一种马鹿胰岛素样生长因子制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种马鹿胰岛素样生长因子制备方法，包括下列步骤：1)用deer?IGF?Ⅰ基因片段和PET44质粒构建重组质粒；2)对所述重组质粒进行扩增，并从中筛选出单克隆阳性的重组质粒；3)将单克隆阳性的重组质粒转化入BL21(DEa)大肠杆菌中得到重组子，在培养基中通过所述重组子进行deer?IGF?Ⅰ蛋白诱导表达；4)将所述重组子的菌体从所述培养基中分离，并在破菌液中，对所述重组子的菌体进行破菌，使deer?IGF?Ⅰ蛋白以可溶性融合蛋白的表达形式进入所述破菌液；5)对所述可溶性融合蛋白进行酶切，使所述可溶性融合蛋白分解为deer?IGF?Ⅰ蛋白和Nus蛋白；6)对deer?IGF?Ⅰ蛋白进行纯化、透析除盐和浓缩。
【专利说明】
一种马鹿胰岛素样生长因子制备方法
技术领域
[0001] 本发明涉及生物工程领域的一种马鹿胰岛素样生长因子制备方法。
【背景技术】
[0002] IGF(insulin_like growth factors)，中文翻译为胰岛素样生长因子或类胰岛素 生长因子，因其结构与胰岛素类似而得名；也被称为〃生长激素介质〃（即SM， somatomedins)。是生长激素产生生理作用过程中必需的一种活性蛋白多肽物质。现在已知 的胰岛素样生长有IGF-I和IGF-II两种。生长激素的生理作用包括促进生长，且对于糖、脂、 蛋白质代谢和无机盐代谢必不可少。
[0003] 已知的IGF-I是一种活性蛋白多肽物质，它是人体内肝细胞、肾细胞、脾细胞等十 几种细胞自分泌和旁分泌的产物，也就是说人体内本身就含有IGF-I。其具体功能如下：
[0004] 降血糖:在这方面IGF-I与胰岛素相似，能增强人体对葡萄糖和氨基酸的吸收，促 进糖原的合成和乳酸分泌，抑制糖原分解，增加人体对胰岛素灵敏度的功能，提高人体胰岛 素的作用效率。对胰岛素非依赖型糖尿病，即n型糖尿病具有较好的疗效。
[0005] 降血脂：IGF_I作用于脂肪细胞能促进脂肪分解和糖原合成，降低血中总甘油三 酯、降低密度脂蛋白甘油三酯和低密度脂蛋白胆固醇的水平。
[0006] 舒张血管：IGF-I能调节心脏的生理和病理状况，具有舒张血管，降低血管阻力，增 加心脏的血流量的作用。
[0007] 促进骨的合成代谢保持其正常结构功能：IGF_I可明显地促进多种来源的软骨细 胞分裂增殖和软骨基质的合成。IGF-I还可刺激软骨细胞合成软骨基质特异型胶原蛋白-II 型胶原，增加糖胺聚酶的活性，增强成骨细胞的碱性磷酸酯酶的活性。
[0008] 促生长:IGF_I是人体内非常重要的细胞有丝分裂促进剂。
[0009] 促细胞分化：IGF-I对维持与细胞分化有关蛋白质水平十分重要，与一些生长因子 合用能促进细胞分化成熟。
[0010] 创伤修复：IGF-I还参与创伤愈合的过程。实验证明，损伤的神经、肌肉和肉皮细胞 中IGF-I浓度增加。
[0011] 由于马鹿的鹿茸中含有大量的活性多肽，具有广泛的药用价值，多肽中最具价值 的是马鹿胰岛素生长因子，即deer-IGF-I，但是鹿茸每年只能收集一次，并且deer-IGF-I在 鹿茸中的含量比较低，因此需要一种马鹿胰岛素样生长因子表达纯化工艺，简化鹿胰岛素 生长因子的纯化工艺，降低成本，以克服鹿茸收集次数少，其中deer-IGF-I的含量技术问 题。
【发明内容】
[0012] 本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种马鹿胰岛素样生长因子制备 方法，其制备的蛋白数量更大，成本更低;并增加了蛋白的稳定性，分离方法简便，便于大规 模制备，应用前景广。
