专利名称：高效表达类胰岛素生长因子igf-1的乳腺特异性表达载体的制作方法
高效表达类胰岛素生长因子IGF-1的乳腺特异性表达载体技术领域：
本发明涉及一种高效表达类胰岛素生长因子的乳腺特异性表达载体，属于生物技 术领域，具体地讲涉及促进泌乳、提高奶产量的类胰岛素生长因子IGF-I。二、背景技术
羊奶营养丰富，是最“接近完美的食品”；人称“白色血液”，是最理想的天然食品。 但每头羊单产量比较低，且羊奶所占的市场份额不足5%，于是提高羊奶产量就成为一个急 需完成的任务摆在了我们面前。常规的育种技术费时，费力；而转基因技术正好可以快速改 变物种某种性状。体内影响乳腺发育的主要因素有生长激素、催乳素、孕酮、雌激素和类胰 岛素生长因子(IGF-I)。其中IGF-I在泌乳期奶羊乳腺发育中起到重要作用，IGF-I的缺少 将直接导致乳腺的不发育。
IGF-I功是一类介导合成代谢且具有GH样效应的细胞因子，IGF-1也被称作“促 生长因子”(即somatomedin C)，是一种在分子结构上与胰岛素类似的多肽蛋白物质。 IGF-I对泌乳的影响主要体现在两个方面一方面，它可以提高泌乳动物单位时间的奶产 量。Prosser通过对泌乳期的山羊动脉注射IGF-1，可以使山羊的奶产量提高9% ’另一方 面，IGF-I还可以提高泌乳动物的泌乳持续性。Hdsell研究表明，IGF-I的持续表达使乳 腺上皮细胞不进入凋亡途径，减缓乳腺细胞的衰老，从而延长了泌乳的时间以及泌乳的分 泌能力。IGF-I对乳腺的泌乳起着重要作用的其机制可能是通过调节信号分子来促进乳腺 细胞Akt (Rac苏氨酸激酶)活性同时提高泌乳动物的泌乳持续性；也可能是通过改善氧化 破坏的效应来提高泌乳动物泌乳的持续性；还有可能是IGF-I使乳腺上皮细胞不进入凋亡 途径，减缓乳腺细胞的衰老，从而延长了泌乳的时间以及泌乳的分泌能力。Loladze等发现 在产后乳腺的发育对上皮细胞和皮间质中IGF-I的表达具有依赖性。具体来说上皮细胞 的IGF-I在青春期介导分支导管的正常发育；而皮间质IGF-I则在青春期和腺泡形成期调 节上皮细胞的扩散和成熟。此外，IGF-I对腺泡中乳蛋白的翻译也起到一定的调节作用。 Forsyth在羊中发现IGF-ImRNA的表达量在青春期和妊娠期显著高于其它时期。Su证明 在转IGF-I基因小鼠中，过表达IGF-I会刺激泌乳初期奶产量的增加。众多研究都指向了 IGF-I在乳腺发育中不可或缺的作用和对奶产量提高的潜在应用价值。应用乳腺特异性启 动子(如酪蛋白、乳清蛋白和乳白蛋白)构建IGF-I乳腺特异性表达载体，可在泌乳初期增 加转IGF-I基因小鼠的奶产量。
本研究从萨能奶山羊中克隆得到一个与乳腺发育和泌乳持续性相关的基因 igf-Ι，通过构建乳腺特异性表达载体pIN，研究IGF-I基因在体外人乳腺癌细胞Bcap-37上 的表达情况，为进一步生产转IGF-I基因奶山羊提供试验材料。三、发明内容
技术问题
本发明的目的在于公开一个萨能奶山羊类胰岛素生长因子基因igf-Ι促进泌乳的基因工程应用，构建乳腺特异性表达载体pIN，并在人乳腺癌细胞Bcap-37上通过转染后 检测IGF-I的表达量，证实载体的有效性，为后期生产转igf-Ι基因奶山羊提供试验材料。
技术方案
高效表达类胰岛素生长因子(IGF-I)的乳腺特异性表达载体pIN，其中igf_l基因 具有如SEQ ID NO. 1所示的序列。其构建方法包括
1)萨能奶山羊类胰岛素生长因子基因igf-Ι的克隆
参照NCBI上genebank登录号D11378的山羊IGF-ImRNA全序列引物设计如下
上游引物5，-ACAGGTACCATGGGAAAAATCAGCAGTCT-3，
