刺激和增强保护性免疫反应和il-12产生的化合物和方法

专利名称：刺激和增强保护性免疫反应和il-12产生的化合物和方法
技术领域：
一般来说，本发明涉及用于在患者及在分离的细胞和细胞培养物中刺激免疫反应和用于评价Leishmania感染之患者的化合物和方法。更具体地说，本发明涉及及包含与真核起始因子4A(eIF4A)同源的Leishmania braziliensis抗原(LbeIF4A)之全部或部分的化合物，并涉及该化合物在刺激Th1免疫反应中的应用。
本发明的背景Leishmania是巨噬细胞的专性细胞内原生动物寄生虫，它引起一系列的人类疾病，包括自体愈合性皮肤损伤，弥散性皮肤和粘膜表现形式以及严重的内脏疾病。在过去20年中，利什曼病例数显著增大，每年大约诊断出2万新病例。现在在全世界存在许许多多的病例，主要在巴西，中国，东非，印度和中东地区。该疾病在地中海区域也是一种地方性流行病，包括法国南部，意大利，希腊、西班牙，葡萄牙和北非。
感染人类的Leishmania有20种。在这些种类中，Leishmaniabraziliensis通常引起局部皮肤的利什曼病(CL)。患有CL的患者具有强烈的迟后型超敏反应(DTH)且在发作和治愈疾病的过程中对Leishmania抗原具有体外增殖反应。大多数患有CL的病人自发治愈。然而，在一些感染的患者中，产生发作性皮肤疾病或粘膜利什曼病(ML)，其特征在于鼻，口和/或咽粘膜出现严重和进行性破坏。
对于成功的治疗而言利什曼病的早期诊断可能是关键的，但这难以实现，因为该疾病没有明显的迹象或症状。已使用了寄生虫检测法，但这类方法不灵敏或不实用。目前的血清学试验(例如，使用ELISA或免疫荧光技术)典型地使用整体或裂解的寄生虫，但一般不灵敏且证明与其它许多疾病发生交叉反应。另外，这类方法通常不能足够早地检测潜在的致命性疾病以允许进行有效治疗，因为它们依赖于存在于疾病急性期的抗体的检测。
在发作性粘膜疾病的例子中，对Leishmania抗原的皮内皮肤试验和淋巴细胞增殖反应异常强。事实上，与粘膜损伤相联系的组织破坏可能部分地是对Leishmania抗原的超敏反应造成的。然而，对Leishmania之细胞介导的免疫反应中所涉及的特异性抗原尚未得到表征。
因此，在本领域中需要表征免疫反应中所涉及的Leishmania抗原，确定它们在疾病表现形式中的作用。还需要鉴定用于评价该疾病早期的患者和用于治疗利什曼疾病的改进的方法。本发明满足了这些需要并进一步提供了其它有关优势。
本发明的简述简单地说，本发明提供了涉及Leishmania抗原LbeIF4A的化合物和方法、LbeIF4A与真核核糖体蛋白质eIF4A具有同源性。在本发明的一个方面，提从了包含编码LbeIF4A或其部分或其它变异体之DNA序列的DNA分子。该DNA序列选自(a)SEQ ID NO1的核苷酸115至1323；(b)在严格条件下与SEQ ID NO1核苷酸115至1323之互补核苷酸序列杂交的DNA序列，其中DNA序列编码在从Leishmania感染的个体获得的外周血单核细胞中刺激Th1免疫反应的多肽；和(c)编码一种多肽的DNA，该多肽由任意上述DNA序列编码。
在相关的方面中，本发明提供了包含上述DNA分子的重组表达载体，用该表达载体转化或转染的宿主细胞和制备由上述DNA分子编码之多肽的方法，包含在启动表达的条件下培养转化或转染的宿主细胞并回收多肽。还提供了包含由上述DNA分子编码的氨基酸序列或SEQ ID NO2氨基酸49-403的纯化的多肽(或其区别仅在于保守取代和/或修饰的变异体)。另外，公开了特异性地结合该多肽的单克隆抗体。
在另一方面，本发明提供了评价患者产生免疫反应的能力的方法，包含将从患者获得的生物学样品与本文所述的多肽接触并测量该细胞的反应。生物学样品可包含外周血液单核细胞，单核细胞，B细胞，树枝状细胞，巨噬细胞或其组合。所测量的反应可以是(1)增殖反应；(2)一种或多种细胞因子，如干扰素-γ，白细胞介素-2，白细胞介素-12p70，白细胞介素-12p40亚基，白细胞介素-1或肿瘤坏死因子-α的分泌；或(3)编码一种或多种细胞因子，如干扰素γ，白细胞介素2，白细胞介素12p40亚基，白细胞介素，或肿瘤坏死因子α之mRNA的表达。
还有另一方面，提供了用于增强患者对抗原的细胞和/或体液免疫应答的方法，包含给患者施用本文所述的多肽和抗原。多肽的用药可与异源性抗原制品结合，或与其它Leishmania抗原结合。在一个相关方面，本发明提供了用于在患者中刺激结合Leishmania寄生虫的抗体产生的方法，包含给患者施用本文所述的多肽。
在另一方面，提供了在患者中刺激Th1免疫反应，IL-12生产和/或下调白细胞介素-10表达的方法，包含给患者施用本文所述的多肽。在有关方面，提供了在生物学样品中刺激Th1免疫反应，IL-12生产，和/或下调白细胞介素-10表达的方法，包含将生物学样品与本文所述的多肽接触。生物学样品可包含外周血单核细胞，单核细胞，B细胞，树枝状细胞，巨噬细胞或其组合。
在另一方面，本发明提供了测定用于制备疫苗组合物之抗原适宜性的方法，包含测定抗原是否能刺激从未感染Leishmania的个体获得的诸如外周血单核细胞或巨噬细胞之类的细胞生产白细胞介素-12。
在其它方面中，还提供了包含本文所述的多肽和一种生理上可接受的载体的药用组合物以及包含本文所述多肽和一种抗原的疫苗。
还有另外一方面，提供了治疗患有与IL-12刺激反应的疾病的患者之方法，包含给患者施用本文所述的多肽。
参考下面详细描述和附图，本发明的这些和其它方面将是显而易见的。本文公开的全部参考文献以其全文编入以供参考，与单独分别编入一样。
附图的简要描述

图1表示Leishmania spp.DNA Southern印迹分析的结果，显示了Leishmania eIF4A同源性是保守的且L·braziliensis基因组DNA含至少2个LbeIF4A拷贝。
图2显示了免疫印迹分析的结果，表明LbeIF4A免疫兔血清与不同Leishmania种类～45KDa大小的一种主要蛋白质种类反应。
图3表明了纯化的重组LbeIF4A刺激L·braziliensis感染的个体PBMC增殖的能力。
图4A和4B代表经分析具有证实为L·braziliensis感染的病人PBMC之细胞因子mRNA表达方式所获得的结果。
图5显示了用LbeIF4A或寄生虫溶胞产物刺激后L·braziliensis感染的个体PBMC分泌的IFN-γ的上清水平。
图6显示了用LbeIF4A或寄生虫溶胞产物刺激后L·braziliensis感染的个体PBMC上清中检测到的TNF-α水平。
图7A-7D显示了LbeIF4A也刺激患者PBMC在培养上清中分泌IL-12，且在数量上明显高于经寄生虫溶胞产物刺激的IL-12水平，且显示了IL-10抑制这种IL-12的产生。
图8A和8B显示了在所有试验的患者PBMC中，IFN-γ产生是IL-12依赖型且受IL-10抑制。
图9A和9B显示了在培养的人巨噬细胞和贴壁PBMC中LbeIF4A刺激IL-12产生。
图10显示了在人髓样白血病细胞系THP-1中LbeIF4A刺激IL-12产生且与IFN-γ协同刺激THP-1细胞分泌IL-12。
图11提供的结果表明用LbeIF4A致敏的小鼠淋巴结细胞增殖并分泌几乎唯一的Th1细胞因子分布型。而用另一重组L·braziliensis抗原(8E)致敏的小鼠淋巴结细胞取决于所用的佐剂产生Th0或Th1/Th2型细胞因子分布型，而用寄生虫溶胞产物致敏的小鼠产生混合的细胞因子分布型。
图12表明在认为与人疾病有关的动物模型中LbeIF4A对L.major感染提供明显的保护。
本发明的详细描述如上所述，本发明涉及在评价患者及刺激和增强在患者及分离的细胞和细胞培养物之免疫应答中有用的化合物和方法。本发明的化合物一般包括在外周血单核细胞(PBMC)中刺激Th1免疫反应的多肽或编码该多肽的DNA序列。具体地说，公开了包含Leishmaniabraziliensis同源的真核核糖体蛋白质eIF4A全部或刺激部分的多肽(本文称为LbeIF4A)。本文所用的术语“PBMC”指存在于外周血中的核细胞制品。在本发明说明书中的术语“多肽”包含任意长度的氨基酸链，包括全长蛋白质和其部分，其中氨基酸残基由共价肽键连接。因此，“LbeIF4A多肽”包含LbeIF4A或其保留刺激活性的部分或其它变异体。优选的是，该多肽基本上不含污染的内源材料。还公开了该多肽用于评价患者免疫反应和用于刺激和增强各种免疫反应的用途。
本发明的多肽包括保留在PBMC中刺激Th1免疫反应之能力的LbeIF4A变异体。这类变异体包括前面蛋白质的各种结构形式。例如，由于可离子化的氨基和羧基存在，LbeIF4A多肽可以是酸性或碱性盐的形式，或可以是中性形式。单个的氨基酸残基也可以经氧化或还原修饰。
本发明范围内的变异体还包括LbeIF4A一级氨基酸结构或其片段经过与其它多肽或诸如糖基，脂，磷酸，乙酰基和类似的化学基团形成共价键或聚集连接物而修饰的多肽。例如经过将特定的功能基团与氨基酸侧链或N或C端连接可制备共价衍生物。作为选择，对于多肽连接到LbeIF4A多肽上的衍生物，可使用如下所述的重组DNA制备融合蛋白质。在一个这类实施方案中，LbeIF4A多肽可在该蛋白质的N端区域连接到信号(或先导)多肽序列上，经共同翻译或翻译后指导该蛋白质从其合成位点转移到细胞膜或壁内部或外部的其功能位点处(例如，酵母α-因子先导序列)。
本发明的融合蛋白还可包含为利于LbeIF4A多肽纯化或鉴定而加上的肽(例如，多聚His)。例如，Hoppetal.，Bio/Techno1ogy 61204(1988)所述的肽是高抗原性肽，可用于帮助鉴定。这种肽提供了经特异性单克隆抗体可逆结合的抗原决定基，能迅速测定并利于表达的重组蛋白质纯化。Hopp等的序列也能被牛粘膜肠激酶特异性地裂解，允许从纯化蛋白质上去掉该肽。前面加上该肽的融合蛋白质还可抵抗大肠杆菌细胞内降解。
例如，本发明包含的融合蛋白质进一步包括与免疫球蛋白Fc区域连接的LbeIF4A多肽。如果用抗体重链和轻链制备LbeIF4A融合蛋白质，可形成具有4个LbeIF4A蛋白质区域的蛋白质寡聚体。在本发明范围内的还有与亮氨酸拉链区连接的LbeIF4A多肽。亮氨酸拉链区的描述，例如可见公开的PCT申请WO94/10308。例如，包含亮氨酸拉链的LbeIF4A多肽可以是寡聚体，二聚体或三聚体。所有上面融合蛋白质可经过化学链或作为融合蛋白质制备，如下面所述。
本发明还包括具有或不具有与天然型糖基化相关的LbeIF4A多肽。在酵母或哺乳动物表达系统中表达的多肽取决于表达系统可以在分子量和糖基化型式上与天然分子相似或稍有不同。例如，在诸如大肠杆菌的细菌中编码LbeIF4A多肽的DNA的表达产生未糖基化的分子。真核蛋白质的N-糖基化位点特征为氨基酸三联体Asn-A1-Z，其中A1是除Pro外的任意氨基酸，Z是Ser或Thr。具有灭活的N-糖基化位点的LbeIF4A多肽的变异体可用本领域的普通技术人员已知的技术来生产，如寡核苷酸合成和连接或位点特异性诱变技术，这些都在本发明的范围内。作为选择，N-连接的糖基化位点可加到LbeIF4A多肽上。
