专利名称：：丹参丹酚酸a的用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及中药领域，涉及丹参丹酚酸A—种新用途，具体涉及丹参丹酚酸A在制备治疗脑血管内皮细胞功能障碍药物中的应用。本申请脑血管内皮细胞功能障碍包括但不限于脑血管内皮细胞损伤、脑血管内皮细胞增殖、脑血管内皮细胞炎症等脑血管内皮细胞非生理性的功能障碍；
背景技术：
：脑缺血是脑血管病变产生的，因其发病大多数比较急骤，故又称"脑血管意外"。凡因脑血管阻塞或破裂引起的脑血液循环障碍和脑组织机能或结构损害的疾病都可以称为脑缺血，即脑缺血状态。脑缺血造成人体的功能障碍由大脑损害的部位和范围所决定。脑缺血分为两大类，即缺血性脑缺血和出血性脑缺血，在这里一般指的是脑动脉系统的缺血或出血，缺血性脑缺血占脑缺血病人总数的60%—70%，主要包括脑血栓形成和脑栓塞。脑血栓形成是缺血性脑血管病的一种，多见于中老年人，无显著性别差异；出血性脑缺血占脑缺血病人的30%~40%，根据出血部位的不同又分为脑出血和蛛网膜下腔出血，脑出血俗称"脑溢血"，是由于脑内动脉破裂，血液溢出到脑组织内，蛛网膜下腔出血则是脑表面或脑底部的血管破裂，血液直接进入容有脑脊液的蛛网膜下腔和脑池中。脑缺血具有发病率高、死亡率高、致残率高、复发率高的特点，是中老年人的多发病、常见病。现代药理研究，脑缺血的机理主要分为兴奋性氨基酸学说、氧自由基学说、钙超载学说、酸中毒学说、NO学说、基因学说等，其中经典的钙超载学说的机理为当脑缺血发生，脑组织细胞很快地出现能量代谢障碍，从而导致神经末梢大量释放出以谷氨酸为主的兴奋性祌经递质，然后，激活NMDA及非NMDA受体，引起一系列导致脑损伤、脑梗死的病理变化。通过受体激活，促进大量<^2+内流，细胞内Ca2+超负荷是使脑细胞死亡的关键因素及共同的通路，当缺血的脑组织在恢复血流供应时，又可产生再灌注损伤，这种脑组织缺血性再灌注后产生的脑损伤是脑梗死形成的另一个主要途径，往往与Ca"内流增加，c^+超负荷相关，细胞内Ca^超负荷，大量Na+内流及氧自由基剧增又可导致神经细胞凋亡，后者是缺血性脑细胞坏死的重要形式。按照上述脑出血的机理，世界上研发出很多治疗脑缺血的药物，比如钙通道阻滞剂、自由基清除剂、谷氨酸释放抑制剂及受体拮抗剂、腺苷转运抑制剂、白细胞黏附抑制剂及抗炎药物、NO合酶抑制剂、等药物，但这些药物只能针对单个耙点起作用，而对其余革E点的作用没有或非常弱，这就导致上述的药物在治疗脑缺血时会产生很多缺点，因此，临床上急需一种针对多靶点产生作用的药物，来治疗脑缺血这种疾病。
发明内容基于上述原因，我们科研人员通过创造性的劳动，发现脑血管内皮细胞与脑出血、脑出血机制有着的紧密的关系其中，氧自由基可引起脂质过氧化，直接损伤内皮细胞；过量的NO能与超氧阴离子形成过氧亚硝酸根离子和羟自由基，损伤线粒体膜，使线粒体形成漏，开放线粒体转换孔，致使离子平衡紊乱；超载的细胞外钙主要通过破坏线粒体的结构与功能导致细胞能量代谢障碍，触发一系列酶促反应加速细胞损伤进程、促进氧自由基生成、激活非选择性氧离子通道等途径产生细胞毒性作用，最终导致内皮细胞损伤；兴奋性氨基酸介导内皮损伤的机制则与促进Na+、C1—、水的内流，导致神经元水肿、变性，导致细胞内钙超载,介导氧自由基的产生及激活NOS产生过量的NO等均有关；脑出血时，脑内氧自由基及NO生成增加、细胞外钙超载、兴奋性氨基酸含量升高，这些因素均参与脑血管内皮细胞的损伤过程。现已证明脑血管内皮是一个十分活跃的代谢及内分泌器官，其功能众多1、具有屏障功能；2、具有信息传递与内分泌功能；3、具有转化与灭活功能；4、具有抗凝与抗血栓功能；5、具有调节血管张力的等功能。因此，脑血管内皮功能的改变与脑出血的发生和发展有关，相应对脑血管内皮功能障碍具有治疗作用的药物研究，成为新药研究的热点。