专利名称：一种新的脑内皮细胞蛋白及其用法的制作方法
技术领域：
本发明一般涉及神经学和蛋白质化学领域。更具体地，本发明涉及一种新的67千道尔顿(kDa)、由脑内皮细胞分泌的膜蛋白。
相关技术的描述神经生长因子(nerve growth factor，NGF)在感觉、交感神经的和胆碱能神经元的发育和存活中起重要作用。trk原癌基因编码蛋白质gP140trk，这是一个跨膜蛋白酪氨酸激酶，它的表达仅限于神经组织。神经营养受体trk A、B和C都是酪氨酸激酶，它们在外周和中枢神经系统中表达，每种受体都表现出截然不同的表达时间和细胞特异模式。已知在损伤或发炎组织区域，NGF的数量会增加数倍，该现象是在损伤发生后数小时内观察到的。NGF涉及由肥大细胞激活的免疫调节，还涉及组织修复过程。脑微血管内皮细胞和星形细胞在维持血脑屏障(blood brain barrier，BBB)中起重要作用。组织损伤后，NGF在修复微血管内皮中起作用时需要在内皮细胞上存在功能性的NGF受体(trk-A)，以引发替换损伤组织所需的血管生成过程。
已经表明，编码核蛋白的两个原癌基因(c-fos，c-myc)涉及生长调控机制，因为用多肽生长因子和其他试剂处理细胞后，它们被快速和暂时性地诱导。c-fos的诱导与各种不同生物事件相关联，其中包括有丝分裂、分化和神经细胞的去极化。这些观察结果暗示，fos在信号传导系统中作为核信使发挥普遍作用。
动脉粥样硬化损伤或动脉粥样化已经成为多年来的研究重点，其组织学特征得以充分描述以显示四大主要特征。这些特征是(1)细胞增殖，尤其是平滑肌细胞；(2)胆固醇沉积增加，尤其是胆固醇酯；(3)巨噬细胞明显，尤其是那些充满脂类的、被称为“泡沫细胞”的巨噬细胞，因为它们具有充满脂肪的外表，再加上存在于其他细胞成分(包括血液中的成分)中由巨噬细胞所产生的相关细胞因子；(4)结缔组织成分如弹性蛋白和葡糖胺聚糖的合成增加。这四个突出的组织学特征中的每一个都成为深入研究的焦点，尽管对动脉粥样化形成的确切顺序仍在争论之中并且还不清楚，但是很明显它涉及多因子而且包括同时发生胆固醇代谢的削弱以及平滑肌细胞增殖增加和细胞因子活性提高。已知某些细胞因子在下列方面起重要作用调节白细胞吸附、细胞生长、血管舒缩功能、血管基质的重塑以及调节血液相容性以降低或影响动脉内皮上的血栓。
没有一种成分能单独地引发动脉粥样硬化，但是控制这些相互作用的成分中的一种可实质性地有助于大大减缓动脉粥样化形成的过程。例如，降低胆固醇如将血清胆固醇浓度降至低于170mg/dl，可降低高发病对象中冠状心脏疾病的发病率。血管受伤，例如由高血压、吸烟、口服避孕药和其他与血浆胆固醇水平无关的损伤所造成的血管受伤，会造成血小板附着于受伤部位。这种附着诱导血小板的“释放反应”并导致分泌各种化合物，主要是血栓烷A2和腺苷二磷酸，同时召集其他血小板以增加凝聚。此外，血小板释放血小板衍生生长因子(PDGF)，该因子诱导平滑肌细胞的增殖并迁移至内皮，在该处平滑肌细胞形成动脉粥样化的最初成分。
动脉粥样化过程主要局限于大血管如主动脉和传导动脉如颈动脉、肾动脉、冠状动脉或大脑中动脉。然而，较小的小动脉在腔隙冲击中也受增殖过程的影响，其中脂肪充满细胞并且该增殖过程被称为“脂质透明变性(1ipohyalinosis)”。此外，在Binswanger氏病或皮层下动脉病变脑病中，白质的小的渗透小动脉在未知性质的加工过程中为“末端血管”。这些较小血管的增殖过程可能代表了在正常存在的生长因子下的未加控制的增殖情况。由动脉平滑肌细胞正常产生的神经生长因子(NGF)和NGF蛋白、trk-癌基因的应答都暗示一种旁分泌功能。这种对旁分泌控制的调控完全丧失或异常可导致小动脉平滑肌细胞的增殖增加，并且缩小腔面积，随后造成血流量减少和局部缺血。因此，平滑肌细胞的正常增殖可能参与动脉粥样化形成，而在脑小动脉中，相同的不受控制的过程可导致腔缩小、脑传导纤维局部缺血和中风样症状及痴呆。