下游引物5，-CGCAAGCTTCTACATTCTGTAGTTCTTGT-3，
以萨能奶山羊肝脏组织提取的总RNA为模板，经M-MLV反转录酶合成cDNA第一 链后进行PCR扩增；反应条件为94°C预变性5min ；94°C变性30s，57°C复性30s，72°C延伸 45s, 30个循环后；72°C延伸IOmin ；将PCR克隆至pMD19_T载体，测序后获得具有完整编码 区的萨能奶山羊类胰岛素生长因子基因igf-Ι的cDNA序列SEQID NO. 1 ；
2)乳腺特异性表达载体的构建
根据骨架载体pBCl和SEQ ID NO. 1序列，设计特异性引物
上游引物5，-ATCGCGGATCCTCGAGATGGGAAAAATCAG-3，
下游引物5，-GGTCCGGATCCTCGAGGAGCTCCTACATTCTGTAG-3，
以步骤1)中获得的PCR扩增产物为模板，经PCR扩增将获得的igf_l序列克隆至 PBCl载体上，获得载体pi ；进一步将筛选标记基因neo克隆到载体pi上获得乳腺特异性表 达载体pIN。
有益效果
类胰岛素生长因子基因可以提高哺乳动物的泌乳持续性。体外转染人乳腺癌细 胞Bcap-37结果显示，从12小时到第48小时，转染组(只转染乳腺特异性表达载体pIN) 和转染加诱导组(转染载体PlN同时加入诱导剂进行诱导表达)IGF-I表达量均高于对照 组(正常培养的Bcap-37细胞未转染载体pIN)。其中在第36小时转染组的IGF-I表达量 1267. 10ng/ml和转染加诱导组IGF-1表达量1472. 10ng/ml更是显著高于对照组的IGF-1 表达量776. 86ng/ml。IGF-I的表达增加量将近一倍。
本发明的igf-Ι可作为目的基因导入哺乳动物，促进哺乳动物的乳腺发育，提高 泌乳性能，以进行动物品种改良，所编码的蛋白质具有促进泌乳功能。
携带有本发明igf-Ι的乳腺特异性表达载体可通过使用脂质体、电转等常规生物 学方法转化萨能奶山羊细胞，并将成功转化细胞经核移植生产转igf-i基因奶山羊。
下面结合附图及实施例对本发明做进一步说明。所述是对本发明的解释而不是限 定。四
图1 乳腺特异性表达载体pIN的质粒图谱
图2 乳腺特异性表达载体PlN的构建
A=IGF-I基因的克隆图片
Bmeo基因的克隆图片
C =Kpn I/Cla I 双酶切 PI 鉴定图
D =Not I单酶切表达载体PlN鉴定图
图3 :Bcap-37细胞转染质粒pIN后提取细胞蛋白SDS-Page电泳图
图4 =IGF-I基因人乳腺癌细胞系转染表达western blot鉴定图
图5 放免(RIA)检测同一时间不同处理细胞裂解液中IGF-I含量
图6 放免(RIA)检测同一时间不同处理细胞培养液中IGF-I含量
图7 放免(RIA)检测同一时间不同处理细胞裂解液加细胞培养液IGF-I总含量五具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明，均为常规方法。
具体涉及的材料和试剂如下
羊肝脏组织来自于无感染病史的萨能奶山羊(购自南京溧水种山羊养殖场)， 将组织于液氮冷冻，骨架载体 pBCl (Company =Invitrogen ；Catalog Number :K27001 ； Product :pBClMilk Expression Vector Kit)；载体 pCDNA3. 1 (Company :Invitrogen ；英文 名称PCDNA3. 1/ZE0(+) ；Catalog Number :V86020)；人乳腺癌细胞Bcap-37 (南京凯基生物 公司；货号KG035 ；名称人乳腺癌细胞Bcap-37)；载体pBluescriptIISK(+)以及E. coli JM109(购自大连宝生物，Takara)。
