芦丁定向生物合成异槲皮苷的方法。该方法可以高效地实现定向水解芦丁分子中的 α -L-鼠李糖苷键，为酶法制备高纯度异槲皮苷的工业化应用提供了新工艺。技术方案α -L-鼠李糖苷酶在生物转化芦丁定向合成异槲皮苷中的应用。α-L-鼠李糖苷酶在生物转化芦丁定向合成异槲皮苷中的应用，将α-L-鼠李糖 苷酶溶液按0. Γ50 g/L的加入量加入浓度为0.0广0.30 g/L的芦丁底物溶液中，pH 5 9， 进行酶促水解反应，反应温度2(T70°C，反应时间广60h，反应结束，获得含水解产物异槲 皮苷的转化液。还包括异槲皮苷的提取纯化步骤，将上述获得的转化液浓缩，调节其PH至 6-8，异槲皮苷沉淀析出，复溶后，重结晶，获得异槲皮苷。α-L-鼠李糖苷酶在生物转化芦丁定向合成异槲皮苷中的应用，配制作固定化酶 用的0.广10%胶体溶液，向胶体溶液中按0.广50 g/L的比例加入α-L-鼠李糖苷酶，混 合均勻后，滴入交联剂溶液中固化0. 5 12h，制成大小均勻的球状或方形固定化颗粒，洗涤 后备用；将固定化α -L-鼠李糖苷酶装填于柱状反应器，用泵输送浓度为0. 0Γ0. 30 g/ L、pH 5、的芦丁底物溶液，经过固定床，进行酶促水解反应，反应温度2(T7(TC，反应时间 广72h，反应结束，获得含水解产物异槲皮苷的转化液。还包括异槲皮苷的提取纯化步骤，将 获得的转化液浓缩，调节其PH至6-8，异槲皮苷沉淀析出，复溶后，重结晶，获得异槲皮苷。所述胶体为海藻酸钠、卡拉胶或明胶。
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有益效果
(1)以α-L-鼠李糖苷酶的粗酶制剂或固定化酶制剂用于催化水解芦丁定向生物合成 异槲皮苷，不仅催化剂来源广泛、制备容易、成本低廉，而且酶制剂稳定性高、易于保存、催 化效率和专一性高。因此，使用α-L-鼠李糖苷酶可大幅度降低槲皮素的生产成本，酶催化 转化率高，且产物专一。(2)采用本发明所述的技术方案得到的异槲皮苷由于在极性溶剂中的溶解度低于 底物芦丁，可以通过常规的减压浓缩和调节PH轻易地从酶促转化体系中沉淀分离，剩余的 底物芦丁可以继续酶促水解。因而，整个酶促反应工艺基本上无废弃物产生，无环境污染， 催化剂价格低廉，具有非常良好的工业化应用前景，可以满足迅速发展的医药工业和日化 工业的需要。四
图1为α-L-鼠李糖苷酶催化芦丁定向生物合成异槲皮苷的反应流程示意图； 图2为a-L-鼠李糖苷酶催化芦丁定向生物合成产物异槲皮苷的核磁共振谱图谱: [1H-WR ( 300 MHz, DMS0_d6 ) δ 12.64 ( 1Η, s，5_0H)，7.53 (1H, d, J = 2. 0 Hz, 2' -H), 7. 59 ( 1H, dd, J = 2.0,8.8 Hz, 6' -H) ,6. 89 (1H, d, J = 8. 8 Hz, 5' -H), 6. 40 (1H, d, J = 2. 0 Hz，8-H)，6. 19 ( 1H, d, J = 2. 0 Hz，6_H)，5. 4 ( 1H, d, J = 7. 6 Hz, 1" _ H )；