本发明的多肽也包括由于一个或多个缺失，插入、取代或其它修饰具有不同于天然LbeIF4A蛋白质的氨基酸序列的LbeIF4A多肽变异体。这类变异体应与天然LbeIF4A基本上同源并应保留在PBMC中刺激Th1免疫反应的能力。本文所用的“基本上同源”指氨基酸序列可被在中等严格条件下能与天然存在的编码LbeIF4A的DNA序列杂交的DNA序列编码。合适的中等严格条件包括在5xSSC，0.5％SDS，1.0mMEDTA(pH8.0)溶液中预洗涤；在50℃-65℃，5xSSC下杂交过夜，接着在65℃洗涤2次20分钟，每次用含0.1％SDS的2x，0.5x和0.2xSSC)。这种杂交DNA序列也在本发明的范围内，与由于密码简并，编码刺激多肽的核苷酸序列一样，该刺激多肽由杂交DNA序列编码。使用(例如)任何本文所述的方法，经过分析突变的LbeIF4A多肽诱导Th1反应的能力易于测定任何这类修饰对LbeIF4A多肽活性的影响。
一般来说，应进行保守性氨基酸取代，即取代氨基酸应替换具有相似特性的氨基酸，以便肽化学领域的技术人员可预期多肽的二级结构和亲水性质基本上不改变。一般来说，下面氨基酸基团代表保守性改变(1)ala，pro，gly，glu，asp，g1n，asn，ser，thr；(2)cys，ser，tyr，thr；(3)Val，ile，leu，met，ala，phe；(4)lys，arg，his；(5)phe，tyr，trp，his。或作为选择，本发明范围内的变异体还可含有其它修饰，包括氨基酸的缺失或增加，这类修饰应对多肽的刺激特性，二级结构和亲水性质影响最小。一般来说，LbeIF4A片段可经过缺失末端或内部残基或序列来构建。对于合适修饰的其它指导可经过比较LbeIF4A的序列与其它eIF4A家族成员的序列和结构来获得。例如，可缺失为生物学活性所不需要的LbeIF4A的末端或内部残基或序列。可缺失或用其它氨基酸替换半胱氨酸残基以防止因复性形成错误的分子内二硫桥键。诱变的其它方法涉及相邻双碱性氨基酸残基的修饰以增强在存在KEX2蛋白酶活性的酵母系统中的表达。
一般可使用基因组成编码蛋白质的cDNA克隆获得LbeIF4A全长蛋白质。编码全长LbeIF4A的基因组序列在SEQ ID NO1中表示，推断的氨基酸序列在SEQ ID NO2中提供。可经过筛选合适的Leishmania braziliensis表达文库以获得表达与患有粘膜利什曼病的患者血清反应的抗原，然后分析该反应性抗原在患者T细胞试验中刺激增殖反应和优先产生Th1细胞因子的能力来分离这类克隆。该文库的制备和筛选一般可使用本领域的普通技术人员已知的方法进行，如在Sambrook et al.，Molecular CloningA Laboratory Manu-al，Cold Spring Harbor Laboratories，Cold，Spring Harbor，N.Y.，1989中描述的方法，本文引用以供参考。简单地说，可平板培养噬菌体表达文库并转移到滤膜上。然后将滤膜与血清和检测试剂保温。在本发明的说明书中，“检测试剂”是能与抗体-抗原复合物结合的任意化合物，它能以本领域的普通技术人员已知的任何方法检测。典型的检测试剂含有一种“结合剂”，如蛋白质A，蛋白质G，IgG或植物凝血素，它与报道基团偶联。优选的报道基团包括酶，底物，辅助因子、抑制剂、染料，放射性核素，发光基团，荧光基团和生物素。更优选的是，报道基团是辣根过氧化物酶，它可以经过与诸如四甲基联苯胺或2，2′-连氮-双-3-乙基苯并噻唑啉磺酸的底物保温来检测。以本领域的普通技术人员已知的技术分离和纯化含有表达与血清中抗体结合的蛋白质的基因组或cDNA序列的噬菌斑。例如，可在Sambrook et al.，Molecular CloningA Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratories，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989中发现合适的方法。
一般可经过用反应性抗原处理患者PBMC并分析细胞的合适反应进行患者T细胞试验。例如，可测定PBMC上清中分泌的细胞因子水平。优选的是，测定的细胞因子是干扰素-γ，白细胞介素-2；白细胞介素-12(p40亚基或生物学活性p70)，白细胞介素-1或肿瘤坏死因子-α。例如，使用以商业途径得到的对目的细胞因子特异性的抗体以ELISA形式测定细胞因子，根据厂家说明书测定为阳性结果。例如，可从Chemicon，Temucula，CA和PharMingen，SanDiego，CA获得合适的抗体。作为选择，可测定处理的PBMC编码一种或多种细胞因子干扰素-γ，白细胞介素-2，白细胞介素-12p40亚基，白细胞介素-1或肿瘤坏死因子-α的mRNA，或按本文所述测定PBMC的增殖反应。
在PBMC中保留刺激Th1免疫反应之能力的LbeIF4A变异体可经过修饰在上述一个或多个方面的序列并测定所得多肽刺激Th1反应的能力来鉴定。这类测定一般可经过用修饰的多肽处理患者PBMC并测定反应来进行，如上所述。
上述序列修饰可使用标准重组技术或经过修饰的多肽的自动合成来导入。例如，可经过合成含突变序列的寡核苷酸，在侧翼加上利于与天然序列片段连接的限制性位点在特定的位置导入突变。连接后，所得的重组序列编码具有所述氨基酸插入、取代或缺失的类似物。
作为选择，可使用位点特异性核苷酸诱变程序提供根据所需取代，缺失或插入改变特定密码子的基因。上面阐述的进行改变的方法例子由Walder et al.，Gene 42133，1986；Bauer et al.，Gene 3773，1985；Craik，BioTechniques，January 1985，12-19；Smith et al.，Genetic Engineering；Principles and Methods，Plenum Press，1981；和U.S.Patent Nos.4,518,584和4,737,462公开。
当然，在为表达该LbeIF4A多肽而构建的核苷酸序列中的突变必须保存编码序列的阅读框，优选不产生能杂交产生二级mRNA结构(如环或发夹)，对受体mRNA翻译有不利影响的互补区域。尽管可预测突变位点，但预测突变本身的性质是不必要的。例如，为了在给定位点选择突变的最佳特征，可在靶密码子处进行随机诱变并针对所需活性筛选表达的IbeIF4A蛋白质突变体。
在编码LbeIF4A蛋白质的核苷酸序列中并不是有突变都在终产物中表达。例如，可进行核苷酸取代以增强表达，主要是避免在转录的mRNA中的二级结构环(例如，见欧洲专利申请75，444A)，或提供更易于被选定宿主翻译的密码子，如大肠杆菌表达的熟知的大肠杆菌优选密码子本发明的多肽(天然存在的和修饰的)优选经过重组DNA方法产生。该方法包括将编码LbeIF4A多肽的DNA序列插入重组表达载体中并在启动表达的条件下在重组微生物表达系统中表达DNA序列。编码由本发明提供的多肽的DNA序列可从cDNA片段和短寡核苷酸连接子或从一系列寡核苷酸装配以提供能插入重组表达载体中的合成基团并在重组转录单位中表达。
重组表达载体含有有效连接到来自哺乳动物，微生物，病毒或昆虫基因的合适的转录或翻译调节元件上的编码LbeIF4A多肽的DNA序列。这类调节元件包括转录启动子，任选控制转录的操纵子序列，编码合适的mRNA核糖体结合位点的序列和控制转录和翻译终止的序列，如下面的详细描述。另外可插入复制起点和利于转化子识别的选择性标记。
当它们在功能上互相相关时DNA区域有效连接。例如，信号肽(分泌先导序列)DNA与多肽DNA有效连接的条件是它作为参与多肽分泌的前体表达；启动子与编码序列有效连接的条件是它控制该序列的转录；或核糖体结合位点与编码序列有效连接的条件是它被定位以便能翻译。一般来说，有效连接指(在分泌先导序列的情况下)在阅读框中连续。编码在微生物中表达的LbeIF4A多肽的DNA序列优选不含可能在成熟前终止DNA转录成mRNA的内含子。
细胞使用的表达载体可包含可选择的标记和来自包含熟知的克隆载体pBR322(ATCC 37017)遗传元件的商业上可得到的质粒的复制起点。例如，这种商业载体包括pKK223-3(Pharmacia FineChemicals，Uppsala，Sweden)和pGEM1(Promega Biotee，Madison，WI，USA)。这些pBR322“骨架”部分与合适的启动子和所要表达的结构序列组合。典型地使用pBR322衍生物，一种来自大肠杆菌种类的质粒(Bolivar et al.，Gene 295，1977)转化大肠杆菌。pBR322含氨苄青霉素和四环素抗性基因，因此提供了鉴定转化细胞的简单手段。
通常用于重组微生物表达载体的启动子包括β-内酰胺酶(青霉素酶)和乳糖启动子系统(chang et al.，Nature 275615，1978；和Goeddelet al.，Nature 281544，1979)，色氨酸(trp)启动子系统(Goeddel et al.，Nucl.Acids Res.84057，1980；和欧洲专利申请36，776)和tac启动子(Maniatis，Molecular CloningA Laboratory Manu-al，Cold Spring Harbor Laboratory，p.412，1982)。特别有用的细菌表达系统使用噬菌体1PL启动子和cI857ts热不稳定性阻遏蛋白。能从美国典型培养物收集中心获得的插入1PL启动子衍生物的质粒载体包括质粒pHUB2(存在于大肠杆菌菌株JMB9(ATCC37092)中)和pPLc28(存在于大肠杆菌RR1(ATCC53082)中)。
在酵母载体中合适的启动子序列包括用于金属硫蛋白，3-磷酸甘油酸激酶(Hitzeman et al.，J.Biol，Chem.2552073，1980)或其它糖酵解酶(Hess et al.，I.Adv.Enzyme Reg.7149，1968；和Hollandetal.，Biochem.174900，1978)，如烯醇化酶，甘油醛-3-磷酸脱氢酶，己糖激酶，丙酮酸脱羧酶，果糖磷酸激酶，葡萄醣-6-磷酸异构酶，3-磷酸甘油酸变位酶，丙酮酸激酶，丙糖磷酸异构酶，磷酸葡萄糖异构酶和葡糖激酶的启动子。用于酵母表达的合适的载体和启动子在R.Hitzeman等的欧洲专利申请73，657中有进一步的描述。
使用来自pBR322的在大肠杆菌中选择和复制的DNA序列(Ampγ基因和复制起点)和包括葡萄糖-抑制的ADHZ启动子和α-因子分泌先导序列的酵母DNA序列装配优选的酵母载体。AD-HZ启动子已在Russell et al.，J.Biol.Chem.2582674，1982和Beieret al.，Nature 300724，1982中描述。指导异源性蛋白质分泌的酵母α-因子先导序列可插到启动子和要表达的结构基因间。例如，见Kurian et al.，Cell 30933，1982；和Bitter et al.，Proc，Natl.Acad.Sci.USA 815330,1984。先导序列可在靠近其3′端修饰成含有一个或多个有用的限制性位点以利于先导序列与外源基因融合。用于转化脊椎动物细胞的表达载体转录和翻译控制序列可由病毒来源提供。例如，常用的启动子和增强子来源于多瘤病毒，腺病毒2，猴病毒40(SV40)和人巨细胞病毒。来自SV40病毒基因组，如SV40起点，早期和晚期启动子，增强子，剪接和多聚腺苷酸化位点的DNA序列可用于提供表达异源DNA序列所需的其它遗传元件。早期和晚期启动子特别有用，因为它们易于从病毒获得，作为还含有SV40病毒复制起点(Fiers et al.，Nature 273113，1978)的片段。也可使用更小或更大的SV40片段，只要包括位于病毒复制起点从HindIII位点到BglII位点的大约250bp的序列。另外，可使用病毒基因组启动子，控制和/或信号序列，只要该控制序列与选择的宿主细胞相匹配。典型的载体可如Okayama and Berg.Mol.Cell.Biol.3280，1983所公开的方法。