[0013] 实现上述目的的一种技术方案是:一种马鹿胰岛素样生长因子制备方法，包括下 列步骤：
[0014] 1)用deer-IGF-I基因片段和PET44质粒构建重组质粒；
[0015] 2)对所述重组质粒进行扩增，并从中筛选出单克隆阳性的重组质粒；
[0016] 3)将单克隆阳性的重组质粒转化入BL21(DEa)大肠杆菌中得到重组子，在培养基 中通过所述重组子进行deer-IGF-I蛋白诱导表达；
[0017] 4)将所述重组子的菌体从所述培养基中分离，并在破菌液中，对所述重组子的菌 体进行破菌，使deer-IGF-I蛋白以可溶性融合蛋白的表达形式进入所述破菌液；
[0018] 5)对所述可溶性融合蛋白进行酶切，使所述可溶性融合蛋白分解为deer-IGF-I蛋 白和Nus蛋白；
[0019] 6)对deer-IGF-I蛋白进行纯化、透析除盐和浓缩，得到deer-IGF-I蛋白。
[0020] 进一步的，步骤1中，
[0021 ]将马鹿的鹿血组织的总RNA，反转录成双链的cDNA，并通过PCR引物，从所述双链的 cDNA中调取deer-IGF-I基因片段；
[0022] 调取deer-IGF-I基因片段的前端PCR引物为:F:CCCA AGCT TATG GGAA AAAT CAGC AGTC TTCC；
[0023] 调取deer-IGF-I基因片段的后端PCR引物为：R:CCGG AAIT CCTA CAIT CTGT AGIT CTTG TTTC C〇
[0024] 再进一步的，步骤1包括下列步骤：
[0025] la)在deer-IGF-I基因片段的前端添加Hind III酶切位点，后端添加EcoRI酶切位 点和终止密码子；
[0026] lb)对PET44质粒进行EcoR I酶切位点和Hind in酶切位点的双酶切；
[0027] lc)在DNA连接酶的作用下，将deer-IGF-I基因片段与PET44质粒连接，构建所述重 组质粒。
[0028] 进一步的，步骤2包括下列步骤：
[0029] 2a)将所述重组质粒连接体系转化DH5a感受态大肠杆菌，得到转化子，并扩增所述 转化子；
[0030] 2b)采用氨苄抗性平板筛选扩增后的转化子，从中筛选出单克隆阳性的转化子；
[0031] 2c)从单克隆阳性的转化子中提取单克隆阳性的重组质粒。
[0032] 进一步的，步骤3中所述重组子对于deer-IGF-I蛋白的诱导表达是在含有IPTG的 LB培养基中进行的。
[0033] 进一步的，步骤4包括下列步骤：
[0034] 4a)通过离心分离机对所述培养基进行离心分离，去除离心分离后的上层清液，留 下所述重组子的菌体；
[0035] 4b)用破菌液分散所述重组子的菌体，在超声波的作用下对所述重组子的菌体进 行破菌，保留破菌后溶解在所述破菌液中可溶性融合蛋白，该可溶性融合蛋白是由deer-IGF-I蛋白和Nus蛋白结合而成的。
[0036] 再进一步的，步骤5包括下列步骤：
[0037] 5a)使所述破菌液通过镍离子柱，对所述破菌液中的可溶性融合蛋白进行纯化，收 集镍离子柱洗脱后的一次洗脱液；
[0038] 5b)对所述一次洗脱液中可溶性融合蛋白用EK酶进行酶切，使deer-IGF-I蛋白与 Nus蛋白分离。
[0039] 更一步的，步骤6包括下列步骤：
[0040] 6a)使所述一次洗脱液再次通过镍离子柱，去除其中的Nus蛋白；
[0041 ] 6b)收集二次洗脱液，对所述二次洗脱液进行透析除盐；
[0042] 6c)通过冷冻干燥对所述二次洗脱液进行浓缩，最终得到deer-IGF-I蛋白。