图3为a -L-鼠李糖苷酶催化芦丁定向生物合成产物异槲皮苷的核磁共振谱图谱 13C-NMR (DMS0-d6，300 MHz) δ 156.3 ( C~2 ) ,133. 3 ( C_3 ) ,177.4 ( C_4)、 161.2 (C-5)、98.6 (C_6)、164.1 (C_7)、93. 5 (C_8)、156.3 (C_9)、104.0 (C-IO), 121. 6 (C-I' ) ,115. 2 (C-2 ' ) ,144. 8 ( C_3 ' ) ,148. 4 ( C_4 ' ) ,116. 2 (C_5 ' ) ,121. 1 (C-6' ), 100. 7 ( C-I" ) ,74. 0 (C-2" )，76. 4 (C_3〃 ) ,69. 9 (C_4〃)，77.5(C_5〃)， 60. 9 (C-6〃)。据图2、3鉴定产物结构为槲皮素-3-0-i3_D -葡萄吡喃糖苷，即异槲皮苷， Isoquercitrin]0五具体实施例方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不 用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可 以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范 围。本发明实施例中使用同时检测芦丁和异槲皮苷的测定方法为高效液相色谱法，色 谱条件Alltima C18 (250 mmX 4. 6 mm，5 μ m)，流动相0. 02% 磷酸-乙腈(80 20，ν/ν)；检 测波长360 nm ；流速1. 0 mL/min ；进样量20 μ L。其中，产物异槲皮苷的转化率计算方法为
权利要求
α L 鼠李糖苷酶在生物转化芦丁定向合成异槲皮苷中的应用。
2.α-L-鼠李糖苷酶在生物转化芦丁定向合成异槲皮苷中的应用，其特征在于将 α-L-鼠李糖苷酶溶液按0.广50 g/L的加入量加入浓度为0.0广0.30 g/L的芦丁底物溶 液中，PH 5 9，进行酶促水解反应，反应温度2(T70°C，反应时间广60h，反应结束，获得含水 解产物异槲皮苷的转化液。
3.根据权利要求2所述的α-L-鼠李糖苷酶在生物转化芦丁定向合成异槲皮苷中的应 用，其特征在于还包括异槲皮苷的提取纯化步骤，将权利要求2获得的转化液浓缩，调节其 PH至6-8，异槲皮苷沉淀析出，复溶后，重结晶，获得异槲皮苷。
4.α-L-鼠李糖苷酶在生物转化芦丁定向合成异槲皮苷中的应用，其特征在于配制作 固定化酶用的0.广10%胶体溶液，向胶体溶液中按0. Γ50 g/L的比例加入α-L-鼠李糖苷 酶，混合均勻后，滴入交联剂溶液中固化0. 5 12h，制成大小均勻的球状或方形固定化颗粒， 洗涤后备用；将固定化α-L-鼠李糖苷酶装填于柱状反应器，用泵输送浓度为0.0广0. 30 g/L、pH 5、的芦丁底物溶液，经过固定床，进行酶促水解反应，反应温度2(T70°C，反应时 间广72h，反应结束，获得含水解产物异槲皮苷的转化液。
5.根据权利要求3所述的α-L-鼠李糖苷酶在生物转化芦丁定向合成异槲皮苷中的应 用，其特征在于所述胶体为海藻酸钠、卡拉胶或明胶。
6.根据权利要求3所述的α-L-鼠李糖苷酶在生物转化芦丁定向合成异槲皮苷中的应 用，其特征在于还包括异槲皮苷的提取纯化步骤，将权利要求4或5获得的转化液浓缩，调 节其PH至6-8，异槲皮苷沉淀析出，复溶后，重结晶，获得异槲皮苷。
全文摘要
α-L-鼠李糖苷酶在生物转化芦丁定向合成异槲皮苷中的应用。以α-L-鼠李糖苷酶的粗酶制剂或固定化酶制剂用于催化水解芦丁定向生物合成异槲皮苷，不仅催化剂来源广泛、制备容易、成本低廉，而且酶制剂稳定性高、易于保存、催化效率和专一性高。因此，使用α-L-鼠李糖苷酶可大幅度降低槲皮素的生产成本，酶催化转化率高，且产物专一。
文档编号C12P17/06GK101985639SQ201010545588
公开日2011年3月16日 申请日期2010年11月16日 优先权日2010年11月16日
发明者吴福安, 孙国霞, 安亚雄, 王俊, 马延龙 申请人:江苏科技大学