一种梅花鹿胰岛素样生长因子真核表达纯化方法
【专利摘要】本发明公开了一种梅花鹿胰岛素样生长因子真核表达方法，包括下列步骤：1)将deer?IGF?Ⅰ基因片段克隆入pPIC9k质粒，构建重组质粒；2)对所述重组质粒进行扩增，并从中筛选出阳性的重组质粒；3)用SalⅠ酶对阳性的重组质粒进行酶切线性化，并将酶切线性化后的阳性的重组质粒电转化入巴斯德毕赤酵母GS115，得到阳性重组子；4)在BMGY培养基中通过甲醇对所述阳性重组子进行诱导表达，使所述阳性重组子诱导表达可溶于BMGY培养基的deer?IGF?Ⅰ蛋白；5)从BMGY培养基分离出deer?IGF?Ⅰ蛋白。其技术效果是：纯化方法简便，无需进行蛋白的变性复性，蛋白的结构更稳定，经济效益更高，便于大规模制备，应用前景广。
【专利说明】
一种梅花鹿胰岛素样生长因子真核表达纯化方法
技术领域
[0001] 本发明涉及生物工程领域的一种梅花鹿胰岛素样生长因子真核表达纯化方法。
【背景技术】
[0002] IGF(insulin_like growth factors)，中文翻译为胰岛素样生长因子或类胰岛素 生长因子，因其结构与胰岛素类似而得名；也被称为〃生长激素介质〃（即SM， somatomedins)。是生长激素产生生理作用过程中必需的一种活性蛋白多肽物质。现在已知 的胰岛素样生长有IGF-I和IGF-II两种。生长激素的生理作用包括促进生长，且对于糖、脂、 蛋白质代谢和无机盐代谢必不可少。
[0003] 已知的IGF-I是一种活性蛋白多肽物质，它是人体内肝细胞、肾细胞、脾细胞等十 几种细胞自分泌和旁分泌的产物，也就是说人体内本身就含有IGF-I。其具体功能如下：
[0004] 降血糖:在这方面IGF-I与胰岛素相似，能增强人体对葡萄糖和氨基酸的吸收，促 进糖原的合成和乳酸分泌，抑制糖原分解，增加人体对胰岛素灵敏度的功能，提高人体胰岛 素的作用效率。对胰岛素非依赖型糖尿病，即II型糖尿病具有较好的疗效。
[0005] 降血脂：IGF_I作用于脂肪细胞能促进脂肪分解和糖原合成，降低血中总甘油三 酯、降低密度脂蛋白甘油三酯和低密度脂蛋白胆固醇的水平。
[0006] 舒张血管：IGF-I能调节心脏的生理和病理状况，具有舒张血管，降低血管阻力，增 加心脏的血流量的作用。
[0007] 促进骨的合成代谢保持其正常结构功能：IGF_I可明显地促进多种来源的软骨细 胞分裂增殖和软骨基质的合成。IGF-I还可刺激软骨细胞合成软骨基质特异型胶原蛋白-II 型胶原，增加糖胺聚酶的活性，增强成骨细胞的碱性磷酸酯酶的活性。
[0008] 促生长:IGF-I是人体内非常重要的细胞有丝分裂促进剂。
[0009] 促细胞分化：IGF-I对维持与细胞分化有关蛋白质水平十分重要，与一些生长因子 合用能促进细胞分化成熟。
[0010]创伤修复：IGF-I还参与创伤愈合的过程。实验证明，损伤的神经、肌肉和肉皮细胞 中IGF-I浓度增加。
[0011]由于马鹿的鹿茸中含有大量的活性多肽，具有广泛的药用价值，多肽中最具价值 的是马鹿胰岛素生长因子，即deer-IGF-I，但是鹿茸每年只能收集一次，并且deer-IGF-I在 鹿茸中的含量比较低，因此需要一种马鹿胰岛素样生长因子表达纯化工艺，简化鹿胰岛素 生长因子的纯化工艺，降低成本，以克服鹿茸收集次数少，其中deer-IGF-I的含量技术问 题。
【发明内容】
[0012]本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种梅花鹿IGF-I蛋白真核表达 方法，其纯化方法简便，无需进行蛋白的变性复性，蛋白经过磷酸化，糖基化修饰可使蛋白 活性更强，蛋白的结构更稳定，经济效益更高；分离方法简便，便于大规模制备，应用前景 广。