已有技术的缺陷在于，缺乏有效的预防和治疗各种脑血管疾病的方法。本发明填补了本领域中的该长期需求。
发明概述在本发明的一个例子中提供了一种组合物，它含有分离和纯化的蛋白，该蛋白由脑内皮细胞产生，分子量在SDS-PAGE中约为67kDa，该蛋白质能刺激脑小动脉平滑肌细胞增殖。
在本发明的另一例子中提供了一种药物组合物，它含有分离和纯化的蛋白，该蛋白由脑内皮细胞产生，分子量在SDS-PAGE中约为67kDa，该蛋白质能刺激脑小动脉平滑肌细胞增殖，以及含有药学上可接受的载体。
在本发明的另一例子中提供了一种制备本发明蛋白质的方法，它包括步骤约37℃下在培养基中培养脑内皮细胞；收获该细胞；以及从该细胞中分离和纯化本发明的蛋白质。
在本发明的另一例子中提供了一种治疗人脑血管疾病的方法，它包括步骤向人施用药理上有效量的、设计用于抑制本发明蛋白质产生的寡核苷酸。
在本发明的另一例子中提供了一种改善侧支脑血管循环的方法，它包括步骤向人施用药理上有效量的本发明的药物组合物。
在本发明的另一例子中提供了一种确定人脑血管疾病严重程度的方法，它包括步骤测量本发明蛋白质在血清中的浓度。
本发明的其他和进一步方面、特征和优点，通过下列出于公开目的而给出的、目前本发明的优选实施例的描述，将更清楚。
附图的简要描述为了获得本发明的上述特征、优点和目的以及其他方面，并能详细地理解，下面结合某些具体实施例更详细地描述在前面已扼要概括的本发明。这些实施例结合附图进行描述。然而，应注意，附图是用于阐述本发明的优选实施例，因此不可理解为本发明范围局限于此。
图1显示了在鼠脑内皮细胞(RBE)和肺内皮细胞(PEC)中DNA合成水平。在神经生长因子(NGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、4％血清或对照介质存在下，测量胸苷的掺入量。
图2显示trkA在鼠脑内皮细胞中的表达。从鼠脑内皮细胞和PC-12细胞制备细胞裂解液，用7.5％十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离多肽，再转至硝酸纤维素薄膜上。膜与亲和纯化的多克隆抗-trkA一起孵育过夜，用结合辣根过氧化物酶的第二抗体探测1小时，然后用ECL免疫检测系统显影。
图3显示了鼠脑内皮细胞和PC-12对照细胞的反转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)产物。对5μg总RNA和PC-12细胞进行反转录，然后通过trkA特异引物的PCR进行扩增。泳道1)PC-12RNA；2)PC-12RNA+DM-SO；3)和4)酶和模板对照；5)鼠脑内皮细胞RNA和DMSO；6)鼠脑内皮细胞RNA和7)DNA标记物。从鼠脑内皮细胞mRNA中获得的200bp的产物(箭头指出的)与从PC-12细胞中获得的产物相同。
图4显示了NGF在鼠脑内皮细胞中对AP-1复合物的活化作用。从未处理的(对照)或从用4％血清、300mM TPA、10ng/ml bFGF或100ng/ml NGF处理的鼠脑内皮细胞中制备核抽提物。将核抽提物(2微克蛋白质)与2微克聚(dl-dc)和32p标记的AP1探针(0.5ng)在室温下一起孵育30分钟。反应混合物上样于5％聚丙烯酰胺凝胶然后电泳。干燥凝胶，进行放射自显影分析。
图5显示了NGF对鼠脑内皮细胞中c-fos的诱导。将核抽提物(2微克)与无添加物(对照)或抗c-fos抗体-起预孵育16小时。接着加入32P标记的AP1(0.5ng)，复合物在5％非变性凝胶上进行分析。