可基本上按Cosman et al.，Mol.Immunol.23935，1986所述构建在C127鼠类哺乳动物上皮细胞中稳定高水平表达哺乳动物受体cDNA的有用的系统。用于表达LbeIF4A蛋白质DNA的优选的真核载体是pDC406(McMahan et al.，EMBOJ.102821，1991)，且包括来自SV40，人免疫缺陷病毒(HIV)和Epstein-Barr病毒(EBV)的调节序列。其它优选的载体包括pDC409和pDC410，它们来自pDC406。pDC410经过用编码SV40大型T抗原的序列取代EBV复制起点由pDC406产生。pDC409与pDC406的区别在于缺失了多克隆位点外侧的BglII限制性位点，使在多克隆位点内的BglII位点是唯一的。
允许诸如pDC406和pDC409的含有EBV复制起点的表达载体附加型复制的有用细系是CV-1/EBNA(ATCC CRL 10478)。CV-L/EBNA细胞系经过用编码Epstein-Barr病毒核抗原-I(EBNA-1)且在结构上表达来自人CMV立即早期增强子/启动子的EBNA-1的基因转换CV-1细胞系产生。
转化的宿主细胞是以使用重组DNA技术构建的含有编码本发明的LbeIF4A多肽之序列的表达载体转化或转染的细胞。转化的宿主细胞可表达所需的LbeIF4A多肽，但为克隆或扩增LbeIF4ADNA转化的宿主细胞不必表达LbeIF4A蛋白质。根据选定的DNA，表达的LbeIF4A蛋白质优选分泌进培养物上清，但也可贮存于细胞膜中。
表达重组蛋白质的合适的宿主细胞包括在合适的启动子控制下的原核生物，酵母或高等真核细胞。原核生物包括革兰氏阴性或革兰氏阴性生物，例如大肠杆菌或芽孢杆菌。高等真核细胞包括下面描述的昆虫或哺乳动物来源的建立的细胞系。使用来自本文公开的DNA构建体的RNA也可用无细胞翻译系统生产LbeIF4A蛋白质。描述了用于细胞，真菌，酵母和哺乳动物细胞宿主的合适的克隆和表达载体，例如，见Pouwels et al.，Cloning VectorsA Laboratory Man-ual，Elsevier，New York，1985。
原核表达宿主可用于表达不需广泛蛋白水解和二硫键加工的LbeIF4A多肽。原核表达载体一般包括一个或多个表型可选择的标记(例如，编码赋予抗生素抗性或提供自养需要之蛋白质的基因)和一个被宿主识别以保证在宿主内扩增的复制起点。用于转化的合适的原核宿主包括大肠杆菌(E.coli)，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，鼠伤寒沙门氏菌(Salmonelta typhimurium)和假单胞菌，链霉菌，葡萄球菌属的不同种，尽管也可使用其它宿主。
重组LbeIF4A多肽也可在酵母宿主中表达，优选从酵母菌种如酿酒酵母(S.cerevisiae)中表达。也可使用其它属，如毕赤酵母属或克鲁维酵母属的酵母。酵母载体一般含有2μ酵母质粒的复制起点或自主复制序列(AR)，启动子，编码LbeIF4A多肽的DNA，用于多腺苷化和转录终止的序列及一个选择基因。优选的是，酵母载体包括一个复制起点和允许酵母和大肠杆菌转化的可选择性标记(例如大肠杆菌的氨苄青霉素抗性基因和酿酒酵母trp1基因，它为在色氨酸中缺乏生长能力的酵母突变株提供选择标记)和一个来自高水平表达的酵母基因以诱导下游结构序列转录的启动子。酵母宿主细胞基因组中trp1损伤的存在为经过在无色氨酸情况下生长检测转化提供了有效环境。
合适的宿母转化方案是本领域的技术人员已知的。由Hindetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 751927，1978描述的技术例子涉及在由0.67％酵母氮基质，0.5％ 酪蛋白氨基酸，2％葡萄糖，10mg/ml腺嘌呤和20mg/ml尿嘧啶组成的选择性培养基中选择Trp+转化子。用包含ADH2启动子的载体转化的宿主菌株可在由1％酵母提取物，2％蛋白胨，含80mg/ml腺嘌呤和80mg/ml尿嘧啶的1％葡萄糖组成的富集培养基中生长进行表达。由于培养基葡萄糖耗尽发生ADH2启动子的去阻遏。经过滤收获得粗制的酵母上清液并在进一步纯化前放置于4℃。
也可使用各种哺乳动物或昆虫(例如，灰翅夜蛾属或粉夜蛾属)细胞培养系统来表达重组蛋白质。用于在昆虫细胞中生产异源性蛋白质的杆状病毒系统的综述(例如)可见Luckow and Summers，Bio/Technology 647，1988。合适的哺乳动物宿主细胞系的例子包括猴肾细胞cos-7细胞系(在Gluzman，Cell 23175，1981中描述)和能表达合适载体的其它细胞系，例如，包括CV-1/EBNA(ATCC CRL10478)，L细胞，C127，3T3，中国仓鼠卵巢(CHO)，COS，NS-1，Hela和BHK细胞系。哺乳动物表达载体可包括不转录的元件，如复制起点，连接到所表达的基因上的合适的启动子和增强子和其它5′或3侧翼不转录序列，和5′或3′不翻译序列，如必需的核糖体结合位点，多腺苷酸化位点，剪接供体和受体位点和转录终止序列。
可经过培养合适的宿主/载体系统以表达本发明DNA的重组翻译产物，然后从培养基或细胞提取物中纯化来制备纯化的LbeIF4A多肽。例如，可使用商业上可获得的蛋白浓缩滤器，如Amicon或Millipore Pellicon超滤单位首先浓缩来自将重组蛋白质分泌进培养基之系统的上清液。浓缩步骤后，可将浓缩物上样到合适的纯化基质上。例如，合适的亲和基质可包括一种反结构蛋白质(即根据结构与LbeIF4A以特异性相互作用结合的蛋白质)或植物凝血素或结合到合适支持物上的抗体分子。作为选择，可使用阴离子交换树脂，例如，一种具有下垂的二乙氨乙基(DEAE)基团的基质或底物。基质可以是丙烯酰胺，琼脂糖，葡聚糖，纤维素或常用于蛋白质纯化的其它类型。作为选择，可使用阳离子交换步骤。合适的阳离子交换剂包括各种不溶性基质，包含磺丙基或羧甲基。优选磺丙基。凝胶过滤色谱也提供了一种纯化LbeIF4A的方法。
亲和色谱是特别优选的纯化LbeIF4A多肽的方法，例如，以包含免疫球蛋白Fc区之融合蛋白表达的LbeIF4A多肽可使用蛋白质A或蛋白质G亲和色谱纯化。而且，包含亮氨酸拉链区的LbeIF4A蛋白质可在包含对亮氨酸拉链区特异性的抗体的树脂上纯化。经过使用本领域熟知的方法抗LbeIF4A蛋白质的单克隆抗体在亲和色谱纯化中也是有用的。
最后，使用疏水RP-HPLC培养基(例如，具有下垂的甲基或其它脂肪族基团的硅胶)的一个或多个反相高效液相色谱(RP-HPLC)步骤可用于进一步纯化LbeIF4A蛋白质组合物。以各种组合的一些或全部上述纯化步骤也可用于提供同源重组蛋白质。
在细菌培养物中产生的重组LbeIF4A多肽优选经过开始从细胞沉淀中提取，接着经过一步或多步浓缩，盐拆，含水离子交换或大小排阻色谱步骤分离。高效液相色谱(HPLC)可用于最终纯化步骤。用于重组LbeIF4A蛋白质表达的微生物细胞可经过任何常规方法，包括冻融循环，声处理，机械破碎或使用细胞裂解试剂来破碎。
以分泌的蛋白质表达LbeIF4A多肽的酵母发酵极大地简化了纯化。由大批量发酵分泌的重组蛋白质可用Urdal et al.，J.Chro-matog，296171，1984所公开的相似的方法纯化。该参考文献描述了在制备HPLC柱上纯化重组人GM-CSF的2个连续的反相HPLC步骤。
在重组培养物中合成的LbeIF4A多肽的制品可含有非LbeIF4A细胞成份，包括蛋白质，其量和特征取决于从培养物中回收LbeIF4A蛋白质所用的纯化步骤。这些成份一般来源于酵母，原核细胞或非人类真核细胞且优选以无害污染量存在，其数量不超过重量的大约1％。这类制品典型地不含其它蛋白质，而这类蛋白质正常情况下与LbeIF4A蛋白质相联系，正如实际上在其来源种类中所发现的。
自动合成提供了制备具有少于大约100个氨基酸，典型的是少于大约50个氨基酸的本发明的多肽的可供选择的方法。例如，可使用Merrifietd固相合成方法，其中氨基酸依次加到延长的氨基酸链上。见Merrifield，J.Am.Chem.Soc.852149-2146，1963。多肽自动合成的装置可从诸如Applied Biosystems，Inc.of Foster City，CA的供应商以商业形式买到。
除了上面多肽和DNA序列外，本发明进一步提供了使用上面所公开的多肽评价免疫反应和刺激保护性免疫反应和IL-12产生的方法。在本发明内发现LbeIF4A含有T细胞抗原决定基(簇)，它刺激Leishmania感染的个体的PBMC增殖。LbeIF4A还刺激感染个体的PBMC产生Th1细胞因子分布型。Th1反应的特征在于产生细胞因子白细胞介素-1(IL-1)，白细胞介素-2(IL-2)，白细胞介素-12(IL-12)或干扰素-γ(IFN-γ)，以及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)。IL-12是包含p40和p35亚基的杂二聚体分子，它必须共同表达产生生物活性IL-12p70。p40亚基仅由产生IL-12的细胞产生并且在细菌和寄生虫刺激后在体外和体内诱导产生；而p35亚基普遍存在且以结构表达。因此，产生IL-12的细胞也具有大量超额(10-100倍)的无生物学活性的游离p40链。
LbeIF4A也刺激Leishmania感染的患者PBMC中诸如编码IFN-γ，IL-1，IL-2，IL-12p40亚基和TNF-α的mRNA的Th1细胞因子分布型。表明Th2反应的无可检测到的IL-4或IL-10mRNA存在于这类刺激的PBMC中。事实上，LbeIF4A一般下调存在于一些利什曼患者“静止”的PBMC中的IL-10mRNA的表达和患者及正常PBMC LPS诱导的IL-10产生。LbeIF4A的这些特性表明LbeIF4A在L·braziliensis感染后的保护性免疫反应中起作用。
另外，LbeIF4A刺激未感染的对照个体PBMC中以及培养的人巨噬细胞，人髓样白血病细胞系THP-1和小鼠中IL-12和IL-2的产生。LbeIF4A还与IFN-γ协同刺激THP-1细胞分泌IL-12，患者PBMC对IFN-γ产生的诱导因存在抗IL-12抗体而取消。刺激IL-12和IL-2产生的能力表明LbeIF4A具有诱导保护性免疫反应的能力，本文所述的多肽在预防和治疗诸如癌症以及感染性疾病中具有广泛的应用性。
因此，在本发明的一个方面，公开了评价患者产生免疫应答总能力的方法。本文所用的术语“患者”指任何热血动物，优选人类。患者可能患有一种疾病，如利什曼病(或其它感染性疾病)或癌症，或可以是正常的(即，无可检测的疾病和感染)。一般来说，由于患者PBMC接触LbeIF4A多肽诱导的增殖或Th1相关性反应水平是患者产生免疫反应能力的指征。