针对脑血管内皮细胞障碍进行深入的机理研究，发现丹参丹酚酸A对脑血管内皮细胞障碍具有很好的治疗作用，而这种深入的机理研究，可以很好的确证丹参丹酚酸A可以很好的治疗脑出血这种疾病，为丹参丹酚酸A药效机理的揭示，为丹参丹酚酸A在临床应用中，提供了确切的、深入的理论基础。本发明通过以下技术方案实现的。丹参丹酚酸A在制备治疗脑血管内皮细胞功能障碍药物中的应用。其中丹参丹酚酸A含量大于等于50%且小于100%。其中丹参丹酚酸A含量大于等于90X且小于100%。其中丹参丹酚酸A为活性物质制备的药物制剂。药物制剂为单位剂量的片剂、胶囊剂、颗粒剂、微丸剂、滴丸剂、口服液、软胶囊剂、水针剂、粉针剂、输液剂。其中片剂、胶囊剂、颗粒剂、微丸剂、滴丸剂、口服液剂、软胶囊剂单位剂量为5—1000mg。其中水针剂、粉针剂、输液剂单位剂量为5—500mg。上述药物制剂的物质基础是丹参丹酚酸A，因此，上述药物制剂对血管脑血管内皮细胞功能障碍具有很好的治疗作用。本申请脑血管内皮细胞功能障碍包括血管脑血管内皮细胞损伤、脑血管内皮细胞增殖、脑血管内皮细胞炎症等脑血管内皮细胞非生理性的功能障碍。本申请丹参丹酚酸A根据本院申请的专利200610145453.9、200610170267.0中丹参丹酚酸A的制备方法得到。实验一大鼠全脑缺血前给予丹参丹酚酸A对再灌后海马神经元内钙离子浓度的影响实验方法采用改良Pulsindli四血管闭塞法制作大鼠全脑缺血模型。先用手术电凝器阻断双侧大脑椎动脉，24h后，用动脉夹夹闭双侧颈总动脉20min造成全脑缺血。20min缺血期满后，撤去双侧动脉夹，恢复脑供血。急性分离大鼠海马CA1区神经元，采用钙离子成像系统检测海马CA1区神经元内钙离子浓度。实验分为(1)正常组大鼠不做任何处理，直接断头取脑分离岀神经元，观察神经元内钙离子浓度；(2)再灌注组制作大鼠的全脑缺血模型，并以再灌后分1.5、3.0、4.5、6.0h4个时间点进行观察；(3)丹参丹酚酸组在制作全脑缺血模型前15min给予丹参丹酚酸2mg/kg,并以再灌后分1.5、3.0、4.5、6.0h4个时间点进行观察。每组(时间点)均检测11个神经元。实验结果再灌注组再灌后1.5、3.0、4.5h时间点与正常组比较，Ca^浓度升高(PO.05或PO.01);再灌后6.0h神经元内游离Ca"农度与正常组比较，差异无统计学意义。丹参丹酚酸组再灌后1.5、4.5h时间点Ca"农度比再灌组相同时间点低(PO.01);而再灌后3.0、6.0hC,浓度与再灌组相应时间点比较，差异无统计学意义。结果表明，全脑缺血前给予丹参丹酚酸A可降低全脑缺血再灌后大鼠海马CA1区神经元内游离C^+浓度；同时，可以明显改善因为C^+超载导致的脑血管细胞内膜损伤。表1两组海马CA1区神经元内游离Ca"浓度的比较(x士s)组别再灌注组海马CA1区神经元内游离C^+浓度121.5h*880.423±28.1033.0h4.5h*889.637±25.314904.448±87.6526.0h767.971士85.451丹参丹酚酸A组12696.845±65.312886.465±5.322775.462±35,213754.186±59.615注两组相同吋间点比较*为P<0.01实验二丹参丹酚酸A对全脑缺血/再灌注大鼠海马谷氨酸、抗坏血酸释放的影响实验方法Wistar雄性大鼠20只，体重(220士50)g，随机分成四组(11=5):A组(假手术组)仅暴露双侧翼小孔和双侧颈总动脉,不行阻闭；B组(缺血/再灌注组)，全脑缺血IOmin再灌注60min;C组(生理盐水处理组)，于全脑缺血后经尾静脉注入生理盐水；D组(丹参丹酚酸A处理组)，于全脑缺血后即刻经尾静脉注入丹参丹酚酸A2mg/kg后用Graseby-3500微量注射泵以1.5mg/h持续输注60min。