试剂TRizol，MLV-反转录酶，rTaq 酶，pMD19_T 载体，Agarose Gel DNAPurification Kit, In-Fusion Advantage PCR Cloning Kit, TaKaRa DNA Ligation Kit内切酶)(ho I, Not I, Kpn I, Cla I等均购自TAKARA公司；OMEGA无内毒素质粒提取试 剂盒购自OMEGA公司；脂质体Lipofectamine 2000，胎牛血清购自hvitrogen公司；DMEM 培养基(货号C12430)购自Gibco公司；青链双抗(购自碧云天)；胰岛素、催乳素、氢化可 的松(购自南京生兴生物有限公司)；鼠抗羊IGF-I单克隆抗体(Abeam)；鼠抗人抗体(武 汉博士德)；进口 IGF-I碘标试剂盒(货号HY-10079B ；北京华英生物技术有限公司)其他 试剂均为国产或进口分析纯级。
1.载体pIN的构建及酶切验证
1. Iigf-I基因的克隆
首先勻浆器勻浆肝脏组织样品，然后TRizol法提取总RNA0以萨能奶山羊肝脏织 的总RNA为模板，以oligod(T) 18引物采用invirtrogen公司的M-MLV反转录酶合成cDNA第一链。
引物设计和合成参照NCBI上的山羊igf-lmRNA全序列(Capra hircus mRNA forinsulin-like growth factor-I, complete cds)登录号D11378 用 DNASTAR 做限制性 内切酶分析，用primerf. O设计引物扩增IGF-I中的信号肽与前体蛋白部分。
引物设计如下igf_l引物
上游引物IF 5，-ACAGGTACCATGGGAAAAATCAGCAGTCT-3，
下游引物IR :5，-CGCAAGCTTCTACATTCTGTAGTTCTTGT-3，
反应条件为94°C预变性5min ；94°C变性30s，57°C复性30s，72°C延伸45s，共30 个循环；然后72°C延伸10min，4°C终止(如图2A)
l.aieo基因的克隆
以质粒pCDNA3. 1为模板，利用生物软件Vector NTI和Primer Premier 5. 0辅助 设计了 1对引物。为了方便后续步骤的操作，在引物的两端添加了 Not I酶切位点。
上游引物IF :5，-GCGGCCGCTGTGGAATGTGTGTCAGTTA-3，
下游引物IR 5，-GCGGCCGCACAGACATGATAAGATACAT-3，
反应条件为94°C预变性5min ；94°C变性30s，64°C复性30s，72°C延伸45s，共30 个循环；然后72°C延伸10min，4°C终止(如图2B)
筛选标记基因neo对新霉素(neomycin)的抗药基因；该基因产物可使细胞在含有 新霉素的培养基中生长。
1. 3将igf-Ι基因克隆到pMD19-T载体上
将PCR扩增的目的条带经胶回收纯化后，与PMD19-T载体连接得到质粒 pMD19-T-igf-l，转化E. coli JM109感受态，挑取菌落做菌落PCR鉴定筛选阳性克隆；筛选 出阳性克隆，提质粒pMD19-T-igf-l，酶切、PCR鉴定，送交上海生工测序。测序结果生物信 息学分析显示483bp的序列包含了 igf-Ι中的信号肽与前体蛋白部分，所克隆的48;3bp的 IGF-I序列与GenBank中登录的山羊mRNA全序列的同源性为100%。