简单地说，评价患者产生免疫反应的能力可经过将可能感染或未感染的患者PBMC与本发明的多肽接触，测量细胞合适的反应来进行。用于该目的的PBMC可经过本领域已知的方法分离，包括用通过(例如)FicollTM(Winthrop Laboratories，New York)的密度离心。一般来说，是以评价大约104-106个细胞的多肽量范围从大约1μg/到大约50μg/ml，优选大约10μg/ml。多肽与PBMC温育典型地在37℃进行大约5天。与多肽一起温育后，测定PBMC的合适的反应。例如，测量的反应可以是增殖反应，它可用本领域的普通技术人员已知的方法来评价，例如将细胞与放射标记的肠腺嘧啶脉冲接触并测量标记进入细胞DNA的掺入量。一般情况下，刺激指数(即用抗原刺激的细胞平均cpm除以无抗原的细胞平均cpm)大于或等于5的增殖反应表明个体产生免疫反应的能力下降。作为选择，测量的反应可以是上述一种或多种特定细胞因子(如IFN-γ，IL-2，IL-12p70，IL-12p40亚基，IL-1和TNF-α)的分泌，或编码一种或多种特定细胞因子(如IFN-γ，IL-2，IL-12p40亚基，IL-1和TNF-α)的mRNA的水平，正如用本领域的普通技术人员所熟知的技术(可能包括聚合酶链反应(PCR)的扩增)进行的测定。这种细胞因子分泌或mRNA表达的高水平与产生免疫反应的高能力相对应。一般来说，如果在用LbeIF4A多肽处理的PBMC中不能检测到(用本文公开的方法)IL-12或编码IL-12的mRNA，患者产生免疫反应的能力就低。
在另一方面，本发明提供了在PBMC和分离成份细胞(包括，但不限于巨噬细胞，单核细胞，B细胞和树枝状细胞)中刺激免疫反应的方法。为了刺激这类细胞，可用本领域的技术人员熟知的任何各种技术(如Ficoll-hypaque密度离心)分离该细胞，并以足够的量与LbeIF4A多肽接触足够的时间以产生免疫反应，如上所述。可以(但不必)从患有利什曼病或其它疾病的患者中分离根据本发明处理的细胞，并可再导入治疗后的患者中。对于从Leishmania感染的个体获得的细胞，可产生的免疫反应包括优选的Th1免疫反应(包括IL-12产生的刺激)和IL-10表达的下调。对于未感染的个体的细胞，免疫反应可能是IL-12的产生。
在有关方面，本发明提供了在患者(包括人类)中刺激或增强免疫反应的方法。在一个实施方案中，LbeIF4A多肽可用作免疫调节剂以增强对不同抗原的细胞和/或体液免疫应答。经过将LbeIF4A多肽与不同的特异性抗原结合施用给患者，可增强患者对抗原的免疫反应。在该方面，LbeIF4A多肽可在相同制品(例如疫苗)内作为抗原施用，或可单独施用。然而，一般来说，抗原和LbeIF4A多肽在同时和相同位点施用。以这种方式，LbeIF4A多肽可用作(例如)异源剂疫苗制品中的佐剂。用药的合适的剂量和方法在下面详细提供。
LbeIF4A多肽也可单独或与其它Leishmania抗原一起施用给Leishmania感染的个体以刺激结合Leishmania寄生虫的抗体的产生。发现在通常被认为合理地预测人类和其它动物对Leishmania种类反应的模型中用LbeIF4A免疫小鼠导致对L·braziliensis的保护性免疫反应，证实了LbeIF4A作为疫苗的实用性。例如，本发明的多肽可施用给患有慢性皮肤利什曼病的患者以刺激有疗效的免疫反应。
在另一实施方案中，本文公开的多肽可施用给患者以产生免疫反应。对于Leishmania感染的个体，可产生的免疫反应包括优选的Th1免疫反应(包括刺激IL-12的产生)和下调IL-10表达。对于未感染的个体，免疫反应可能是IL-12和/或IL-2的产生，或γ-T细胞的刺激。用药的合适剂量的方法如下所述。
本发明还有一个方面，可将一种或多种LbeIF4A多肽施用给患有与白细胞介素12刺激反应性疾病的患者。这类疾病包括感染(例如，可以是细菌，病毒或原生动物感染)或诸如癌症的疾病。一般来说，特定疾病与IL-12刺激的反应性可经过评价用LbeIF4A多肽治疗对免疫临床相关物的影响。例如，如果治疗导致Th1反应变高或Th2转变成Th1并伴随着治疗的患者之临床改善，则该疾病经IL-12刺激后好转。多肽的用药可以按下面所述，或可根据适应症延长更长的时间。
在上述方面，其中LbeIF4A多肽用于刺激或增强患者的免疫反应，多肽优选配成药用组合物或疫苗。药用组合物一般包含一种或多种LbeIF4A多肽与生理上可接受的载体，赋形剂或稀释剂结合。这类载体在所用剂量和浓度下对接受者应是无毒的。疫苗包含一种或多种LbeIF4A多肽和一种或多种适于适应症的其它抗原。还期望使用LbeIF4A蛋白质与可溶性细胞因子受体或细胞因子结合。
用药途径和频率及多肽剂量根据个体不同而变化并且可与通常用于其它感染之免疫或治疗相似。一般来说，药用组合物和疫苗可经过注射(例如，肌肉内，静脉内或皮下)，鼻内(例如，经过吸入)或口服用药。
当然，用药的量和频率取决于诸如所治疗的适应症的性质和严重性，所需反应，患者的状态等等因素。典型地是，在2-6周期限内施用1至4个剂量。优选的是施用两个剂量，第二次剂量比第一次晚2-4周。合适的剂量是在患者中刺激IL-12产生的LbeIF4A多肽量，使在从患者分离的PBMC上清中IL-12的量为每ml 10ng到10μg。一般来说，IL-12量的测定可使用本领域普通技术人员已知的任何合适的试验，包括本文所述的试验。存在于剂量中的LbeIF4A多肽的量典型地每kg宿主从大约1pg到大约100mg，典型地从大约10pg到大约1mg，优选大约100pg到大约1μg。合适的剂量大小随动物大小而变化，但典型地是对于10-60kg动物从大约0.01ml到大约5ml变化。特定适应症的具体合适剂量可易于测定。
尽管本领域的普通技术人员已知的任何合适的载体可用于本发明的药用组合物，但载体类型根据用药方式和是否需要缓释用药而变化。对于肠胃外用药，如皮下注射，载体优选包含水，盐水，乙醇，脂肪，蜡或缓冲液。为了口服用药，可使用任何上面的载体或固体载体，如甘露醇，乳糖，淀粉，硬脂酸镁，糖精钠，滑石，纤维素，葡萄糖，蔗糖和碳酸镁。可被生物降解的微球体(例如polylactic galactide)也可用作本发明的药用组合物的载体。例如，合适的可被生物降解的微球体在美国专利号4897268和5075109中公开。
药用组合物和疫苗也可含有诸如缓冲液的稀释剂，诸如抗坏血酸的抗氧化剂，低分子量(小于大约10个残基)多肽，蛋白质，氨基酸。包括葡萄糖，蔗糖或粗精的碳水化合物，诸如EDTA的螯合剂，谷胱甘肽和其它稳定剂和赋形剂。中性缓冲盐水或与非特异性血清白蛋白混合的盐水是合适的稀释剂的例子。优选的是，产品使用合适的赋形剂溶液(例如，蔗糖)作为稀释剂配成冻干制品。
除了LbeIF4A多肽外，任何各种佐剂可用于本发明的疫苗或药用组合物以非特异性地增强免疫反应。大多数佐剂含有设计成保护抗原防止迅速分解代谢的物质，如氢氧化铝或矿物油，免疫反应的非特异性刺激剂，如脂A，百日咳博德特氏菌或结核分枝杆菌。这类佐剂在商业上可获得，例如，弗氏不完全佐剂和完全佐剂(Difco Labo-ratonies，Detroit，MI)和Merck佐剂65(Merck和Company，Inc.，Rahway，NJ)。
在本发明的另一方面，提供了测定给定抗原刺激保护性免疫反应之能力的方法。LbeIF4A刺激白细胞介素-12产生的能力与感染的患者和从感染的患者分离的PBMC中的保护性Th1反应的进展相关。因此，测定选定抗原是否能刺激IL-12，IFN-γ和/或IL-2产生提供了用于疫苗形成的迅速的可重复的筛选方法。能诱发Th1反应的抗原(正如使用上述在正常外周血单核细胞中刺激γT细胞，IL-12和/或IL-2产生所证实的)一般适用于制备疫苗。
LbeIF4A蛋白质衍生物也可用作免疫测定中的免疫原，试剂或作为亲和纯化程序中的结合剂。用于测定或纯化目的的LbeIF4A多肽可结合到固态支持物上。可使用本领域已知的各种技术将多肽结合到支持物上，这些技术在专利和科技文献中有广泛的描述。在本发明这一方面的说明书中，术语“结合”指非共价缔合(如吸附)和共价连接(可以是抗原和功能基团在支持物上直接连接或可以是以交联剂方式连接)。优选经吸附结合到微滴定板上或结合到膜上。在这类情况下，吸附可以经过将多肽(在合适的缓冲液中)与固态支持物接触适量时间来实现。接触时间随温度而变化，但典型地是在大约1小时和1天之间。一般来说，将塑料微滴定板(如聚苯乙烯或聚氯乙烯)的孔与范围为大约10ng到大约1μg，优选大约250ng的多肽量接触足以结合足够量的抗原。
可使用各种技术将多肽共价结合到固态支持物上。例如，可使用交联剂实现结合，如m-顺丁烯二酰亚胺苯甲酰琥珀酰亚胺酯和N-羟基珀酰亚胺，它们在半胱氨酸和赖氨酸残基处共价结合到多肽上。LbeIF4A多肽也可通过反应性侧基共价结合到各种不溶性底物(如溴化氰激活的，双环氧乙烷激活的，羰基二咪唑激活的或甲苯磺酸基激活的琼脂结构)上或经吸附结合到聚烯烃表面(有或没有戊二醛交联)。
一旦结合到底物上，LbeIF4A多肽可用于结合LbeIF4A蛋白质之抗体的试验。合适的试验包括酶联免疫吸附试验(ELISA)。这类试验的进行可首先将固定在固态支持物(通常是微滴定板孔)上的多肽抗原与含抗体的样品接触以便样品内抗多肽的抗体能结合到固定的多肽上。然后从固定的多肽上去掉未结合的样品并加入能结合固相抗体-多肽复合物的检测试剂。然后使用适合于特定检测试剂的方法测定仍结合于固态支持物上的检测试剂的量。
固相多肽还可用于纯化结合LbeIF4A多肽的抗体。这类抗体可用本领域的普通技术人员已知的任意各种技术来制备。例如，见Harlow和Land，AntibodiesA Laboratory Manual，Cold Spring，Har-bor Laboratory，1988。在一个这类技术中，包含多肽的免疫原开始注射进任何各种各样的哺乳动物(例如小鼠，大鼠，兔，绵羊和山羊)中。在这一步骤中，本发明的多肽可不经修饰用作免疫原。作为选择，特别是对于相当短的多肽，如果多肽与诸如牛血清白蛋白或锁眼帽贝血蓝蛋白的载体连接可诱发高水平的免疫反应。免疫原注射进动物宿主，优选根据预定的程度掺入一次或多次加强免疫，动物定期抽血。然后从该抗血清纯化出对多肽特异性的多克隆抗体，例如，经过使用与合适的固态支持物偶联的多肽进行亲和层析。
可制备对目的多肽特异性的单克隆抗体，例如，使用Kohlwrand Milstein，Eur.J.Immunol.6511-519，1976的技术及其改进方法。简单地说，这些方法涉及制备能产生具有所需特异性(即，与目的多肽的反应性)之抗体的无限增殖细胞系。这类细胞系可从例如上述免疫的动物获得的脾细胞产生。然后经过例如与骨髓瘤细胞融合伙伴优选的是与免疫动物协同作用者融合使脾细胞无限增殖。可使用各种融合技术。例如，脾细胞和骨髓瘤细胞可与非离子去污剂合并几分钟，然后以低密度涂布在选择性培养基上使杂交细胞而不是骨髓瘤细胞生长。优选的选择技术使用HAT(次黄嘌呤，氨基蝶呤，胸腺嘧啶)选择。经过足够的一段时间后，通常是大约1到2周后，获得杂交体集落。选择单个集落并试验对多肽的结合能力。优选具有高反应性和特异性的杂交瘤。
单克隆抗体可从生长的杂交瘤集落上清中分离。另外，可使用各种技术提高产率，例如，将杂交瘤细胞系注射进合适的脊椎动物宿主(如小鼠)的腹腔。然后可从腹水液或血液收获单克隆抗体。可经过常规技术，如色谱，凝胶过滤，沉淀和提取从抗体中去掉污染物。本发明的多肽可用于纯化方法中，例如亲和层析步骤中。
可使用结合本发明多肽的单一特异性抗体(例如)检测生物学样品中Leishmania感染，其中使用任一种免疫测定法，它可以是直接的或竞争性的。简单地说，在一种直接测定方法中，可将单一特异性抗体固定在固态支持物(如上所述)上并与待测样品接触。去掉来结合的样品后，可加入用报道基团标记的第二单一特异性抗体并用于检测结合的抗原，在一个竞争试验例子中，样品可与用合适的报道基团标记的单克隆或多克隆抗体结合。然后，样品和抗体混合物可与固定在合适固态支持物上的多肽抗原结合。使未结合样品中抗原的抗体与固定化抗原结合，去掉剩余的样品和抗体。结合到固态支持物上的抗体水平与样品中抗原水平反相关。因此，结合到固态支持物上的抗体水平较低表明在样品中存在Leishmania。使用单一特异性抗体检测样品中Leishmania的其它方法对本领域的普通技术人员是显而易见的，上面方法仅作为举例目的提供。