图6显示NGF导致鼠脑内皮细胞分泌67kDa蛋白质。
图7显示bFGF导致鼠脑内皮细胞分泌67kDa蛋白质。
本发明的详细描述本发明描述基于免疫和PCR手段定量trkA在鼠脑内皮细胞中的表达。鼠脑内皮细胞对神经生长因子产生应答，该应答可通过胸苷掺入的增加、包括转录因子(AP1)在内的基因诱导和trk AmRNA的表达而观察到，其中可能是通过活化fos基因。用神经生长因子处理的鼠脑内皮细胞的条件培养基含有分子量约67kDa的蛋白质，该蛋白诱导更多的(3H)胸苷掺入血管平滑肌细胞。在非神经细胞中，已知只有B细胞被NGF活化并导致免疫球蛋白产量增加和B细胞增殖。因此，本发明公开了NGF在脑内皮细胞血管形成中的作用机制，其中包括在侧支循环系统的发育和平滑肌细胞增殖中所起的作用。
作为对脑内皮细胞暴露于NGF的反应，本发明显示DNA和trk A受体蛋白的合成增加，并且关联地释放独特的、分子量为67kDa的蛋白。此外，发生早期基因诱导(AP1复合物)。用抗-fos进行的凝胶转移分析显示，存在fos基因的快速诱导。在鼠脑内皮细胞中，用NGF刺激后导致诱导AP-1复合物，这暗示，fos可能在信号传导系统中起作用，而该传导系统将细胞外信号诱导的短期事件与基因表达的长期改变相互联系起来。本发明公开，NGF是释放新的67kDa蛋白质的主要的介导因子，因为鼠脑内皮细胞暴露于神经生长因子6小时(在25cm2瓶中生长)会导致产生大量可被考马斯蓝染色的蛋白质，而对照细胞则不能。这种数量非常高的可释放蛋白质并不随早期传代而改变。早期培养物(传代3-14次)显示出可释放蛋白的数量相近，尽管从传代15次起有所改变。
鼠脑内皮细胞对神经生长因子的独特的应答(在外周内皮细胞如肺内皮细胞中没有观察到)涉及正常的生理状态如侧支循环和病理状态如皮层下脑病和Binswanger氏疾病，在这些病中，作为对来自鼠脑内皮细胞的NGF刺激而释放生长因子的反应，平滑肌细胞不受调控地增殖，这可能导致末端小动脉增殖和狭窄化。
本发明提供了通过鼠脑内皮细胞调控脑小动脉平滑肌细胞增殖的方法。根据本发明的讲授内容，本领域的一般技术人员可以对控制生长因子的基因进行操作，并使用反义技术。因此，本发明可用于产生保护性的侧支循环，减少小动脉的狭窄现象并最终防止中风。
通过改变平滑肌细胞的生长和增殖，本发明的新蛋白可影响正常脉动血流情况下脑血管的稳定性、弹性、顺应性和完整性，改变侧支循环的发育和维持。
这些预期正常的生理功能，当发生异常或者对外部刺激和本发明蛋白质表达过度或不足产生应答时，会在各种疾病和紧张性刺激(stressor)中看到的脑血管并发症中发挥作用。对外部因素的异常应答可能会使产生该蛋白的应答不足，从而导致脑血管更脆弱，这在某些脑血管疾病如大脑内出血、因动脉瘤而造成的蛛网膜下出血和偏头痛中可观察到。此外，平滑肌细胞过度增殖造成的应答性(responsiveness)增加可能会导致大脑内动脉粥样硬化、脂质透明变性、Bin-swanger氏病或皮层下动脉脑病、烟雾阴影病和脑浮肿形成时血脑屏障的破坏。
因为本发明的67kDa蛋白是由脑内皮细胞分泌的，所以可以用放射免疫分析方法检测该蛋白在循环系统中的水平。在发病状态下，该蛋白在血清中的浓度与病症如Binswanger氏病相关，因为处于对蛋白的异常应答下。另一方面，在正常的生理状态下，例如侧支循环系统的形成过程中，在血管重塑中与血流相关的变化会引发该蛋白在生长而非增殖中的起作用。