[0043]进一步的，用蛋白质凝胶电泳法检测步骤6中得到的deer-IGF-I蛋白的电泳图谱。 [0044] 进一步的，通过MTT法，用HeLa细胞检测deer-IGF-I蛋白的活性。
[0045]采用了本发明的一种马鹿胰岛素样生长因子制备方法的技术方案，包括下列步 骤：1)用deer-IGF-I基因片段和PET44质粒构建重组质粒;2)对所述重组质粒进行扩增，并 从中筛选出单克隆阳性的重组质粒;3)将单克隆阳性的重组质粒转化入BL21(DEa)大肠杆 菌中得到重组子，在培养基中通过所述重组子进行deer-IGF-I蛋白诱导表达;4)将所述重 组子的菌体从所述培养基中分离，并在破菌液中，对所述重组子的菌体进行破菌，使deer-IGF-I蛋白以可溶性融合蛋白的表达形式进入所述破菌液;5)对所述可溶性融合蛋白进行 酶切，使所述可溶性融合蛋白分解为deer-IGF-I蛋白和Nus蛋白；6)对deer-IGF-I蛋白进行 纯化、透析除盐和浓缩。其技术效果是:与从马鹿的鹿茸中直接提取deer-IGF-I蛋白并进行 纯化相比，制备的蛋白数量更大，成本更低;并增加了蛋白的稳定性，分离方法简便，便于大 规模制备，应用前景广。
【附图说明】
[0046]图1为PET44质粒的酶切位点的示意图。
[0047] 图2为PET44质粒的图谱。
[0048] 图3为PET44质粒酶切的电泳图谱；
[0049] M泳道为标准分子量的DNA Marker;
[0050] 第1泳道为PET44质粒；
[0051 ] 第2泳道为PET44质粒与deer-IGF-I基因片段连接后的重组质粒；
[0052] 第3泳道为deer-IGF-I基因片段的PCR引物。
[0053]图4为镍离子柱纯化后的deer-IGF-I蛋白的凝胶蛋白电泳图谱；
[0054] M泳道为标准分子量的蛋白Marker;
[0055] 第1泳道为纯化后的deer-IGF-I蛋白。
【具体实施方式】
[0056]请参阅图1，本发明的发明人为了能更好地对本发明的技术方案进行理解，下面通 过具体地实施例，并结合附图进行详细地说明：
[0057]本发明利用基因重组技术制备马鹿胰岛素样生长因子，即deer-IGF-I，在deer-IGF-I基因片段的上游添加了酶切位点，下游添加了酶切位点和终止密码子，与原核表达载 体，g卩PET44质粒连接，构建了重组质粒。重组质粒在BL21(DEa)大肠杆菌中表达蛋白，重组 质粒进行可溶性融合蛋白的表达。可溶性融合蛋白通过镍离子柱，进行可溶性融合蛋白的 纯化，对纯化后的可溶性融合蛋白进行EK酶切，使可溶性融合蛋白上的Nus蛋白与deer-IGF-I蛋白断裂，Nus蛋白与deer-IGF-I蛋白断裂后得到的deer-IGF-I蛋白再次经过镍离子 柱回收Nus蛋白，得到deer-IGF-I蛋白，再对deer-IGF-I蛋白进行透析除盐和冷冻干燥，最 后通过MTT法检测HeLa细胞培养基中deer-IGF-I蛋白的质量浓度与HeLa细胞增殖速率的函 数关系。
[0058]采用原核表达载体选择PET44质粒，是因为PET44质粒含有一个高度可溶的Nus蛋 白，以非包涵体形式表达，Nus蛋白上的EK酶切位点和凝血酶(Thrombin)位点可以用于后续 的蛋白纯化。此外，PET44质粒上含有6x组氨基酸片段(6x His)，可以吸附到镍离子柱上，对 样品进行洗脱，除去杂蛋白，最终获得deer-IGF-I蛋白。