[0013] 实现上述目的的的一种技术方案是：一种梅花鹿胰岛素样生长因子真核表达方 法，包括下列步骤：
[0014] 1)将deer-IGF-I基因片段克隆入pPIC9k质粒，构建重组质粒；
[0015] 2)对所述重组质粒进行扩增，并从中筛选出阳性的重组质粒；
[0016] 3)用Sal頂每对阳性的重组质粒进行酶切线性化，并将酶切线性化后的阳性的重 组质粒电转化入巴斯德毕赤酵母GS115,得到阳性重组子；
[0017] 4)在BMGY培养基中通过甲醇对所述阳性重组子进行诱导表达，使所述阳性重组子 诱导表达可溶于BMGY培养基的deer-IGF-I蛋白；
[0018] 5)从BMGY培养基分离出deer-IGF-I蛋白。
[0019] 进一步的，步骤1包括下列步骤：
[0020] la.通过PCR引物在deer-IGF-I基因片段的上游引入EcoR I酶切位点和HIS标签蛋 白，下游引入Not頂每切位点和终止密码子；
[0021] lb.在pPIC9k质粒上进行EcoR頂每切位点和Not頂每切位点上的双酶切；
[0022] lc.将deer-IGF-I基因片段克隆入pPIC9k质粒，构建重组质粒。
[0023]再进一步的，步骤1中，
[0024] EcoR I酶切位点引入的PCR引物为F:CCGG AATT CATG CATC ATCA CCAT CACC ATGG AAAA ATCA GCAG TCTT CC,
[0025] Not I酶切位点引入的PCR引物为R:ATAA GAAT CTAC ATTC TGTA GTTC TTGT TTCC〇
[0026] 再进一步的，步骤2包括下列步骤：
[0027] 2a.将所述重组质粒转入体系转化DH5a感受态大肠杆菌，得到转化子；
[0028] 2b.对所述转化子进行扩增；
[0029] 2c.用氨苄抗性平板筛选扩增后的转化子，从中选取阳性的转化子，再从阳性的转 化子中提取阳性的重组质粒。
[0030]再进一步的，步骤3中利用HIS缺陷平板筛，筛选阳性重组子。
[0031]再进一步的，步骤4中的BMGY培养基分为培养用BMGY培养基和诱导表达用BMGY培 养基，步骤4分为下列步骤：
[0032] 4a.在培养用BMGY培养基中培养所述阳性重组子直至培养用BMGY培养基的0D600 值达到8~10;所述培养用BMGY培养基的温度为27~30°C，振动速率为250rpm;
[0033] 4b.将培养用BMGY培养基中的阳性重组子接种到诱导表达用BMGY培养基中，所述 诱导表达用BMGY培养基中的阳性重组子的接种量为每毫升10D，再分次将甲醇加入所述诱 导表达用BMGY培养基中，对所述阳性重组子进行deer-IGF-I蛋白的诱导表达。
[0034]更进一步的，步骤4b中，在48小时内，分次将甲醇加入所述诱导表达用BMGY培养基 中，对所述阳性重组子进行deer-IGF-I蛋白的诱导表达，补加甲醇的频率为12小时一次，每 次补加甲醇后，所述诱导表达用BMGY培养基中的甲醇的浓度为0.5vol. %。
[0035] 进一步的，步骤5包括下列步骤：
[0036] 5a.对所述诱导表达用BMGY培养基进行离心分离，收集上层清液；
[0037] 5b.对所述上层清进行超滤浓缩；
[0038] 5c.再使经过浓缩的上层清液通过镍离子柱，以进行deer-IGF-I蛋白的纯化和杂 蛋白的去除，收集含有deer-IGF-I蛋白的洗脱液；
[0039] 5d.对所述洗脱液进行透析除盐；
[0040] 5e.对透析除盐后的洗脱液进行低温超滤浓缩，得到deer-IGF-I蛋白。