1. 4将neo基因克隆到pMD19_T载体上
将PCR扩增的目的条带经胶回收纯化后，与PMD19-T载体连接得到质粒 pMD19-T-ne0，转化E. coli JM109感受态，挑取菌落做菌落PCR鉴定筛选阳性克隆；筛选出 阳性克隆，提质粒pMD19-T-ne0，酶切、PCR鉴定，送交上海生工测序。测序结果分析显示 1505bp的序列包含了 NEO基因中的启动子，目的基因和polyA结尾，所克隆的1505bp的neo 基因序列与质粒P⑶NA3. 1上的序列的同源性为100%。
脂ο基因为筛选标记基因，是对新霉素(neomycin)的抗药基因；该基因产物可使 细胞在含有新霉素的培养基中生长。
1. 5将igf-Ι使用In-fusion的方法插入到骨架载体pBCl的Β ο I处
骨架载体pBCl包含山羊的β-酪蛋白的5’和3’端调控元件，目前已经用于转基 因动物调控元件主要有β-乳球蛋白调控序列、aSl和β-酪蛋白调控序列、乳清酸蛋白基 因调控序列和乳清白蛋白基因调控序列。近年来的研究表明β-乳球蛋白和β-酪蛋白 基因调控序列构建的乳腺生物反应器表达载体在绵羊、山羊和奶牛上获得高水平表达；而 乳清酸蛋白基因调控序列指导的蛋白则在兔和猪等动物上有较高水平的表达，但各有优缺 点。本专利所采用的骨架载体PBCl上使用山羊β-酪蛋白5’端调控序列，主要包括4. Ikb 的启动子区域，同时还含有2. 3kp的外显子1、内含子1、外显子2的部分。外显子2具有翻 译的起始信号，并编码信号肽序列的15个氨基酸；内含子特别是第1内含子不仅具有增强 子和激素诱导的表达活性，同时也能够影响下游基因的组织特异性表达。启动子区域依次 排列着 CpG slancUmilk box element、STAT5、CAAT box、八聚体 PSV40 增强子元件、TATA box等启动子元件，是酪蛋白基因表达的核心调控序列。对哺乳期的母山羊、羊、牛的乳腺研 究发现哺乳动物奶样中，asl as2 β κ这四种酪蛋白以4 :1:4: 1的比例 进行翻译，而山羊CSmSl位点的三种基因型a si-酪蛋白mRNA的含量激烈的从30% (A/ A)降到17% (A/E)，再降到3% (E/F)。因此选择β -酪蛋白作为调控元件可以获得最大的 翻译效率。
In-fusion 引物克隆 igf_l 基因6
上游引物F 5，-ATCGCGGATCCTCGAGATGGGAAAAATCAG-3，
下游引物R 5，-GGTCCGGATCCTCGAGGAGCTCCTACATTCTGTAG-3，
以步骤1. 3 中的质粒pMD19-T-igf-l 为模板，使用PrimeSTAR HS DNA Polymerase 扩增。切胶回收PCR产物，将回收产物使用h-fusion Advantage PCR Cloning Kit与骨 架载体pBCI相连接。如(图2C)。
设计一个测序用引物，对连接到pBCI上的igf-Ι进行检测
检测引物5，-TTTGCAGGATCTTGGTTC-3，
In-fusion技术适用于长片段克隆、及多基因融合等，该方法不仅可以使大量平行 的片段相连接，而且可以灵活的混合搭配生物模块。在构建载体PlN的过程中，我们使用了 h-Fusion融合的方法将igf-Ι基因插入到pBCI载体上，获得中间载体pi。Berrow利用这 一技术进行高通量载体构建时发现克隆效率超过90 %，明显高于(iateWay重组技术(79 % ) 和经典的限制性酶切连接技术(87% )。这一方法绕开了了 pBCI载体上缺少多克隆位点少 的限制，同时也避开了大片段与小片段的酶切连接难度。
1. 6插入neo基因