下面的实施例以举例的方式而不是限制的方式提供。本领域的技术人员将认识到可对实施例体现的本发明进行变化，特别是在本文引证的各种参考文献的教导下可达到这一目的。
实施例实施例1编码LbeIF4A的DNA的制备本实施例描述了编码L·braziliensis核糖体抗原LbeIF4A的DNA序列的分子克隆。
用L·braziliensis(MHOM/BR/75/M2903)的剪切的DNA在噬菌体λZAPII(Stratagene，La Jolla，CA)中构建基因组表达文库。用来自L·braziliensis感染的具有粘膜利什曼病的个体的大肠杆菌预吸附的患者血清筛选表达文库。纯化含免疫反应性重组抗原的噬菌体，使用厂家的方案剪切pBSK(一)噬菌粒。用核酸外切酶III进行嵌套缺失产生用于单链模板制备和测序的重叠缺失。按厂家(Stratagene，La Jolla，CA)建议用VCSM13辅助噬菌体感染后分离单链模板并用双脱氧链终止法或使用Applied Biosystems AutomatedSequencer Model373A经Taq染料终止子系统测序。
然后在患者T细胞试验中分析免疫反应性重组抗原刺激增殖反应(如下面实施例5所述)和主要Th1细胞因子分布型(如下面实施例7所述)的能力。
在上面试验中鉴定重组克隆，经过将其推测的氨基酸序列与其它蛋白质序列进行序列比较后鉴定为真核生物起始因子4A(eIF4A)的Leishmania braziliensis同源物。分离的克隆(pLeIF.1)缺乏全长蛋白质序列的前48个氨基酸残基(144个核苷酸)。pLeIF.l)插入片段随后用于分离全长基因组序列。
SEQID NO1显示了全长LbeIF4A多肽的全部核苷酸序列。开放阅读框(核苷酸115至1323)编码403个氨基酸，预测分子量为45.3KD的蛋白质。比较LbeIF4A预测的蛋白质序列与烟草(TeIF4A)，小鼠(MeIF4A)和酵母(YeIF4A)的同源蛋白质表明具有广泛的序列同源性，变化最大的是前20-30个氨基酸。LbeIF4A，TeIF4A，MeIF4A和YeIF4A的长度(403，413，407，和395个氨基酸)，分子量(45.3，46.8，46.4，和44.7KDa)和等电点(5.9，5.4，5.5，和4.9)分别相似。LbeIF4A显示出与TeIF4A的总同源性为75.5％(57％相同，18.5％保守取代)，与MeIF4A为68.6％(50％相同，18.6％保守取代)，与YeIF4A为67.2％(47.6％相同，19.6％保守取代)。
实施例2LbeIF4A基因的表征本实施例描述了Leishmania种类LbeIF4A DNA的Southen印迹分析。使用了Leishmania braziliensis(MHOM/BR/75/M2903)，L.guyanensis(MHOM/BR/75/M4147)，L.amazonensis(IFLA/BR/67/pH8)，L.chagasi(MHOM/BR/82/BA-2，C1和MHOM/BR/84/Jonas)，L.donovani(MHOM/Et/67/HU3)，L.infantum(IPT-1)，L.major(LTMp-2)，L.tropica(1063c)，Trypanosoma cruzi(MHOM/CH/00/TulahuenC2)和T.brucei(TREU 667)且在以前进行了描述(见Burns et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.90775-779，1993)。前鞭毛虫和上鞭毛虫在无菌培养基中培养。分别从Syrian仓鼠脾和BALB/C ByJ小鼠瓜垫获得I.chagasi和L.amazonensis无鞭毛虫并按Burns et al.，J.Immunol.146742-748，1991所述纯化。
按Sambrook et al.，Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York，1989所述制备基因组DNA，用在LbeIF4A内(Pst I和Not I)和外侧(BamHI，EcoRI，EcoRV，HindIII，PruII和SstI)剪切的酶消化，在0.7％琼脂糖凝胶上分离并印迹到Nytran膜上。包含LbeIF4A编码区～0.94kb片段(核苷酸143至1083)的限制性片段经随机活化方法(见Feinbergand Vogelstein，And，Biochem，137266-268，1984)进行放射性标记且印迹在65℃杂交过夜。用含0.1％SDS的2x，0.5x和0.2xSSC在65℃洗涤印迹2次20分钟。L.braziliensis基因组DNA含IbeIF4A的至少2个拷贝，这可由在BamHI和PouII泳道上存在2条杂交带来说明(图1)。
同一图还说明了在L·braziliensis和其它Leishmania种类的eIF4A同源物间的种间保守性。在用显示相同杂交方式的L·dono-vani复合物(L.chagasi，L.donovani，和L.infantum)膜试验的所有其它Leishmania种类中检测到2个主要的PstI杂交片段。在严格杂交条件下LbeIF4A还与更远源的寄生虫T.cruzi而不是T.brucei发生交叉杂交。这些资料表明Leishmania eIF4A同源物具有广泛的种间保守性。
实施例3LbeIF4A的制备本实施例说明了～45KDa LbeIF4A抗原基因产物的表达和纯化。从500ml IPTG-诱导的培养物纯化基因组克隆pLeIF.1的45KDa的重组抗原(即，缺乏N-端48个残基的抗原)。分离包含体并依次在含2，4和8M尿素的10mlTNE(50mM Tris，pH8.0，100mM Nacl和10mM EDTA)中洗涤。合并含溶解重组抗原的部分(通常是4和8M尿素的上清液)，用Tris缓冲的盐水(TBS)透析并经过用30％硫酸铵沉淀来浓缩。经过制备性SDS-PAGE电泳，接着切下并电洗脱重组抗原实现纯化至均一性。在用Immunex Corp，Seattle，WA进行的Limulus阿米巴细胞试验中本试验所用的全部抗原具有不足10pg/ml的内毒素。
重组抗原用于免疫兔以生产多克隆抗血清。用100μg在不完全弗氏佐剂(IFA，GIBCO，Grand Island，NY)中的纯化LbeIF4A与100μg胞壁酰二肽(佐剂肽，Calbiochem-Norabiochem Corp，LaJoua，CA)经皮下免疫，四周后单独用在IFA中的100μg重组抗原进行加强免疫来免疫成年兔(NeW Zealand white；R＆R Rabbitry，Stanwood，WA)。三周后，用在盐水中的25μgLbeIF4A静脉内加强注射兔，一周后收集血清。
用多克隆兔抗血清作探针对在早、中或晚对数期或在22-35℃培养物的温度变动后收获的L·braziliensis前鞭毛虫溶胞产物依次进行免疫印迹(图2)。图2A组显示了分子量标记(泳道m)，未诱导的(泳道1)和诱导的(泳道2)培养物大肠杆菌溶胞产物和纯化的重组抗原(泳道3)的免疫印迹分析。图2B组显示了L·braziliensis前鞭毛虫溶胞产物(泳道1)，L.chagasi前鞭毛虫溶胞产物(泳道2)和L.amazonensis前鞭毛虫(泳道3)或无鞭毛虫(泳道4)溶胞产物的免疫印迹分析。
经过在无甘油和β-疏基乙醇的SDS样品缓冲液中对沉淀进行冻/融裂解制备寄生虫和哺乳动物细胞溶胞产物。在微量离心机中以10krpm离心从上清中分离不溶性物质。使用Pierce BCA蛋白质试验试剂盒测定蛋白质浓度。在12.5％SDS-PAGE上分离5至10μg寄生虫或细胞提取物或0.5至1.0μg重组抗原并经电泳转移到硝化纤维素膜上。接前面所述(Skeiky et al.，J.Exp.Med.176201-211，1992)使用[125I]-蛋白质A，接着经放射自显影测定抗血清的反应性。
兔抗血清检测到一个～45KD大小的主要蛋白质种类。对于所有分析的溶胞产物，45KDeIF4A同源物的相对强度相似，因此表明在寄生虫早到中期对数生长期期间或模拟细胞内无鞭毛虫阶段的温度转变后在结构上表达该抗原。这不象其产物在22-35℃的温度转变后上调的Leishmania热体克蛋白质家族的成员。免疫前的兔血清不与寄生虫溶胞产物反应。
实施例4结合LbeIF4A的单克隆抗体的制备本实施例描述了抗LbeIF4A单克隆抗体的制备。可使用常规技术，如在美国专利号4,411,993中公开的技术将纯化的重组LbeIF4A或高水平表达LbeIF4A的转染的细胞用于生产抗LbeIF4A的单克隆抗体。这类抗体可用于干扰PBMC的LbeIF4A激活作为LbeIF4A的诊断或研究试验或在LbeIF4A亲和纯化中的成份。
为了免疫啮齿类，LbeIF4A免疫原在佐剂(如完全或不完全弗氏佐剂，明矾，或其它佐剂，如Ribi佐剂R700(Ribi，Hamilton，MT)中乳化并以从10-100μg范围的量皮下注射进选定的啮齿类，例如，BALB/C小鼠或Lewis大鼠。10天到3周后，用另外的免疫原加强免疫的动物并随后以一周，二周或每三周的免疫程序定期加强。经眼眶后抽血或尾端切除定期取血清样品用于经点印迹试验(抗体夹心)或ELISA(酶联免疫吸附试验)测试。其它试验方法也是合适的，如Th1反应诱发的抑制。
经过检测合适的抗体滴度后，对阴性动物静脉注射盐水中的抗原。3至4天后处死动物，收获脾细胞并与鼠骨髓瘤细胞系(例如，NS1或优选Ag8.653[ATCC CRL 1580])融合。以该方法产生的杂交瘤细胞系平板接种在含选择性培养基(如含次黄嘌呤，氨基蝶呤和胸腺嘧啶的培养基或HAT)的多个微滴定板上以抑制非融合细胞，骨髓瘤-骨髓瘤杂交体，脾细胞-脾细胞杂交体的增殖。
由此产生的杂交瘤细胞系可经ELISA筛选与LbeIF4A的反应性，例如，用在Engvall et al.，Immunochem，8871(1971)和美国专利号4703004中公开的技术的修改方法进行。优选的筛选技术是Beckmanet al.，J.Immunol.1444212(199)描述的抗体俘获技术。例如，经过有限稀释或在软琼脂上克隆来克隆杂交瘤细胞系以产生单克隆细胞系。然后将阳性克隆注射进同源啮齿类的腹膜腔以产生含高浓度(＞1mg/ml)抗-LbeIF4A单克隆抗体的腹水。可经过硫酸铵沉淀接着进行凝胶排阻色谱纯化所得的单克隆抗体。作为选择，也可使用基于将抗体结合到蛋白质A或蛋白质G上的亲和色谱，及基于结合到LbeIF4A上的亲和色谱。
实施例5PBMC增殖的LbeIF4A刺激本实施例描述了纯化的重组LbeIF4A刺激Lbraziliensis感染的个体的PBMC增殖的能力。从生活于Lbraziliensis传播的地区(该地区的流行病学，临床和免疫学研究已进行了超过十年)的个体获得外周血。经过与至少下列之一相联系的临床发现进行患者的诊断从损伤处分离寄生虫，与Leishmania溶胞产物的阳性皮肤试验或阳性血清学试验。