[0041 ] 进一步的，通过MTT法，用MCF-7细胞检测deer-IGF-I蛋白的活性。
[0042]本发明的一种梅花鹿IGF-I蛋白真核表达方法的技术方案，包括下列步骤：1)将 deer-IGF-I基因片段克隆入pPIC9k质粒，构建重组质粒;2)对所述重组质粒进行扩增，并从 中筛选出阳性的重组质粒;3)用Sal I酶对阳性的重组质粒进行酶切线性化，并将酶切线性 化后的阳性的重组质粒电转化入巴斯德毕赤酵母GS115,得到阳性重组子;4)在BMGY培养基 中通过甲醇对所述阳性重组子进行诱导表达，使所述阳性重组子诱导表达可溶于BMGY培养 基的deer-IGF-I蛋白；5)从BMGY培养基分离出deer-IGF-I蛋白。其技术效果是：纯化方法简 便，无需进行蛋白的变性复性，蛋白经过磷酸化，糖基化修饰可使蛋白活性更强，蛋白的结 构更稳定，经济效益更高;分离方法简便，便于大规模制备，应用前景广。
【附图说明】
[0043] 图1为PIC9k质粒载体物理图谱。
[0044] 图2为pPIC9K质粒酶切的电泳图谱；
[0045] Μ泳道为标准分子量的DNA Marker;
[0046] 第1泳道为pPIC9K质粒；
[0047] 第2泳道为pPIC9k质粒与deer-IGF-I基因片段连接后的重组质粒；
[0048] 第3泳道为deer-IGF-I基因片段的PCR引物。
[0049]图3为镍离子柱纯化后的deer-IGF-I蛋白的凝胶蛋白电泳图谱；
[0050] Μ泳道为标准分子量的蛋白Marker;
[0051 ] 第1泳道为纯化后的deer-IGF-I蛋白。
【具体实施方式】
[0052]请参阅图1，本发明的发明人为了能更好地对本发明的技术方案进行理解，下面通 过具体地实施例，并结合附图进行详细地说明：
[0053]本发明利用基因重组技术制备梅花鹿重组胰岛素样生长因子-I，即deer-IGF-I， 在deer-IGF-I基因片段的上游添加了酶切位点和HIS标签蛋白，下游添加了酶切位点和终 止密码子，再与真核表达载体pPIC9k质粒构建了重组质粒。重组质粒在巴斯德毕赤酵母 GS115中表达蛋白，pPIC9k重组质粒以可溶性蛋白的方式表达deer-IGF-I蛋白，并通过镍离 子柱进行deer-IGF-I蛋白的纯化，促进deer-IGF-I蛋白的正确折叠变成具有活性的deer- IGF-I蛋白，通过MTT法检测MCF-7细胞培养基中deer-IGF-I蛋白的质量浓度与MCF-7细胞增 殖速率之间的函数关系。
[0054] 本发明在deer-IGF-I基因片段的基因序列中引入EcoR I酶切位点、Not頂每切位 点和HIS标签蛋白，与pPIC9k质粒上的XcoR I酶切位点和Not I酶切位点一致。pPIC9k质粒、 巴斯德毕赤酵母GS115均购自Novagen公司，DH5a感受态大肠杆菌，购自Promega公司，MCF-7 细胞购自中科院上海典藏细胞库。
[0055] 在进一步描述本发明【具体实施方式】之前，应理解本发明的保护范围不局限于下述 特定的具体实施方案;还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实 施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科 学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除非另外说明，本发明中所公开的实 验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构 和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。