将步骤1. 4中说获得的质粒pMD19-T-ne0与步骤1. 5中所获得的载体pi经Not I酶切后相连接得到乳腺特异性表达载体PIN，转化Ε. ColiJM109感受态。挑取单菌落验证 阳性克隆，摇菌扩增后提取质粒，送交上海生工测序。
1. 7重组质粒pIN的鉴定
用克隆igf-Ι基因和克隆neo基因的引物分别进行PCR扩增检验。同时使用内切 酶NotI对质粒pIN进行酶切鉴定。由图2D可知载体pIN经NotI酶切后，切出大小1505bp 和22108bp的片段，与预期结果一致。同时进行PCR验证。以上鉴定证实pIN载体构建成功。
2转染质粒pIN的提取和纯化
将重组质粒pIN用OMIGA无内毒素质粒提取试剂盒提取和纯化质粒，_20°C保存， 用于细胞转染。
3人乳腺癌细胞Bcap-37的培养
从液氮中取出人乳腺癌细胞Bcap-37，立即投入37 40°C温水中快速晃动，直至 冻存液完全溶解。将细胞冻存液移入细胞培养瓶，加入约4mL培养液，放入37°C，5%的CO2 培养箱内培养。用体积分数10%胎牛血清、链霉素lOOug/mL，青霉素100U/mL的DMEM培养 基进行培养。转染前ld，待细胞铺满培养皿底的70% 80%时，改用无血清、无抗生素的 DMEM培养基洗涤细胞2次，饥饿M小时后转染。
4人乳腺癌细胞的转染
将人乳腺癌细胞接种于60mm孔培养板中，每个板用5ml培养基进行培养，转染前 ld，待细胞铺满培养皿底的70% 80%时，改用无血清、无抗生素的DMEM培养基洗涤细胞 2次，饥饿M小时后转染。次日转染按Lipofectamine 2000说明书进行转染，脂质体(uL) 与质粒(ug)的比例为3 2。细胞培养他后弃去混合液，加入体积分数10%胎牛血清、不 含抗生素的DMEM培养基继续培养。
5pIN转染人乳腺癌细胞后IGF-I含量的检测
细胞诱导表达及样品处理人乳腺癌细胞大量繁殖后，以1 X IO7的密度接种60mm培养皿，总共接种51个培养皿，分为对照组，转染质粒PlN组，和转染质粒pIN加诱导组，每 组17个皿。分别培养，在细胞涨至70% 80%时对转染质粒pIN组，和转染质粒pIN加诱导 组用脂质体LipofectamindOOO进行转染。转染后6小时对3个组均换液，换为DMEM+10% 胎牛血清。其中诱导组加入胰岛素(10yg/mL)、催乳素(1 μ g/mL)、氢化可的松QOyg/ mL)进行诱导培养。在转染后12、24、36、48四个时间点分别提取细胞上清蛋白和细胞蛋 白，并使用Western blotting和放射免疫的方法检测所提取细胞上清蛋白和细胞蛋白中的 IGF-I含量。
Dffestern blotting 检测 IGF-1
将步骤5中所提取的细胞上清蛋白和细胞蛋白经SDS-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝 胶电泳分离，凝胶用蒸馏水漂洗1遍，再用转移缓冲液漂洗1遍。剪取1张与凝胶大小相 同的NC滤膜，在其左下角作一标记，先将滤膜用甲醇浸泡2 3s，再用去离子水浸泡滤膜 1 aiiin以洗去甲醇，最后用转移缓冲液浸泡滤膜lOmin，按凝胶面积0. 65mA/cm2电流转 移90min，转移结束后，将NC膜浸入20mL封闭液中，室温轻轻摇动，封闭lh。用TBST洗膜3 次，每次lOmin。将NC膜浸入IOmL用TBST稀释的鼠抗羊IGF-I单克隆抗体(Abeam)溶液 中，室温轻轻摇动温育1.证。用TBST洗膜3次，每次lOmin，将NC膜浸入IOmL用TBST稀 释的鼠抗人抗体(武汉博士德)溶液中，室温轻轻摇动温育1.证。用TBST洗膜3次，每次 IOmin0将NC膜浸入5mL碱性磷酸酶生色底物溶液中，轻轻摇动，观察反应过程，当蛋白条 带显现时，终止反应。室温干燥PVDF膜，拍照。