[0059] 在进一步描述本发明【具体实施方式】之前，应理解本发明的保护范围不局限于下述 特定的具体实施方案;还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实 施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科 学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除非另外说明，本发明中所公开的实 验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构 和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。
[0060] 本发明的一种马鹿胰岛素样生长因子制备方法，包括下列步骤：
[0061 ]序列合成步骤：以马鹿的新鲜的鹿血总RNA，反转录成双链的cDNA，并从双链的 cDNA中进行PCR调取，以调取deer-IGF-I基因片段，同时在deer-IGF-I基因片段的前端添加 Hind III酶切位点，后端添加EcoR I酶切位点和终止密码子，以调取deer-IGF-I基因片段， 调取deer-IGF-I基因片段的PCR引物为：
[0062] deer-IGF-I基因片段的前端PCR引物为：F:CCCA AGCT TATG GGAA AAAT CAGC AGTC TTCC；
[0063] deer-IGF-I基因片段的后端PCR引物为：R:CCGG AATT CCTA CATT CTGT AGTT CTTG TTTC C〇
[0064] deer-IGF-I的cDNA基因片段的序列为： ATGG GAAA AATC AGCA GTCT TCCA ACCC AATT ATTT AAGT GCTG CTTT TGTG ATTT CTTG AAGC AGGT CAAG ATGC CCGT CACA TCCT CCTC GCAT CTCT TCTA CCTG GCCC TGTG CTTG CTCG CCTT CACC AGCT CTGC CACG GCCG GACC CGAG ACCC TCTG CCGG GCTC AGTT GGTG GATG CTCT CCAG TTCG TGTG C(；GA GACA GGGG CTTT TATT
[0065] TCAA CAAG CCCA CGCG GTAC GGCT CGAG CAGT CCGA GGGC GCCC CAGA CGGG AATA GTG(i ATGA GTGC TGCT TCCG GAGC TGTG ATCT GACG AGGC TGGA GATG TACT GCGC CCCT CTCA ACCC CACC AAGG CGGC CCGC TCAG TCCG TGCC CAGC GCCA CACC GACA TGCC CAAG GCTC AGAA CGAA GTAC ATTT GAAG AACA CAAG TAGA GGGA GTTC AGGA AACA AGAA CTAC AGAA TGTAG.
[0066] 重组质粒构建步骤:在PET44质粒上进行EcoR I酶切位点和Hind in酶切位点的 双酶切，在PET44质粒上切下相应基因片段，并对双酶切后的PET44质粒进行纯化，并将在序 列合成步骤中经过酶切的deer-IGF-I基因片段在DNA连接酶的作用下连接入PET44质粒上 对应的位置，完成deer-IGF-I基因片段在PET44质粒上的取代，得到重组质粒。
[0067]转化子扩增步骤:将重组质粒连接体系转化DH5a感受态大肠杆菌，得到转化子，并 扩增转化子。并用氨苄抗性平板筛选扩增后的转化子，从中筛选出单克隆阳性的转化子，再 从单克隆阳性的转化子中提取单克隆阳性的重组质粒，限制性内切酶鉴定单克隆阳性的重 组质粒。