[0056] 本发明一种梅花鹿胰岛素样生长因子真核表达纯化方法，包括下列步骤：
[0057] 基因调取步骤:根据deer-IGF-I cDNA序列设计引物。在设计过程中遵循PCR引物 设计原则，从梅花鹿cDNA文库中调取deer-IGF-I基因片段，增加位于deer-IGF-I基因片段 上游的，即位于deer-IGF-I基因片段的pi段上的EcoR頂每切位点，以及位于deer-IGF-I基 因片段下游，即位于deer-IGF-I基因片段的P4段5'端上的Not I酶切位点。EcoR I酶切位点 引入的PCR引物为F:CCGG AATT CATG CATC ATCA CCAT CACC ATGG AAAA ATCA GCAG TCTT CC，Not 頂每切位点引入的PCR引物为R:ATAA GAAT CTAC ATTC TGTA GTTC TTGT TTCC。
[0058] deer-IGF-I的cDNA基因片段的序列为： ATGG GAAA AATC AGCA GTCT TCCA ACCC AATT ATTT AAGT GCTG CTTT TGTG ATTT CTTG AAGC AGGT GAaG ATGC CCGT CACA TCCT CCTC GCAT CTCT TCTA CCTG GCCC TGTG CTTG CTCG CCTT CACC AGCT CTGC CACG GCGG GACC CGaG ACCC TCTG CGGG GCTG AGTT GOTO GATG CTCT CCAG TTCG TGTG CGGA GACA GGGG CTTT TA'TT
[0059] TCAA CAAG CCCA CGGG GTAC GGCT CGAG CAGT CGGA GGGC GCCC CAGA CGGG AATA GTGG ATCA GTGC TGCT TCCG GAGC TGTG ATCT GMG AGGC TGGA GATG TACT G(:GC GCCT CTCA AGCC CACt AA(;-G CGGC CCGC TCAG TCCG TGCC CAGC GCCA CACC GACA TGCC CAAG GCTG AGAA GGAA GTAC ATTT 6AAG AAGA CAAG TAGA (；GGA GTTG AGO A AACA A(；AA CTAC AGAA TGTAG.
[0060] 重组质粒构建步骤:在pPIC9k质粒上进行EcoR頂每切位点和Not頂每切位点上的 双酶切，在pPIC9k质粒上切下相应基因片段，对双酶切后的在pPIC9k质粒进行纯化，并将在 序列合成步骤中deer-IGF-I基因片段在DNA连接酶的作用下克隆入双酶切后的pPIC9k质粒 上对应的位置，完成deer-IGF-I基因片段在PIC9k质粒上的取代，得到重组质粒。
[0061] 转化子扩增步骤:将重组质粒连接体系转化DH5a感受态大肠杆菌，得到转化子，并 扩增转化子，并用氨苄抗性平板，从扩增后的转化子中选取阳性的转化子，再从所述阳性的 转化子中提取阳性的重组质粒，限制性内切酶鉴定阳性的重组质粒。
[0062]重组子构建步骤:将经过鉴定的阳性的重组质粒用Sal I酶进行酶切线性化，并将 酶切线性化的阳性的重组质粒电转化入巴斯德毕赤酵母GS115,得到阳性重组子，利用HIS 缺陷平板筛筛选阳性重组子，即HIS+重组子，利用阳性重组子在MD平板上生长的状况，对筛 选后的阳性重组子的表型进行鉴定。
[0063] 重组子培养步骤:所述阳性重组子在培养用BMGY培养基中培养12~18h，，使培养 用BMGY培养基的0D600值最终达到8~10。所述阳性重组子是置于摇瓶中培养的，培养的温 度为27~30°C，摇瓶的振动频率为250rpm。