收集外周血并经过通过FicollTM(Winthrop Laboratories，NewYork)的密度离心分离PBMC。为进行体外增殖试验，在含有或不含10μg/m1所示抗原或5μg/mlPHA(Sigma Immunochemicals.St.Louis，MO)的96孔平底平板中在完全培养基(RPMI1640，加有庆大霉素，2-ME，L-谷氨酰胺，和10％筛选的合并A+人血清；Trimar，Hollywood，CA)中培养2-4×105细胞/孔5天。然后，在培养的最后18小时用1μci[3H]胸腺嘧啶脉冲细胞。
数据以三份培养物的平均cpm代表且刺激指数(SI)定义为含抗原的培养物平均cpm/无抗原的培养物平均cpm。如表I和图3所示，大多数(＞70％)粘膜和发作的或治愈的皮肤患者PBMC以异源增殖方式与刺激指数范围分别为12到233和2到64的LbeIF4A反应。
表I与寄生虫溶胞产物和LbeIF4A抗原反应的Lbraziliensis感染的个体之PBMC的体外增殖[3H]掺入(平均cpm(SD)×103)患者培养基溶胞产物 LbeIF4A粘膜 S·I.S.I.JV0.15(0.0)41.30(1.3)294 11.90(4.8) 81SZ0.45(0.1)140.60(7.6) 308 105.90(5.6) 233AB0.42(0.3)44.20(0.5)104 5.00(1.3)12NO0.38(0.1)52.70(3.3)138 12.80(1.6) 33TE0.18(0.0)27.40(1.5)150 8.80(0.3)48MB0.18(0.0)300.10(9.4) 163441.50(4.5) 226OM0.28(0.0)35.40(3.2)124 6.90(2.5)24皮肤AS0.22(0.0)19.14(1.3) 87 14.30(2.3)64JP0.25(0.0)55.63(8.6) 218 4.40(0.3)17VS0.17(0.0)0.26(0.0)1.5 0.3(0.0) 2RJ0.10(0.0)0.32(0.2)3.0 1.5(0.6) 15JA0.16(0.0)0.77(0.1)4.7 2.5(0.2) 16AD4.20(1.0)4.01(1.0)2.0 14.1(2.2)3.5HN0.36(0.0)4.73(1.7)13 4.69(1.7) 13弥散性皮肤VAL0.22(0.0)0.51(0.3)2.0 2.12(0.2) 9.0自身愈合皮肤GS0.21(0.0)19.70(4 4) 94 41.50(2.8)198MS0.09(0.0)0.60(0.1)6.5 5.10(2.1)57AH0.11(0.0)59.60(7.1) 519 9.60(4.7)83DJ0.12(0.0)0.20(0.1)1.6 19.00(6.7) 151HS0.12(0.0)27.10(2.0) 225 12.40(2.7) 103MCT 0.38(0.0)130.30(14) 340 6.20(1.5)16正常LV0.14(0.0)0.19(0.0)1.4 0.71(0.1)4.0VV0.18(0.0)0.31(0.1)1.7 0.28(0.1)1.5N30.14(0.0)0.36(0.1)2.6 0.27(0.1)1.9N40.59(0.1)2.00(0.3)3.80.56(0.0)1.0一般来说，对粘膜个体的PBMC与刺激指数更高。一些粘膜患者PBMC与刺激指数可比得上用寄生虫溶胞产物所观察到的指数的LbeIF4A反应。令人感兴趣的是，在一些具有皮肤利什曼病的患者中，对LbeIF4A的增殖反应比由寄生虫溶胞产物诱导的反应更高。与粘膜和皮肤患者相反，具有自身愈合皮肤利什曼病的所有6个个体的PBMC与具有比得上粘膜个体的刺激指数(16-198)的IbeIF4A反应而增殖。两个自身愈合个体(MS和DJ)的PBMC的反应明显比用寄生虫溶胞产物获得的更高。正常未感染个体的细胞勉强受LbeIF4A刺激。
实施例6PBMC中细胞因子mRNA表达的LbeIF4A刺激本实施例提供了对证实为Lbraziliensis感染的患者PBMC中细胞因子mRNA表达方式的分析。为进行细胞因子mRNA分析，0.5至1ml PBMC以1-2×106细胞/ml在具有或不具有10μg/ml·缺少SEQ ID NO2N端48个残基的LLeIF4A抗原(如实施例3所述)的条件下培养48和72小时。收获上清和细胞并经聚合酶链反应(PCR)分析细胞因子mRNA。为进行细胞因子mRNA PCR分析，使用酸性硫氰酸胍-酚-氯仿提取法从PBMC中分离总RNA，如Chomczynski和Sacchi，Anal.Biochem.162156-159，1987所述。使用poly(dT)(Pharmacia)和AMV逆转录酶(Bethesda ResearchIaboratories，Gaithersburg，MD)在20μl终体积中合成互补DNA(cDNA)。用水将cDNA样品加到200μl。
对β-肌动蛋白规度化后，使用Taq聚合酶(Perkin-Elmer Ce-tus，Norwalk，CT)用各0.2μm的5’和3’外部引物在50μl反应体积中经PCR扩增12至20μl稀稀的cDNA。使用的条件是94℃变性(β-肌动蛋白，IL-2和IL-4 1分钟；IFN-γ45秒，IL-10 30秒)，55℃退火(β-肌动蛋白，IL-2和IL-41分钟；IL-10 30秒)或对IFN-γ60℃下45秒，在72℃延长。经过起始进行cDNA的系列稀释并改变用于PCR的循环数证实了PCR条件在半定量范围内。在所有随后的实验中，对β-肌动蛋白，IL-2，IL-4和IFN-γ的扩增反应使用30个循环，对于IL-10PCR使用25个循环。
使用的引物对和PCR条件来自公开的资料；β-肌动蛋白，IL-2，IL-4和IFN-γ(Ehlwrs et al.，J.Exp.Med.17323-36，1991)及IL-10(Viera et al.，Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A.881172-1176，1991)。5’和3’寡核苷酸引物的核苷酸序列分别如下(1)β-肌动蛋白，TGACGGGGTCACC-CACACTGTGCCCATCTA和CTAGAAGCATTGCG-GTGGACGATGGAGGG；(2)IL-2，ATGTACAGGATG-CAACTCCTGTCTT和GTCAGTGTTGAGATGATGCTTTGAC；(3)IL-4，ATGGGTCTCACCTCCCAACTGCT和CGAA-CACTTTGAATATTTCTCTCTCAT；(4)IFN-γ，ATGAAATATA-CAAGTTATATCTTGGCTTT和GATGCTCTTCGAC-CTCGAAACAGCAT；(5)IL-10，TCT-CAAGGGGCTGGGTCAGCTATCCCA和ATGCCCCAAGCTGA-GAACCAAGACCCA.
使用含有人序列IL-2，IFN-γ和IL-4(Lewis et al.，Proc.Natl.Acad，Sci.U.S.A.859743-9747，1988)及β-肌动蛋白的分别用HindIII/EcoRI，EcoRI，SacI/HindII，和EcoRI消化的质粒(no.65128；American Type Culture Collection，Rockville，MD)获得探针。使用设计成扩增包含人IL-10整个编码区的535个碱基对片段的寡核苷酸引物从正常供体分裂素刺激的PBMC经PCR克隆人IL-10 cDNA(Lewis et al.，Proc. Natl.Acad. Sci.U.S.A.859743-9747，1988)。cDNA亚克隆进pBluescript并用BamHI/EcoRI消化。在1％琼脂糖凝胶上分离后，切下插入的DNA片段，电洗脱并纯化。经随机活化方法制备放射性标记的32P-探针。
经过在1.5％琼脂糖凝胶上电泳，转移到尼龙膜上并用合适的32P-标记的DNA插入片段探测分析PCR产物。杂交在55℃过夜。杂交后的洗涤在55℃用含0.2％/SDS的2×和1×SSC各洗涤2次20分钟。
这些分析的结果在图4A和4B中提供。用培养前的细胞(脉道0)，无抗原培养后的细胞(泳道-)或存在10μg/ml L·braziliensis溶胞产物(泳道Lb)或存在10μg/ml LbeIF4A(泳道IF)的培养后的细胞进行PCR细胞因子分析。图4A显示了分析的6个粘膜患者PBMC中的3个(JV，SZ和TE)和一个L.amazonensis感染证实为弥散性皮肤利什曼疾病(DCL)的患者(VA)细胞因子mRNA PCR结果。在6个粘膜患者的3个中(TE，图4A；NO和EO，未显示)；未在体外培养的PBMC具有可检测的IFN-γ和IL-4及IL-2mRNA水平(患者TE和EO)。在任何粘膜患者的“静止”PBMC中未检测到IL-10mRNA。然而，在缺乏抗原刺激的条件下体外培养后，大多数分析的粘膜PBMC上调IL-10mRNA的合成。另外，在患者TE，NO和EO的“静止”PBMC中检测的细胞因子mRNA水平减小到背景水平。
寄生虫溶胞产物刺激Th1细胞因子IFN-γ和IL-2 mRNA及Th2细胞因子IL-4 mRNA的表达(在6个患者的三个中)。在与寄生虫溶肠产物培养后在一个患者PBMC(S2)中检测到IL-10mRNA增加。LbeIF4A抗原和寄生虫溶胞产物均诱导所有粘膜患者PBMC产生IFN-γ和IL-2的mRNA，且LbeIF4A诱导唯一的Th1细胞因子分布型。事实上，LbeIF4A下调在抗原刺激前大多数粘膜患者培养的PBMC中检测到的IL-10 mRNA的合成。令人感兴趣的是，在使用粘膜患者PBMC的情况下；LbeIF4A也下调DCL患者VA中IL-10 mRNA的合成。
一般来说，在溴化乙锭染色的凝胶中IFN-γ和IL-2mRNA水平从抗原刺激前不可检测量增加到抗原刺激后的易于观察的水平。然而，细胞因子IL-4和IL-10mRNA仅在放射活性探测分辨的PCR产物后检测。
对来自皮肤患者的PBMC进行相似的PCR分析(图4B)。来自分析的4个患者的3个(VS，JP和CA(未显示))的静止PBMC显示出检测到高水平的Th1(IFN-γ和IL-2)和Th2(IL-4和IL-10)细胞因子的mRNA。在第4个(AS)皮肤患者的静止PBMC中检测到IFN-γ和IL-2而不是IL-10和IL-4的mRNA.因此，与粘膜患者相反，皮肤利什曼疾患者静止PBMC中除了IL-4，IL-2和IFN-γ外，还有IL-10 mRNA。令人感兴趣的是，尽管在缺乏抗原时体外培养PBMC后IL-2和IFN-γ的mRNA减少到几乎不能检测的水平，但IL-10 mRNA保持不受影响或增加。因此，在皮肤患者中，IL-10 mRNA静止水平是稳定的或其PBMC在缺乏抗原刺激的条件下继续合成IL-10mRNA。皮肤利什曼病患者的这类反应的观察可用于区分易形成慢性皮肤利什曼病的个体与经历自身愈合损伤的个体。
试验的所有皮肤患者经过上调IL-2和IFN-γmRNA的合成与LbeIF4A抗原及寄生虫溶胞产物发生反应。四个患者中有2个(VS和AS)用寄生虫溶胞产物刺激后IL-4 mRNA水平也增加。在具有可检测的IL-10mRNA“静止”水平的3个患者(VS，JP和CA)中，LbeIF4A及寄生虫溶胞产物下调IL-10mRNA的表达。