[0068]重组子构建步骤:将单克隆阳性的重组质粒转化入BL21(DEa)大肠杆菌中，得到重 组子。
[0069]蛋白表达诱导步骤:将重组子接种到含有IPTG的LB培养基中进行诱导表达，LB培 养基中，IPTG的浓度lmmol/L。含有IPTG的LB培养基置于的摇瓶中，摇瓶的摇动速率为 250rpm。重组子在含有IPTG的LB培养基进行诱导表达的时间为4~6h，优选为5h。诱导表达 的温度为37 °C。
[0070]破菌步骤:蛋白表达诱导结束后，在转速为6000rpm的离心分离机上，对含有IPTG 的LB培养基进行1 Omin的离心分离，去除离心分离后的上层清液，留下所述重组子的菌体， 再用破菌液分散所述重组子的菌体后，在超声波的作用下对所述重组子的菌体进行破菌， 破菌的时间为30min，超声波的频率为10000Hz~15000Hz。最后将包涵体和溶解在所述破菌 液中可溶性融合蛋白分离，保留溶解在所述破菌液中的可溶性融合蛋白和破菌液，该可溶 性融合蛋白是由deer-IGF-I蛋白和Nus蛋白结合而成的。
[0071 ] 酶切步骤:所述破菌液通过镍离子柱，对所述破菌液中的可溶性融合蛋白进行纯 化，收集镍离子柱洗脱后的一次洗脱液，对一次洗脱液中可溶性融合蛋白用EK酶进行酶切， 使deer-IGF-I蛋白与Nus白分离。酶切的时间为6h，酶切的温度为42 °C。
[0072]纯化步骤:使所述一次洗脱液再次通过镍离子柱，去除其中的Nus蛋白，并收集洗 脱后的二次洗脱液，对所述二次洗脱液进行透析除盐，并通过冷冻干燥对所述二次洗脱液 进行浓缩，最终二次洗脱液中deer-IGF-I蛋白的含量为SSwt.^deer-IGF-I蛋白需要经过 透析除盐，deer-IGF-I蛋白在透析袋中进行透析除盐的，透析袋分子截留量5000Da，外透析 液为超纯水，透析温度为4°C，透析时间为24小时，每隔4小时换一次外透析液。
[0073]检测步骤：用蛋白质凝胶电泳法得到二次洗脱液中的deer-IGF-I蛋白的电泳图 谱，通过MTT法检测HeLa细胞培养基中deer-IGF-I蛋白的质量浓度与HeLa细胞增殖速率的 函数关系，确定deer-IGF-I蛋白的活性。
[0074]与从马鹿的鹿茸中直接提取deer-IGF-I并进行纯化相比，本发明的一种马鹿胰岛 素样生长因子制备方法采用基因工程的方法制备的蛋白数量更大，成本更低;本发明的一 种马鹿胰岛素样生长因子制备方法采用的蛋白的融合表达，增加了蛋白的稳定性，分离方 法简便，便于大规模制备，应用前景广。
[0075] PET32a质粒、BL21 (DEa)大肠杆菌和破菌缓冲液均购自Novagen公司，DH5a感受态 大肠杆菌购自Promega公司，HeLa细胞购自中科院上海典藏细胞库。
[0076] 本技术领域中的普通技术人员应当认识到，以上的实施例仅是用来说明本发明， 而并非用作为对本发明的限定，只要在本发明的实质精神范围内，对以上所述实施例的变 化、变型都将落在本发明的权利要求书范围内。
【主权项】
1. 一种马鹿胰岛素样生长因子制备方法，包括下列步骤： 1) 用deer-IGF-I基因片段和PET44质粒构建重组质粒； 2) 对所述重组质粒进行扩增，并从中筛选出单克隆阳性的重组质粒； 3) 将单克隆阳性的重组质粒转化入BL21(DEa)大肠杆菌中得到重组子，在培养基中通 过所述重组子进行deer-IGF-I蛋白诱导表达； 4) 将所述重组子的菌体从所述培养基中分离，并在破菌液中，对所述重组子的菌体进 行破菌，使deer-IGF-I蛋白以可溶性融合蛋白的表达形式进入所述破菌液； 5) 对所述可溶性融合蛋白进行酶切，使所述可溶性融合蛋白分解为deer-IGF-I蛋白和 Nus蛋白； 6) 对deer-IGF-I蛋白进行纯化、透析除盐和浓缩，得到deer-IGF-I蛋白。