[0064] 蛋白表达诱导步骤:将经过培养的阳性重组子接种到诱导表达用BMGY培养基中， 诱导表达用BMGY培养基置于1L的摇瓶中，每个摇瓶中阳性重组子的接种量为每毫升10D，摇 瓶的振动速率为250rpm，接种阳性重组子后使诱导表达用BMGY培养基的0D600值达到1。再 用甲醇对于阳性重组子进行deer-IGF-I蛋白的诱导表达，时间为48小时，每隔12小时在诱 导表达用BMGY培养基补加一次甲醇，每次补加甲醇后，诱导表达用BMGY培养基中的甲醇的 浓度均为〇.5vol. %。甲醇为无水甲醇。
[0065]离心分离步骤:蛋白表达诱导步骤结束后，在转速为5000rpm的离心分离机上，对 诱导表达用BMGY培养基进行lOmin的离心分离，收集离心分离后的上层清液，以从中分离 deer-IGF-I蛋白。
[0066]超滤浓缩步骤:将上层清液用超滤杯进行超滤浓缩，滤膜的截留尺寸为5000Da。 [0067] 纯化步骤:再使经过超滤浓缩的上层清液通过镍离子柱，以进行deer-IGF-I蛋白 的纯化和杂蛋白的去除，得到含有deer-IGF-I蛋白的洗脱液。
[0068] 透析除盐步骤:对纯化后含有deer-IGF-I的洗脱液透析，deer-IGF-I蛋白在透析 袋中进行透析除盐的，透析袋截留分子量为5000Da，外透析液为超纯水，透析温度为4°C，透 析时间为2 4小时，每隔4小时换一次外透析液。
[0069] 浓缩步骤：通过低温超滤浓缩对经过透析除盐后的洗脱液进行浓缩，得到deer- IGF-I蛋白。
[0070] 检测步骤:用蛋白质凝胶电泳法得到deer-IGF-I蛋白的电泳图谱，通过MTT法检测 MCF-7细胞培养基中deer-IGF-I蛋白的质量浓度与MCF-7细胞增殖速率之间的函数关系。
[0071] 毕赤酵母作为一种新型外源基因表达系统，具有高表达、高稳性、高分泌的特点， 其宿主菌巴斯德毕赤酵母GS115自身蛋白分泌量少，下游分离纯化操作易行，能大规模生 产，是一种适合表达外源基因的真核表达系统。因此deer-IGF-I基因片段通过酶切连接入 pPIC9k质粒上，得到重组质粒，再将重组质粒转化入体系转化DH5a感受态大肠杆菌，扩增重 组质粒，从中筛选出阳性的重组质粒进行酶切线性化后，电转化巴斯德毕赤酵母GS115,通 过甲醇进行deer-IGF-I蛋白诱导表达。deer-IGF-I蛋白上含有HIS标签。
[0072]与从鹿的体内提取deer-IGF-I蛋白再进行纯化相比，采用巴斯德毕赤酵母GS115 进行真核表达，deer-IGF-I蛋白分泌到BMGY培养基中，纯化方法简便，无需进行deer-IGF-I 蛋白的变性复性，deer-IGF-I蛋白可通过磷酸化，糖基化修饰，增强活性，deer-IGF-I蛋白 结构更稳定，经济效益更高;分离方法简便，便于大规模制备，应用前景广。
[0073]本技术领域中的普通技术人员应当认识到，以上的实施例仅是用来说明本发明， 而并非用作为对本发明的限定，只要在本发明的实质精神范围内，对以上所述实施例的变 化、变型都将落在本发明的权利要求书范围内。
【主权项】