具有自身愈合CL的患者PBMC细胞因子mRNA分布型与ML患者相似，其中(a)一个具有可检测的IL-10mRNA水平的个体例外，分析的4个患者中3个休息PBMC具有可检测的IL-2，IFN-γ和IL-4水平，但很少或没有IL-10mRNA；(b)无抗原培养PBMC后IL-10mRNA上调，而IL-2，IFN-γ和IL-4减少到背景水平；(c)利什曼虫溶胞产物刺激混合的Th1/Th2细胞因子分布型的表达，而LbeIF4A仅诱导Th1-型细胞因子mRNA表达增加且在大多数自身愈合个体培养的PBMC中下调IL-10mRNA的表达(未显示)。
实施例7LbeIF4A刺激PBMC中细胞因子的分泌本实施例提供了用缺少SEQ ID.NO2N端48个残基的LbeIF4A抗原(在实施例3中描述)或寄生虫溶胞产物刺激后Lbraziliensis感染的个体PBMC分泌的细胞因子上清水平。测定PBMC上清等份试样的IFN-γ，TNF-α，IL-4和IL-10。使用小鼠抗人IFN-γmAb(Chemicon，Temucula，CA)和多克隆兔抗人IFN-γ血清经双夹心ELISA定量IFN-γ。使用人rIFN-γ(Gen-netechInc.，San Francisco.CA)产生标准曲线。使用小鼠抗人IL-4 mAb(m1)和多克隆兔抗人IL-4血清(P3)经双夹心ELISA定量上清中的IL-4。人IL-4(Immunex Corp.，Seattle，WA)用于产生范围从50pg/ml到1ng/ml的标准曲线。使用大鼠抗人IL-10mAb(Pbar Mingen，San Diego，CA，Cat.#18551D)“捕获”分泌的IL-10且生物素标记的大鼠抗人IL-10 mAb(PharMingen SanDiego，CA，Cat.#18562D)用于检测与链霉抗生物素蛋白连接的辣根过氧化物酶结合的IL-10并以ABTS作底物来测量IL-10。使用人rIL-10(由DNA X Research Institute，Palo Alto.CA惠赠)获得标准曲线，范围从30pg到2ng/ml。
用10μg/ml LbeIF4A抗原或10μg/ml寄生虫溶胞产物(图5和6)刺激后所有3个患者组(即，粘膜，皮肤和自身愈合皮肤的细胞分泌IFN-γ和TNF-α(图5和6)。同样地，LbeIF4A刺激Ltropica感染的患者(沙漠风暴患者)增殖和分泌IFN-γ(未显示)。在患者PBMC上清中检测到的IFN-γ和TNF-α水平明显高于未感染的对照。在缺乏抗原刺激时，只有粘膜患者PBMC(6个中的5个)产生可检测的上清TNF-α水平(60到190pg/ml)。在分析的任何上清中几乎检测不到或完全检测不到IL-4或IL-10(未显示)，表明其水平低于所用的ELISA试验检测极限。经过比较，利什曼虫溶胞产物也刺激PBMC分泌IFN-γ和TNF-α，且在某些患者中，也检测到IL-10(未显示)。综合起来，这些结果表明LbeIF4A刺激Lbraziliensis感染的个体PBMC中占优势的Th1细胞因子分布型，而寄生虫溶胞产物刺激混合的Th1/Th2细胞因子分布型。
抗原刺激后粘膜和自身愈合个体的患者PBMC上清中检测到的TNF-α水平比皮肤患者更高(图6)。5个粘膜患者中4个(JV，S2，AB和MB)的PBMC TNF-α上清水平(0.80至2.20ng/ml)比用寄生虫溶胞产物刺激后未感染的对照PBMC培养物中检测到的更高。同样地，LbeIF4A刺激相同的PBMC产生范围从0.66到3.14ng/ml的TNF-α上清水平。与未感染的对照相比，分析的6个自身愈合个体中3个(GS，HS和MCT)的PBMC与寄生虫溶胞产物反应产生更高水平的TNF-α，分析的6个自身愈合个体中6个全部(GS，MS，AH，DJ，HS和MCT)与LbeIF4A反应产生更高的TNF-α水平。皮肤利什曼疾患者PBMC与寄生虫溶胞产物反应产生的TNF-α水平比得上未感染的对照。然而，LbeIF4A刺激这些患者中的3个(RJ，AD和JS)的PBMC产生TNF-α。这些患者可能在形成急性皮肤利什曼病的过程中。
实施例8LbeIF4A刺激IL-12产生本实施例表明LbeIF4A刺激L.braziliensis感染后个体的PBMC，培养的人巨噬细胞，正常供体血液贴壁PBMC和人骨髓样白血病细胞系THP-1分泌IL-12。IL-12显示出在细胞介导的免疫形成，Th1反应的产生和细胞内细菌或寄生虫感染的IFN-γ产生中发挥关键性的免疫调节作用。使用的LbeIF4A多肽是缺少SEQ ID NO2N端48个残基的LbeIF4A抗原(如实施例3所述)。
使用mAb对c11.79/c8.6经RIA(检测极限为10pg/m1)在无细胞的上清液中测量IL-12p40，如D’Andreaetal.，J。Exp.Med.1791387-1398，1992所述。生物活性IL-12p70杂二聚体(检测极限为1pg/ml)按Kubin et al.，Blood 831847-1855，1994所述测量。
图7A显示了10μg/ml LbeIF4A(LeIF)刺激粘膜患者PBMC在培养上清中分泌的IL-12p40数量明显高于用10μg/ml寄生虫溶胞产物作抗原(Lb)观察到的IL-12p40水平。还显示了缺乏溶胞产物或抗原分泌的IL-12p40量(Med)。同一图还显示了用LbeIF4A(LeIF+IL-10)或溶胞产物(Lb+IL-10)刺激后10μg/mlIL-10下调患者PBMC产生IL-12p40。
当用LbeIF4A(LeIF，图7B)培养时未感染的个体PBMC还产生IL-12p40，尽管检测不到p40与寄生虫溶胞产物(Lb)反应。这可能表明IFN-γ在患者的PBMC观察到的溶胞产物诱导的p40中起作用，在抗原刺激后患者的PBMC比正常PBMC多5-100倍的IFN-γ(见图5)。
为了测定在抗原刺激的PBMC培养物中观察到的IL-12p40是否反应生物活性细胞因子，还在这些培养物中测定了IL-12p70(图7C和7D)。一般来说，p70产生类似于p40的产生，表明在患者和正常PBMC中与LbeIF4A反应均产生生物活性IL-12。
LbeIF4A还刺激培养的人巨噬细胞(图9A)和贴壁PBMC(图9B)中的IL-12产生。从正常供体血液经Ficoll-hypague梯度离心分离的PBMC制备贴壁细胞。2×106PBMC在500μlRPMI，2％人AB血清中培养2小时。经过用PBS洗涤平板3次纯化贴壁细胞。然后加入具有各刺激物(IFN-1000V/ml，LbeIF4A(Lf)10μg/ml)的试验培养基(RPMI，2％人AB血清)500μl。18小时后取上清液。
经过用5日龄的PHA母细胞进行捕获生物测定测量贴壁PBMC产生的IL-12。简单地说，将IL-12捕获抗体C11.5.14(WistarInstitute惠赠)覆盖在96孔平板上。将诱导实验的上清与重组IL-12(作为标准品)保温4小时。经过几步洗涤步骤后，加入5日龄PHA母细胞，这些母细胞的增殖用于测定贴壁细胞上清中的IL-12浓度。
经过在试验培养基中培养贴壁细胞(2×106PBMC)5天产生巨噬细胞。然后在PBS中洗涤巨噬细胞，加入500μlRPMI，2％人AB血清和1000V/ml IFN-γ。用LbeIF4A(10μg/ml)刺激巨噬细胞或单独在培养基(M)中培养。在一组中，用LbeIF4A在500μl RPMI，2％人AB血清，无IFN-γ中培养LbeIF4A对照巨噬细胞。18小时后取上清并用于诱导IL-12依赖性增殖。简单地说，用巨噬细胞上清培养5日龄母细胞2天。在最后18小时，加入3H胸腺嘧啶。按所指明的加入中和抗-IL-12多克隆山羊血清(5μg/ml)。
另外，LbeIF4A刺激人髓样白血病细胞系THP-1中IL12的产生(图10)。在含5％胎牛血清的无内毒素RPMI培养基中以106细胞/ml将细胞培养24-48小时。10μg/ml LbeIF4A与IFN-γ协同刺激THP-1细胞分泌IL-12。这些结果表明LbeIF4A作为疫苗的实用性。
实施例9IL-12和1L-10对LbeIF4A诱导IFN-γ产生的影响本实施例检查了IL-12，IL-10和IFN-γ间相互作用与缺少SEQ ID NO2 N端48个残基的LbeIF4A多肽(如实施例3所述)的反应。如图8A所示，在缺少(LeIF)或存在10ng/ml抗-IL-12(LeIF+抗-IL-12)或IL-10(LeIF+IL-10)的条件下用10μg/mlLbeIF4A刺激粘膜利什曼患者的PBMC，测定培养的上清液的IFN-γ分泌。抗-IL-12mAb和IL-10取消了LbeIF4A诱导的IFN-γ分泌的生产。然而，用利什曼虫溶胞产物刺激后抗-IL-12mAb仅部分减少IFN-γ的生产(图8B)。这些结果表明IFN-γ生产是IL-12依整型，并受IL-10的抑制，而IL-12的生产受IFN-γ依赖型和非依赖两种途径的调节。
实施例10小鼠中LbeIF4A刺激的Th1分布型本实施例证实了缺少SEQ ID NO2N端48个残基的LbeIF4A多肽(如实施例3所述)刺激BALB/c小鼠中占优势的Th1细胞因子分布型。使用quilA或CFA作佐剂用LbeIF4A或8E(L·braziliensis线粒体hsp70的C端部分，它刺激患者PBMC产生高水平的IL-10)致敏动物。致敏10天后，用重组抗原再次体外刺激淋巴结(LN)细胞并分析上清培养物中分泌的细胞因子。结果(图11)表明使用两种类型的佐剂用LbeIF4A攻击后用LbeIF4A致敏的小鼠LN细胞增殖并分泌几乎唯一的Th1细胞因子(IFN-γ)。与此相反，与用8E攻击发生的特异性反应是用8E致敏的小鼠LN细胞产生Th0反应(以CFA作佐剂)或Th1/Th2型细胞因子(以quil A作佐剂)强烈偏向Th2细胞因子，IL-4和IL-10。同样地，用寄生虫溶胞产物致敏的小鼠产生混合的细胞因子分布型，该结果可能与寄生虫溶胞产物单独用作侯选疫苗相抵触(图11)。
这些结果表明，LbeIF4A可用作佐剂。由于LbeIF4A诱导有力的Th1反应，包括与实验利什曼病保护最明确相关的2个细胞因子IFN-γ和IL-12，我们研究了该抗原保护小鼠抵抗利什曼病的能力。用不含佐剂的LbeIF4A免疫BALB/c小鼠一次，7天后接着用L.major皮下感染。与对照组相比，LbeIF4A提供显著的保护抵抗L.major感染(图12)。因此，来自L·braziliensis的异源性抗原可提供一些保护抵抗L.major感染，表明在这两类寄生虫中至少有一些保护性抗原决定簇保守。
从上面的描述可预料到，尽管为了说明目的本文描述了本发明的具体实施方案，但在偏离本发明精神和范围的条件下可做出各种修改。
序列描述(1)一般资料(i)申请人Corixa，Corporation(ii)发明题目用于刺激和增强保护性免疫反应和IL-2生产的化合物和方法(iii)序列数2(iv)联系地址(A)联系人SEED and BERRY(B)街道6300 Columbia Center，701 Fifth Avenue(C)城市Seattle(D)州华盛顿(E)国家美国(F)邮编98104-7092(V)计算机可读形式(A)媒体类型Floppy盘(B)计算机IBM PC兼容机(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件PatentIn Release#1.0，Version#1.30(Vi)最近申请资料(A)申请号US(B)申请日1995年4月24日(C)分类(viii)律师/代理人资料(A)姓名Kadlecek，Ann T.