2)放射免疫检测IGF-I含量
将冻存的蛋白自然编号1-96，送交北京华英生物技术公司检测。检测试剂盒为进 口 IGF-I碘标试剂盒(HY-10079B)。放射免疫检测结果显示，从12小时到第48小时，转染组 (只转染乳腺特异性表达载体PIN)和转染加诱导组(转染载体PlN同时加入诱导剂进行诱 导表达)IGF-I表达量均高于对照组(正常培养的Bcap-37细胞未转染载体pIN)。其中在 第36小时转染组的IGF-I表达量U67. 10ng/ml和转染加诱导组IGF-I表达量1472. IOng/ ml更是显著高于对照组的IGF-I表达量776. 86ng/ml。IGF-I的表达增加量将近一倍。由 于人乳腺癌细胞和泌乳期的乳腺细胞具有相似的功能。因此，本专利实验中转染乳腺特异 性表达载体PlN的人乳腺癌细胞上IGF-I含量的增加意味着同样类似的体内试验结果。这 种有活性的IGF-I可进一步作用于乳腺上皮细胞和基质细胞，影响乳腺的发育和泌乳，进 而影响奶产量。8
权利要求
1. 一种高效表达类胰岛素生长因子IGF-I的乳腺特异性表达载体，其igf-Ι基因具有 如SEQ ID NO. 1所示的序列，其构建方法包括1)萨能奶山羊类胰岛素生长因子基因igf-i的克隆参照NCBI上genebank登录号D11378的山羊IGF-ImRNA全序列引物设计如下上游引物5’ -ACAGGTACCATGGGAAAAATCAGCAGTCT-3’下游引物5，-CGCAAGCTTCTACATTCTGTAGTTCTTGT-3，以萨能奶山羊肝脏组织提取的总RNA为模板，经M-MLV反转录酶合成cDNA第一链后进 行PCR扩增；反应条件为94°C预变性5min ；94°C变性30s，57°C复性30s，72°C延伸45s，30 个循环后；72°C延伸IOmin ；将PCR克隆至pMD19_T载体，测序后获得具有完整编码区的萨 能奶山羊类胰岛素生长因子基因igf-Ι的cDNA序列SEQID NO. 1 ；2)乳腺特异性表达载体的构建根据骨架载体PBCl和SEQ ID NO. 1序列，设计特异性引物上游引物5’ -ATCGCGGATCCTCGAGATGGGAAAAATCAG-3，下游引物5’ -GGTCCGGATCCTCGAGGAGCTCCTACATTCTGTAG-3’以步骤1)中获得的PCR扩增产物为模板，经PCR扩增将获得的igf-Ι序列克隆至pBCl 载体上，获得载体Pl ；进一步将筛选标记基因neo克隆到载体pi上获得乳腺特异性表达载 体 pIN。
全文摘要
本发明公开了高效表达类胰岛素生长因子IGF-1的乳腺特异性表达载体，属于生物工程技术领域。IGF-1的cDNA序列见SEQ ID NO.1。将本发明构建的乳腺特异性表达载体pIN在体外采用脂质体法转染到人乳腺癌细胞Bcap-37，转染后提取细胞上清蛋白和细胞蛋白；采用western blot和放免方法检测细胞上清蛋白和细胞蛋白中IGF-1含量。结果显示与未转染乳腺特异性表达载体pIN的对照组相比，转染乳腺特异性表达载体pIN组中，IGF-1表达量显著提高。表明pIN载体可已在乳腺细胞上成功表达IGF-1，为下一步生产转IGF-1基因奶山羊奠定坚实的基础。
文档编号C12N15/85GK102041271SQ20101054465
公开日2011年5月4日 申请日期2010年11月16日 优先权日2010年11月16日
发明者庾庆华, 张强, 杨倩, 林 建 申请人:南京农业大学