在正常生理和病理状况下，本发明蛋白在细胞和分子水平的控制和调控可以被本领域的一般技术人员所利用，作为优化正常血管功能和减少疾病的手段。目前已有的、可用于修饰本发明蛋白质的技术包括反义寡核苷酸技术和形成三链的寡核苷酸技术。可以预计，将来修饰基因的特异性启动子或增强区域的药物也会起到类似作用。
特别指出，用本发明的新蛋白可制备药物组合物。在这种情况下，药物组合物含有本发明的新蛋白和药学上可接受的载体。不需要过多的试验，本领域的一般技术人员便可轻易地确定本发明新蛋白的合适剂量和给药途径。
近年来，分子生物学领域中一般科学家的普通技术水平已大大提高。不需要过多的试验，本领域的一般技术人员便可轻易地对本发明新的脑内皮细胞蛋白进行测序。获得蛋白质的知识后，一般技术人员可以轻易地克隆编码该蛋白的基因。基因序列的知识可使本领域的一般技术人员开发出形成三链的寡核苷酸以抑制编码本发明新的脑内皮细胞蛋白的基因的转录。本发明脑内皮细胞蛋白的蛋白质序列知识可使人们不必进行过多的试验，便可制备反义寡核苷酸以抑制翻译蛋白质。
因此，本发明提供了一种物质组合物，它包括分离和纯化的蛋白，该蛋白由脑内皮细胞产生，分子量在SDS-PAGE中约为67kDa，该蛋白质能刺激脑小动脉平滑肌细胞增殖。
还提供了一种药物组合物，它含有本发明的蛋白质和药学上可接受的载体。本发明的药物组合物适合用于各种不同的药物传送系统。对于目前药物传送方法的简要回顾，可参见Langer，Science，2491527-1533(1990)。制备可施用的化合物的方法对本领域的技术人员而言是已知的或显而易见的，例如在Remington’s Pharmaceutical Science，17th ed.，Mack Publishing Company，Easton，PA(1988)中有详细描述。
本发明还提供了一种制备如权利要求1所述蛋白质的方法，它包括步骤约37℃下在培养基中培养脑内皮细胞；收获该细胞；以及从该细胞中分离和纯化权利要求1所述的蛋白质。一般而言，正如本发明所公开的，可以用生长因子如神经生长因子刺激本发明蛋白的产生。
在本发明还提供了一种治疗人脑血管疾病的方法，它包括步骤向人施用药理上有效量的、设计用于抑制本发明蛋白质产生的寡核苷酸。
可用本发明方法治疗的脑血管疾病的代表性例子包括大脑内出血、因动脉瘤而造成的蛛网膜下出血、偏头痛、大脑内动脉粥样硬化、脂质透明变性、Bin-swanger氏病或皮层下动脉脑病、烟雾阴影病和脑浮肿形成时血脑屏障的破坏。
本领域的一般技术人员可以轻易地制备寡核苷酸，例如形成三链的寡核苷酸和反义寡核苷酸，这些寡核苷酸可用于抑制或调控本发明蛋白的产生。
本发明还提供了一种改善侧支脑血管循环的方法，它包括步骤向人施用药理上有效量的权利要求2所述的组合物。本发明还提供了一种确定人脑血管疾病严重程度的方法，它包括步骤测量权利要求1所述蛋白质在血清中的浓度。
给出下列实施例以阐述本发明的各种例子，这些实施例不以任何方式限制本发明。实施例1鼠脑内皮细胞的分离从新生鼠的脑中分离鼠脑内皮细胞，将细胞置于涂有明胶的培养皿中，培养基含有2％缺乏血小板的人血浆、2％胎牛血清和100μg/ml内皮细胞生长因子。对表现出内皮细胞形态的集落进行亚克隆并随后进行克隆，而冷冻的细胞储备液仍维持。根据内皮特征确定细胞，其中包括形态学、非血栓形成细胞表面和因子VIII抗原的表达。