(B)登记号p-39，244(C)参考/文摘号210121.404PC
(ix)电讯资料(A)电话(206)622-4900(B)传真(206)682-6031(C)电传3723836 SEEDANDBERRY(2)SEQ ID NO1资料(i)序列特征(A)长度1618碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑线型(ii)分子类型cDNA(ix)特征(A)名称/键CDS(B)位置115..1326(xi)序列描述SEQ ID NO1CCACTCTCTC GGTCGTCTGT CTCCCACGCG CGCACGCAGT TGATTTCCGC CTTCTTAAAC 60GCTCTCTTTT TTTTTATTTT TCACCTGACC AACCGCACCA CGTCGGCCTC CATC ATG117Met1TCG CAG CAA GAC CGA GTT GCC CCA CAG GAC CAG GAC TCG TTC CTC GAC165Ser Gln Gln Asp Arg Val Ala Pro Gln Asp Gln Asp Ser Phe Leu Asp5 10 15GAC CAG CCC GGC GTC CGC CCG ATC CCG TCC TTC GAT GAC ATG CCG TTG213Asp Gln Pro Gly Val Arg Pro Ile Pro Ser Phe Asp Asp Met Pro Leu20 25 30CAC CAG AAC CTT CTG CGC GGC ATC TAC TCG TAC GGC TTC GAG AAA CCG 261His Gln Asn Leu Leu Arg Gly Ile Tyr Ser Tyr Gly Phe Glu Lys Pro35 40 45TCC AGC ATC CAG CAG CGC GCC ATC GCC CCC TTC ACG CGC GGC GGC GAC 309Ser Ser Ile Gln Gln Arg Ala Ile Ala Pro Phe Thr Arg Gly Gly Asp50 55 60 65ATC ATC GCG CAG GCG CAG TCC GGT ACC GGC AAG ACG GGC GCC TTC TCC 357Ile Ile Ala Gln Ala Gln Ser Gly Thr Gly Lys Thr Gly Ala Phe Ser70 75 80ATC GGC CTG CTG CAG CGC CTG GAC TTC CGC CAC AAC CTG ATC CAG GGC 405Ile Gly Leu Leu Gln Arg Leu Asp Phe Arg His Asn Leu Ile Gln Gly85 90 95CTC GTG CTC TCC CCG ACC CGC GAG CTG GCC CTG CAG ACG GCG GAG GTG 453Leu Val Leu Ser Pro Thr Arg Glu Leu Ala Leu Gln Thr Ala Glu Val100 105 110ATC AGC CGC ATC GGC GAG TTC CTG TCG AAC AGC GCG AAG TTC TGT GAG 501Ile Ser Arg Ile Gly Glu Phe Leu Ser Asn Ser Ala Lys Phe Cys Glu115 120 125ACC TTT GTG GGT GGC ACG CGC GTG CAG GAT GAC CTG CGC AAG CTG CAG 549Thr Phe Val Gly Gly Thr Arg Val Gln Asp Asp Leu Arg Lys Leu Gln130 135 140 145GCT GGC GTC GTC GTC GCC GTG GGG ACG CCG GGC CGC GTG TCC GAC GTG 597Ala Gly Val Val Val Ala Val Gly Thr Pro Gly Arg Val Ser Asp Val150 155 160ATC AAG CGC GGC GCG CTG CGC ACC GAG TCC CTG CGC GTG CTG GTG CTC 645Ile Lys Arg Gly Ala Leu Arg Thr Glu Ser Leu Arg Val Leu Val Leu165 170 175GAC GAG GCT GAT GAG ATG CTG TCT CAG GGC TTC GCG GAT CAG ATT TAC693Asp Glu Ala Asp Glu Met Leu Ser Gln Gly Phe Ala Asp Gln Ile Tyr180 185 190GAG ATC TTC CGC TTC CTG CCG AAG GAC ATC CAG GTC GCG CTC TTC TCC741Glu Ile Phe Arg Phe Leu Pro Lys Asp Ile Gln Val Ala Leu Phe Ser195 200 205GCC ACG ATG CCG GAG GAG GTG CTG GAG CTG ACA AAG AAG TTC ATG CGC789Ala Thr Met Pro Glu Glu Val Leu Glu Leu Thr Lys Lys Phe Met Arg210 215 220 225GAC CCC GTA CGC ATT CTC GTG AAG CGC GAG AGC CTG ACG CTG GAG GGC837Asp Pro Val Arg Ile Leu Val Lys Arg Glu Ser Leu Thr Leu Glu Gly230 235 240ATC AAG CAG TTC TTC ATC GCC GTC GAG GAG GAG CAC AAG CTG GAC ACG885Ile Lys Gln Phe Phe Ile Ala Val Glu Glu Glu His Lys Leu Asp Thr245 250 255CTG ATG GAC CTG TAC GAG ACC GTG TCC ATC GCG CAG TCC GTC ATC TTC933Leu Met Asp Leu Tyr Glu Thr Val Ser Ile Ala Gln Ser Val Ile Phe260 265 270GCC AAC ACC CGC CGC AAG GTG GAC TGG ATC GCC GAG AAG CTG AAT CAG981Ala Asn Thr Arg Arg Lys Val Asp Trp Ile Ala Glu Lys Leu Asn Gln275 280 285AGC AAC CAC ACC GTC AGC AGC ATG CAC GCC GAG ATG CCC AAG AGC GAC1029Ser Asn His Thr Val Ser Ser Met His Ala Glu Met Pro Lys Ser Asp290 295 300 305CGC GAG CGC GTC ATG AAC ACC TTC CGC AGC GGC AGC TCC CGC GTG CTC1077Arg Glu Arg Val Met Asn Thr Phe Arg Ser Gly Ser Ser Arg Val Leu310 315 320GTA ACG ACC GAC CTC GTG GCC CGC GGC ATC GAC GTG CAC CAC GTG AAC 1125Val Thr Thr Asp Leu Val Ala Arg Gly Ile Asp Val His His Val Asn325 330 335ATC GTC ATC AAC TTC GAC CTG CCG ACG AAC AAG GAG AAC TAC CTG CAC 1173Ile Val Ile Asn Phe Asp Leu Pro Thr Asn Lys Glu Asn Tyr Leu His340 345 350CGC ATT GGC CGC GGC GGC CGC TAC GGC GTA AAG GGT GTT GCC ATC AAC 1221Arg Ile Gly Arg Gly Gly Arg Tyr Gly Val Lys Gly Val Ala Ile Asn355 360 365TTC GTG ACG GAG AAA GAC GTG GAG CTG CTG CAC GAG ATC GAG GGG CAC 1269Phe Val Thr Glu Lys Asp Val Glu Leu Leu His Glu Ile Glu Gly His370 375 380 385TAC CAC ACG CAG ATC GAT GAG CTC CCG GTG GAC TTT GCC GCC TAC CTC 1317Tyr His Thr Gln Ile Asp Glu Leu Pro Val Asp Phe Ala Ala Tyr Leu390 395 400GGC GAG TGA GCGGGCCCCT GCCCCCCTTC CCTGCCCCCC TCTCGCGACG 1366Gly Glu *AGAGAACGCA CATCGTAACA CAGCCACGCG AACGATAGTA AGGGCGTGCG GCGGCGTTCC 1426CCTCCTCCTG CCAGCGGCCC CCCTCCGCAG CGCTTCTCTT TTGAGAGGGG GGCAGGGGGA 1486GGCGCTGCGC CTGGCTGGAT GTGTGCTTGA GCTTGCATTC CGTCAAGCAA GTGCTTTGTT 1546TTAATTATGC GCGCCGTTTT GTTGCTCGTC CCTTTCGTTG GTGTTTTTTC GGCCGAAACG 1606GCGTTTAAAG CA1618(2)SEQ ID NO2资料(i)序列特征(A)长度403个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑线型(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID NO2Met Ser Gln Gln Asp Arg Val Ala Pro Gln Asp Gln Asp Ser Phe Leu1 5 10 15Asp Asp Gln Pro Gly Val Arg Pro Ile Pro Ser Phe Asp Asp Met Pro20 25 30Leu His Gln Asn Leu Leu Arg Gly Ile Tyr Ser Tyr Gly Phe Glu Lys35 40 45Pro Ser Ser Ile Gln Gln Arg Ala Ile Ala Pro Phe Thr Arg Gly Gly50 55 60Asp Ile Ile Ala Gln Ala Gln Ser Gly Thr Gly Lys Thr Gly Ala Phe65 70 75 80Ser Ile Gly Leu Leu Gln Arg Leu Asp Phe Arg His Asn Leu Ile Gln85 90 95Gly Leu Val Leu Ser Pro Thr Arg Glu Leu Ala Leu Gln Thr Ala Glu100 105 110Val Ile Ser Arg Ile Gly Glu Phe Leu Ser Asn Ser Ala Lys Phe Cys115 120 125Glu Thr Phe Val Gly Gly Thr Arg Val Gln Asp Asp Leu Arg Lys Leu130 135 140Gln Ala Gly Val Val Val Ala Val Gly Thr Pro Gly Arg Val Ser Asp145 150 155 160Val Ile Lys Arg Gly Ala Leu Arg Thr Glu Ser Leu Arg Val Leu Val165 170 175Leu Asp Glu Ala Asp Glu Met Leu Ser Gln Gly Phe Ala Asp Gln Ile180 185 190Tyr Glu Ile Phe Arg Phe Leu Pro Lys Asp Ile Gln Val Ala Leu Phe195 200 205Ser Ala Thr Met Pro Glu Glu Val Leu Glu Leu Thr Lys Lys Phe Met210 215 220Arg Asp Pro Val Arg Ile Leu Val Lys Arg Glu Ser Leu Thr Leu Glu225 230 235 240Gly Ile Lys Gln Phe Phe Ile Ala Val Glu Glu Glu His Lys Leu Asp245 250 255Thr Leu Met Asp Leu Tyr Glu Thr Val Ser Ile Ala Gln Ser Val Ile260 265 270Phe Ala Asn Thr Arg Arg Lys Val Asp Trp Ile Ala Glu Lys Leu Asn275 280 285Gln Ser Asn His Thr Val Ser Ser Met His Ala Glu Met Pro Lys Ser290 295 300Asp Arg Glu Arg Val Met Asn Thr Phe Arg Ser Gly Ser Ser Arg Val305 310 315 320Leu Val Thr Thr Asp Leu Val Ala Arg Gly Ile Asp Val His His Val325 330 335Asn Ile Val Ile Asn Phe Asp Leu Pro Thr Asn Lys Glu Asn Tyr Leu340 345 350His Arg Ile Gly Arg Gly Gly Arg Tyr Gly Val Lys Gly Val Ala Ile355 360 365Asn Phe Val Thr Glu Lys Asp Val Glu Leu Leu His Glu Ile Glu Gly370 375 380His Tyr His Thr Gln Ile Asp Glu Leu Pro Val Asp Phe Ala Ala Tyr385390 395 400Leu Gly Glu
权利要求
1.一种分离的DNA分子，包含选自下列的DNA序列(a)SEQ ID NO1核苷酸115地1323；(b)在中等严格的条件下与SEQ ID NO1核苷酸115至1323的互补核苷酸序列杂交的DNA序列，其中，该DNA序列编码在来自Leishmania感染的个体外周血单核细胞中刺激Th1免疫反应的多肽；(c)编码由上述任一DNA序列编码之多肽的DNA。
2.一种重组表达载体，包含权利要求1的DNA分子。
3.一种用权利要求2的表达载体转化或转染的宿主细胞。
4.一种制备在Leishmania感染的个体外周血单核细胞中刺激Th1免疫反应之多肽的方法，包含在启动该DNA序列表达的条件下培养权利要求3的宿主细胞并回收该多肽。
5.一种多肽，包含由权利要求1的DNA序列编码的氨基酸序列
6.一种多肽，包含SEQ ID NO2的氨基酸49-403，或其区别仅在于保守取代和/或修饰的变异体。
7.一种评价患者产生免疫反应之能力的方法，包含(a)将从患者获得的生物学样品与权利要求5或6的多肽接触，其中生物学样品包含选自外周血单核细胞，单核细胞，B细胞；树枝状细胞，巨噬细胞或其组合的细胞；(b)测量细胞的反应。
8.权利要求7的方法，其中的反应是增殖反应。
9.权利要求7的方法，其中的反应是选自干扰素-γ，白细胞介素-2，白细胞介素-12p70，白细胞介素-12p40亚基，白细胞介素-1和肿瘤坏死因子-α的细胞因子的分泌。
10.权利要求7的方法，其中的反应是编码选自干扰素γ，白细胞介素-1，白细胞介素-12p40亚基，白细胞介素-1和肿瘤坏死因子-α的细胞因子之mRNA的表达。
11.一种在患者中增强对抗原的细胞和/或体液免疫应答的方法，包含给患者施用权利要求5或6的多肽和一种抗原。
12.一种在患者中刺激结合Leishmania寄生虫之抗体的产生的方法，包含给患者施用权利要求5或6的多肽。
13.一种在患者中刺激Th1免疫反应的方法，包含给患者施用权利要求5或6的多肽。
14.一种在生物学样品中刺激Th1反应的方法，包含将Leish-mania感染的个体的生物学样品与权利要求5或6的多肽接触，其中生物学样品包含选自外周血单核细胞，单核细胞，B细胞，树枝状细胞，巨噬细胞和其组合的细胞。
15.一种在患者中下调白细胞介素10表达的方法，包含给患者施用权利要求5或6的多肽。
16.一种在生物学样品中下调白细胞介素-10表达的方法，包含将得自Leishmania感染的个体的生物学样品与权利要求5或6的多肽接触，其中生物学样品包含选自外周血单核细胞，单核细胞，B细胞，树枝状细胞，巨噬细胞和其组合的细胞。
17.一种测定抗原制备疫苗组合物之适宜性的方法，包含测定该抗原是否能刺激得自未感染Leishmania的个体的生物学样品产生白细胞介素-12，其中，生物学样品包含选自外周血单核细胞，单核细胞，B细胞，树枝状细胞，巨噬细胞和其组合的细胞。
18.一种单克隆抗体，与权利要求5或6的多肽特异性地结合。
19.一种药用组合物，包含权利要求5或6的多肽和一种生理上可接受的载体。
20.一种用于刺激对抗原的保护性免疫反应的疫苗，包含权利要求5或6的多肽和一种抗原。
21.一种刺激患者中IL-12生产的方法，包含给患者施用权利要求5或6的多肽。
22.一种刺激生物学样品中IL-12产生的方法，包含将生物学样品与权利要求5或6的多肽接触，其中生物学样品包含选自外周血单核细胞，单核细胞，B细胞，树枝状细胞和其组合的细胞。
23.一种治疗患有与IL-12刺激反应的疾病的患者的方法，包含给患者施用权利要求5或6的多肽。
24.权利要求23的方法，其中的疾病是感染性疾病。
25.权利要求23的方法，其中的疾病是癌症。
26.一种根据权利要求5或6的多肽在生产用于增强患者细胞和/或体液免疫应答之药物中的应用。
27.根据权利要求5或6的多肽在生产用于刺激结合Leishma-nia寄生虫患者抗体产生之药物中的应用。
28.根据权利要求5或6的多肽在生产用于刺激患者Th1免疫反应之药物中的应用。
29.根据权利要求5或6的多肽在生产用于下调患者白细胞介素-10表达之药物中的应用。
30.根据权利要求5或6的多肽在生产用于刺激患者白细胞介素-12之药物中的应用。
31.根据权利要求5或6的多肽在生产用于治疗患有与白细胞介素-12刺激反应的疾病的患者之药物中的应用。
全文摘要
公开了用于刺激和增强免疫反应及用于评价患者免疫反应的化合物和方法。公开的化合物包括至少含有Leishmania braziliensis同源的真核起始因子4A的生物活性部分的多肽或其衍生物。这类化合物对于刺激在患者及分离的细胞和细胞培养物中的Th1免疫反应和IL-12产生有用。本发明的多肽还对于评价和治疗可能患有利什曼病或其它疾病的患者有用。
文档编号C07K14/435GK1149887SQ95193405
公开日1997年5月14日 申请日期1995年4月24日 优先权日1994年4月22日
发明者S·G·里德 申请人:科里克萨有限公司