2. 根据权利要求1所述的一种马鹿胰岛素样生长因子制备方法，其特征在于:步骤1中， 将马鹿的鹿血组织的总RNA，反转录成双链的cDNA，并通过PCR引物，从所述双链的cDNA 中调取deer-IGF-I基因片段； 调取 deer-IGF-I 基因片段的前端 PCR 引物为：F:CCCA AGCT TATG GGAA AAAT CAGC AGTC TTCC； 调取 deer-IGF-I 基因片段的后端 PCR 引物为：R:CCGG AATT CCTA CATT CTGT AGTT CTTG TTTC C〇3. 根据权利要求2所述的一种马鹿胰岛素样生长因子制备方法，其特征在于： 步骤1包括下列步骤： la) 在deer-IGF-I基因片段的前端添加 Hind ΙΠ 酶切位点，后端添加 EcoR I酶切位点 和终止密码子； lb) 对PET44质粒进行EcoR I酶切位点和Hind III酶切位点的双酶切； lc) 在DNA连接酶的作用下，将deer-IGF-I基因片段与PET44质粒连接，构建所述重组质 粒。4. 根据权利要求1所述的一种马鹿胰岛素样生长因子制备方法，其特征在于：步骤2包 括下列步骤： 2a)将所述重组质粒连接体系转化DH5a感受态大肠杆菌，得到转化子，并扩增所述转化 子； 2b)采用氨苄抗性平板筛选扩增后的转化子，从中筛选出单克隆阳性的转化子； 2c)从单克隆阳性的转化子中提取单克隆阳性的重组质粒。5. 根据权利要求1所述的一种马鹿胰岛素样生长因子制备方法，其特征在于：步骤3中 所述重组子对于deer-IGF-I蛋白的诱导表达是在含有IPTG的LB培养基中进行的。6. 根据权利要求1所述的一种马鹿胰岛素样生长因子制备方法，其特征在于：步骤4包 括下列步骤： 4a)通过离心分离机对所述培养基进行离心分离，去除离心分离后的上层清液，留下所 述重组子的菌体； 4b)用破菌液分散所述重组子的菌体，在超声波的作用下对所述重组子的菌体进行破 菌，保留破菌后溶解在所述破菌液中可溶性融合蛋白，该可溶性融合蛋白是由deer-IGF-I 蛋白和Nus蛋白结合而成的。7. 根据权利要求6所述的一种马鹿胰岛素样生长因子制备方法，其特征在于：步骤5包 括下列步骤： 5a)使所述破菌液通过镍离子柱，对所述破菌液中的可溶性融合蛋白进行纯化，收集镍 离子柱洗脱后的一次洗脱液； 5b)对所述一次洗脱液中可溶性融合蛋白用EK酶进行酶切，使deer-IGF-I蛋白与Nus蛋 白分离。8. 根据权利要求7所述的一种马鹿胰岛素样生长因子制备方法，其特征在于：步骤6包 括下列步骤： 6a)使所述一次洗脱液再次通过镍离子柱，去除其中的Nus蛋白； 6b)收集二次洗脱液，对所述二次洗脱液进行透析除盐； 6c)通过冷冻干燥对所述二次洗脱液进行浓缩，最终得到deer-IGF-I蛋白。9. 根据权利要求1所述的一种马鹿胰岛素样生长因子制备方法，其特征在于：用蛋白质 凝胶电泳法检测步骤6中得到的deer-IGF-I蛋白的电泳图谱。10. 根据权利要求1所述的一种马鹿胰岛素样生长因子制备方法，其特征在于:通过MTT 法，用HeLa细胞检测deer-IGF-I蛋白的活性。
【文档编号】C07K14/65GK105821069SQ201610325337
【公开日】2016年8月3日
【申请日】2016年5月16日
【发明人】宋平, 王瑜, 陈建兵
【申请人】上海蓝庄生物医药科技有限公司