为了阐述NGF和其他生长促进物质对脑和肺内皮细胞的增殖性应答的影响，将细胞置于24孔组织培养皿，生长至汇合度为80％。通过在含0.1％胎牛血清白蛋白(BSA)和0.1％葡萄糖的DMEM中孵育48小时，使培养物的生长停止。通过随后将细胞孵育于含或不含生长因子的无血清DMEM中而开始试验。加入[3H]胸苷，暴露接触24小时后，洗涤细胞层，分析氚掺入DNA的情况。图1显示，神经生长因子会导致鼠脑内皮细胞中胸苷掺入量的增加，但是在肺内皮细胞中不引起增加。实施例2trkA在鼠脑内皮细胞中的表达为了确定在鼠脑内皮细胞中存在NGF受体(gp140trk)，用多克隆抗-trkA、trk B和trk C抗体进行Western印迹分析。让鼠脑内皮细胞和PC-12细胞与NGF致敏7天。通过于4℃，在含1mM PMSF、0.15μg/ml抑肽酶和1mM原钒酸钠的NP-40裂解缓冲液(20mM Tris，pH8.0，137mM NaCl，10％甘油，1％NP-40)中震荡20分钟而使细胞裂解。制备细胞裂解液，用7.5％SDS-PAGE分开多肽，再转至硝酸纤维素薄膜。封闭膜1小时，然后与亲和纯化的多克隆抗-trk A抗体一起孵育过夜。洗涤膜，用偶联辣根过氧化物酶的第二抗体探测，并根据制造商的说明用ECL免疫检测系统(AMERSHAM)显影。对trkA呈特异性阳性的免疫印迹被鉴别被140kDa的蛋白质(图2)。实施例3trk受体基因的表达通过mRNA的存在而证实trk受体基因在鼠脑内皮细胞中的表达。用随机的六聚体引物对总RNA进行反转录。然后将产生的cDNA混合物用作模板以延伸一部分trk-A基因。使用来自编码蛋白质胞外区域的cDNA的引物，分别为5′-GGTCC AGGTG CCCAA TGCCT CGG和5′-AGCTG CTCTAGATCA TCCTT CTTCT CCACC GG。图3显示，用PCR产生的200碱基对产物与用trk-A阳性的PC-12细胞产生的产物相同。实施例4AP-1复合物的活化NGF和其他生长促进物质对AP-1在鼠脑内皮细胞中表达的影响，通过凝胶泳动率变化分析而测量。从未处理(对照)或从用4％血清、300nM TPA、10ng/ml bFGF或100ng/ml NGF处理15分钟的鼠脑内皮细胞中制备核抽提物。如Dignam et al.，Nucl.Acids Res.，111475-1489(1983)中所述，用冰冷的PBS洗涤亚汇合(subconfluent)的鼠脑内皮细胞，然后将其刮入5毫升PBS中。通过离心(500×g离心5分钟)使细胞沉淀下来，然后再悬浮于5毫升低渗溶液(10mM Tris-HCl[pH7.9]，12.5mM MgCl2，10mM KCl，0.5mMDTT)中，让其在冰上膨胀10分钟。接着，细胞用玻璃Dounce均化器撞击20下而匀浆化，在1000×g离心10分钟使核沉淀。核再悬浮于悬浮缓冲液(20mMTris-HCl[pH7.9]，1.5mM MgCl2，20％甘油，0.5mM DTT)中，随后加入4M氯化钾至终浓度为0.3M氯化钾。悬浮液在4℃轻轻地震荡30分钟，然后在4℃，于13000×g离心15分钟。含有核抽提物的上清液储藏在-70℃以供使用。
AP-1结合位点从2个寡核苷酸制备，其一致序列为5′-GATCT GT-GAC TCAGG GGA-3′和5′-GATCT CGCGC TGACT CACA-3′。根据Maniatis等人的方法对合成的寡聚物进行末端标记。在加入标记片段的同时加入竞争性DNA。将核抽提物(2-5μg蛋白质)与20μg聚(dl-dc)以及dCT-P标记的AP-1探针(0.5ng)在室温下孵育30分钟。反应混合物上样于在0.25TBE中的5％聚丙烯酰胺凝胶(30∶0.8/丙烯酰胺二丙烯酰胺/30∶0.8)凝胶(Trisma碱，25mM硼酸和1mM EDTA)，然后电泳。干燥凝胶，用放射性自显影术进行分析。AP-1条带的密度用Bio-Rad Imaging密度仪(GS-650型)。为了确定形成AP-1复合物的蛋白质种类，检查针对c-fos和c-jun的抗体对这些复合物的作用情况。