1. 一种梅花鹿胰岛素样生长因子真核表达方法，包括下列步骤： 1) 将deer-IGF-I基因片段克隆入pPIC9k质粒，构建重组质粒； 2) 对所述重组质粒进行扩增，并从中筛选出阳性的重组质粒； 3) 用Sal頂每对阳性的重组质粒进行酶切线性化，并将酶切线性化后的阳性的重组质 粒电转化入巴斯德毕赤酵母GS115,得到阳性重组子； 4) 在BMGY培养基中通过甲醇对所述阳性重组子进行诱导表达，使所述阳性重组子诱导 表达可溶于BMGY培养基的deer-IGF-I蛋白； 5) 从BMGY培养基分离出deer-IGF-I蛋白。2. 根据权利要求1所述的一种梅花鹿胰岛素样生长因子真核表达方法，其特征在于:步 骤1包括下列步骤： la. 通过PCR引物在deer-IGF-I基因片段的上游引入EcoR頂每切位点和HIS标签蛋白， 下游引入Not頂每切位点和终止密码子； lb. 在pPIC9k质粒上进行EcoR I酶切位点和Not I酶切位点上的双酶切； lc. 将deer-IGF-I基因片段克隆入pPIC9k质粒，构建重组质粒。3. 根据权利要求2所述的一种梅花鹿胰岛素样生长因子真核表达方法，其特征在于:步 骤1中， EcoR 頂每切位点引入的PCR引物为F:CCGG AATT CATG CATC ATCA CCAT CACC ATGG AAAA ATCA GCAG TCTT CC, Not I酶切位点引入的PCR引物为R:ATAA GAAT CTAC ATTC TGTA GTTC TTGT TTCC。4. 根据权利要求2所述的一种梅花鹿胰岛素样生长因子真核表达方法，其特征在于:步 骤2包括下列步骤： 2a.将所述重组质粒转入体系转化DH5a感受态大肠杆菌，得到转化子； 2b.对所述转化子进行扩增； 2c.用氨苄抗性平板筛选扩增后的转化子，从中选取阳性的转化子，再从阳性的转化子 中提取阳性的重组质粒。5. 根据权利要求4所述的一种梅花鹿胰岛素样生长因子真核表达方法，其特征在于:步 骤3中利用HIS缺陷平板筛，筛选阳性的转化子。6. 根据权利要求2所述的一种梅花鹿胰岛素样生长因子真核表达方法，其特征在于:步 骤4中的BMGY培养基分为培养用BMGY培养基和诱导表达用BMGY培养基，步骤4分为下列步 骤： 4a.在培养用BMGY培养基中培养所述阳性重组子直至培养用BMGY培养基的0D600值达 到8~10;所述培养用BMGY培养基的温度为27~30°C，振动速率为250rpm; 4b.将培养用BMGY培养基中的阳性重组子接种到诱导表达用BMGY培养基中，所述诱导 表达用BMGY培养基中的阳性重组子的接种量为每毫升10D，再分次将甲醇加入所述诱导表 达用BMGY培养基中，对所述阳性重组子进行deer-IGF-I蛋白的诱导表达。7. 根据权利要求6所述的一种梅花鹿胰岛素样生长因子真核表达方法，其特征在于： 步骤4b中，在48小时内，分次将甲醇加入所述诱导表达用BMGY培养基中，对所述阳性重 组子进行deer-IGF-I蛋白的诱导表达，补加甲醇的频率为12小时一次，每次补加甲醇后，所 述诱导表达用BMGY培养基中的甲醇的浓度为0.5vol. %。8. 根据权利要求2所述的一种梅花鹿胰岛素样生长因子真核表达方法，其特征在于:步 骤5包括下列步骤： 5a.对所述诱导表达用BMGY培养基进行离心分离，收集上层清液； 5b.对所述上层清进行超滤浓缩； 5c .再使经过浓缩的上层清液通过镍离子柱，以进行deer-IGF-I蛋白的纯化和杂蛋白 的去除，收集含有deer-IGF-I蛋白的洗脱液； 5d.对所述洗脱液进行透析除盐； 5e.对透析除盐后的洗脱液进行低温超滤浓缩，得到deer-IGF-I蛋白。9. 根据权利要求2所述的一种梅花鹿胰岛素样生长因子真核表达方法，其特征在于:通 过MTT法，用MCF-7细胞检测deer-IGF-I蛋白的活性。
【文档编号】C07K1/34GK105838732SQ201610322353
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2016年5月16日
【发明人】陈建兵, 王瑜, 党平
【申请人】上海蓝庄生物医药科技有限公司