已知特异性抗体或者瓦解或者减缓在非还原凝胶中的蛋白质-DNA复合物。将抗体加至鼠脑内皮细胞核抽提物，在4℃孵育16小时，然后加入标记探针。(图5)。箭头指出的条带代表序列特异性结合。加入未标记探针显示结合的特异性，而且c-fos抗体可防止正常DNA蛋白质复合物的形成并产生一种迁移更慢的形式。实施例5NGF对67kDa蛋白的刺激细胞表面糖蛋白在体内会经受广泛的调控，而且某些糖蛋白在许多细胞的加工中起着关键作用。为了阐述鼠脑内皮细胞对随机生长因子的应答与这种现象相关联，收集来自暴露于神经生长因子后的鼠脑内皮细胞的条件培养基。一般，细胞生长至汇合，充分洗涤，然后暴露于NGF6小时。(图6)。
收集培养基，用centricon30浓缩。浓缩的样品根据Laemmli的方法进行7.5％SDS-PAGE电泳，蛋白质条带用考马斯蓝染色而鉴别，然后用30％甲醇/10％乙酸(v/v)脱色。在用NGF处理的鼠脑内皮细胞-条件培养基中出现一条独特的蛋白质条带(67kDa)，它占总蛋白质约80％。切取被考马斯蓝染色的蛋白质点，用V8蛋白酶消化，在15％丙烯酰胺凝胶上电泳和电印迹(electroblot)。电泳分开的蛋白质的内部氨基酸序列的确定用自动测序仪进行。其中一个肽的序列如下Pro-Glu-Pro-Asp-Asp-Glu-Ala-Leu-Glu-Ala-Asn-Val-Ala-Gln该蛋白质似乎被酰基封闭了N-末端。在所有的真核蛋白质中有多达50％的蛋白质在氨基端被封闭。该短多肽的序列信息与数据库(GEN bank)中任何已知蛋白的序列不匹配。实施例6bFGF对67kDa蛋白的刺激本发明还公开，用低至10ng/ml碱性成纤维细胞生长因子处理细胞后，从鼠脑内皮细胞的条件培养基中分离分泌蛋白的过程(图7)。该蛋白质在SDS-PAGE上的泳动率，与用神经生长因子处理鼠脑内皮细胞而获得的蛋白质的泳动率几乎相同。已知碱性成纤维细胞生长因子可诱导鼠脑内皮细胞形成血管。因此，用牛成纤维细胞生长因子刺激而得的蛋白可能涉及血管内皮的血管形成过程。
用bFGF处理后，立刻分泌受碱性成纤维细胞生长因子刺激的蛋白，而且分泌持续至少48小时。其分子量为约65-70kDa，而且具有糖蛋白的特征。
在本说明书中提及的所有专利和出版物代表了本发明所涉及的技术领域中技术人员的水平。所有专利和出版物都同等程度地被引用作为参考，就好比每个出版物都特别地和单独地指明被引用作为参考。
本领域的技术人员会轻易地领悟，本发明可很好地用于实施所述目的、获得结果和好处，以及那些内在的结果和好处。与此处所述的方法、程序、处理方法、分子和具体化合物一起描述的目前的实施例是目前优选实施例的代表，是起代表性作用的，不用于限制本发明范围。本领域的技术人员可进行各种改动和用于其他用途，这些都包括在由权利要求书所限定的本发明的范围内。
序列表(1)一般信息(i)申请人Yatsu，Frank M.；Alam，Nargis A.；和Alam，Syed S.
(ii)发明名称一种新的脑内皮细胞蛋白及其用法(iii)序列数目5(iv)通讯地址(A)地址James F.Weiler，律师(B)街道One Riverway，Suite1560(C)城市Houston(D)州Texas(E)国家美国(F)邮政编码77056(v)计算机可读形式(A)记录介质类型DS，HD1.44Mb/1.44Mo(B)计算机IBM PC兼容型(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件WordPerfect6.0(vi)本申请资料(A)申请号(B)申请日08.05.95(1995年5月8日)(C)分类(vii)律师/代理人信息(A)姓名Weiler，James F.
(B)登记号16,040(C)参考/案卷号D-5707PCT(viii)通讯信息(A)电话713-626-8646(B)传真713-963-5853(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征
(A)长度23(B)类型核酸(C)股性双链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型(A)描述其他核酸(iii)假设否(iv)反义否(vi)最初来源(B)菌株(C)单个分离物(D)发育阶段(F)组织类型(G)细胞类型(H)细胞系(xi)序列描述SEQ ID NO1GGTCCAGGTC CCCAATGCCT CGG 23(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)长度32(B)类型核酸(C)股性双链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型(A)描述其他核酸(iii)假设否(iv)反义否(vi)最初来源(B)菌株(C)单个分离物(D)发育阶段
(F)组织类型(G)细胞类型(H)细胞系(xi)序列描述SEQ ID NO2AGCTGCTCTA GATCATCCTT CTTCTCCACC GG 32(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)长度18(B)类型核酸(C)股性双链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型(A)描述其他核酸(iii)假设否(iv)反义否(vi)最初来源(B)菌株(C)单个分离物(D)发育阶段(F)组织类型(G)细胞类型(H)细胞系(ix)特征(A)其他(xi)序列描述SEQ ID NO3GATCTGTGAC TCAGGGGA 18(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)长度19(B)类型核酸
(C)股性双链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型(A)描述其他核酸(iii)假设否(iv)反义否(vi)最初来源(B)菌株(C)单个分离物(D)发育阶段(F)组织类型(G)细胞类型(H)细胞系(ix)特征(A)其他(xi)序列描述SEQ ID NO4GATCTCGCGC TGACTCACA 19(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)长度14(B)类型氨基酸(C)股性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型(A)描述肽(iii)假设否(iv)反义否(v)片段类型内部片段(vi)最初来源(B)菌株(C)单个分离物
(D)发育阶段(F)组织类型(G)细胞类型(H)细胞系(ix)特征(A)其他(xi)序列描述SEQ ID NO4Pro Glu Pro Asp Asp Glu Ala Leu Glu Ala Asn Val Ala Gln1 510
权利要求
1.一种分离和纯化的蛋白质，其特征在于，该蛋白由脑内皮细胞产生，分子量在SDS-PAGE中约为67kDa，而且该蛋白质能刺激脑小动脉平滑肌细胞增殖。
2.一种药物组合物，其特征在于，它含有权利要求1所述的蛋白质以及药学上可接受的载体。
3.一种制备权利要求1所述蛋白质的方法，其特征在于，它包括步骤约37℃下在培养基中培养脑内皮细胞；收获该细胞；以及从该细胞中分离和纯化权利要求1所述的蛋白质。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，该蛋白质的产生用神经生长因子进行刺激。
5.一种治疗人脑血管疾病的方法，其特征在于，它包括步骤向人施用药理上有效量的、设计用于抑制权利要求1所述蛋白质产生的寡核苷酸。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，脑血管疾病选自下组大脑内出血、因动脉瘤而造成的蛛网膜下出血、偏头痛、大脑内动脉粥样硬化、脂质透明变性、Binswanger氏病或皮层下动脉脑病、烟雾阴影病和脑浮肿形成时血脑屏障的破坏。
7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，该寡核苷酸选自下组形成三链的寡核苷酸和反义寡核苷酸。
8.一种改善侧支脑血管循环的方法，其特征在于，它包括步骤向人施用药理上有效量的权利要求2所述的组合物。
9.一种确定人脑血管疾病严重程度的方法，其特征在于，它包括步骤测量权利要求1所述蛋白质在血清中的浓度。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，脑血管疾病选自下组大脑内出血、因动脉瘤而造成的蛛网膜下出血、偏头痛、大脑内动脉粥样硬化、脂质透明变性、Binswanger氏病或皮层下动脉脑病、烟雾阴影病和脑浮肿形成时血脑屏障的破坏。
全文摘要
本发明提供了一种新的分离的和纯化的蛋白质，它由脑内皮细胞产生，分子量在SDS-PAGE中约为67kDa，该蛋白质能刺激脑小动脉平滑肌细胞增殖。还提供了使用该新蛋白质或编码该蛋白质的基因的各种方法，包括治疗各种脑血管疾病的方法。
文档编号C07K14/435GK1162266SQ95193031
公开日1997年10月15日 申请日期1995年5月8日 优先权日1994年5月9日
发明者F·M·亚楚, N·A·阿拉姆, S·S·阿拉姆 申请人:研究发展基金会