采用Pulsinelli-Brierley四血管阻断法制备全脑缺血模型，应用脑微透析技术结合高效液相色谱(HPLC)检测大鼠海马细胞外GIu、AA含量的变化。谷氨酸测定流动相溶剂A为0.05mol/L醋酸钠缓冲液(pf^6.8)-甲醇-四氢呋喃(800:192:8，V/V);溶剂B为0.05mol/L柠檬酸三钠缓冲液(11=6.8:)-甲醇(2:8)，用G6垂熔漏斗过滤；流速1.0ml/min;荧光检测器工作波长350nm(激发波长)和450nm(检测波长)。精确吸取透析20^1，直接注入HPLC-RF-10AXL，荧光检测系统中对Glu含量进行检测。维生素C测定流动相155.6mol/L氯化钠、L5mol/L四丁基溴化铵0.5mmol/L乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na2)，以水为溶剂，用G6垂熔漏斗过滤；流速1.0ml/min;电化学检测器工作电压+0.7V。精确吸取透析20^1，直接注入HPLC-ECD电化学检测系统中对AA含量进行检测。结果与缺血/再灌注组各对应时点相比较，丹参丹酚酸A处理组大鼠海马细胞外CIu、AA含量明显降低，统计结果差异均有显著性(P0.05，或O.Ol)。结论缺血/再灌注早期应用丹参丹酚酸A不仅减少兴奋性氨基酸释放，还能清除自由基、抑制脂质过氧化反应而产生脑保护作用。实验三对血管紧张素II诱导人脑血管内皮细胞凋亡的影响实验方法人脑血管内皮细胞系ECV304培养于DMEM培养液中，其中含胎牛血清10%、青霉素(100U/mL)和链霉素(100U/mL),置于C02培养箱，5%C02、37°C、95%湿度下静止培养，2d换液l次。待细胞铺满培养瓶底时，用0.25%胰酶消化传代。按lxl()S/mL将细胞接种于96孔培养板，每孔200fxL。培养24h后，换无血清培养液培养24h。分组空白对照组(不加药)、AngII组(lpmol/L)、AnglI(lpmol/L)+丹参酮IIA(10pmol/L)组(加入10(imol/L丹参酮IIA，孵育30min后加入Angni^mol/L)、Ang11(lpmol/L)+丹参丹酚酸A(10pmol/L)组(加入10pmol/L丹参丹酚酸A，孵育30min后加入Angni|imol/L)，各组设6个复孔，继续培养24h后，于光镜下观察细胞形态。MTT法检测ECV304细胞活性，按试剂盒说明测定细胞培养上清液中的NO及NOS含量，流式细胞仪检测细胞凋亡。结果(1)细胞形态观察:倒置显微镜下动态观察可见空白对照组细胞紧密贴壁，呈铺路石状生长。AngII组可见多数细胞呈圆形，胞膜空泡，核浓縮；Angn(lpm0l/L)+丹参酮IIA(10pmOl/L)组可见多数细胞呈圆形，胞膜空泡，核浓縮，AnglI+丹参丹酚酸A组见上述细胞较空白组明显减少。(2)与空白对照组比较，Angn组可明显降低细胞活性(PO.01)，AnglI+丹参丹酚酸A组均可明显抑制AngII作用，增加脑血管内皮细胞的活性，该组细胞活性与正常细胞无明显区别。实验结果见表l:表2丹参丹酚酸A对AngII诱导ECV304脑血管内皮细胞的影响组别面积对照组0.530±0.024AngII组0.381±0.019**AngII+丹参酮IIA组0.404±0細**AnglI+丹参丹酚酸A组0.531±0.015##注与对照组比较"PO.01;与AnglI组比较S弁PO.01;与AngII+丹参酮IIA组比较％%P<0.01.实验四对大鼠血管脑血管内皮早期损伤的保护作用实验方法大鼠麻醉后，腹卧固定消毒。脑血管内皮损伤组在背部皮下埋置AngU缓释泵，脑血管内皮损伤加丹酚酸A组也埋置AngII缓释泵，但在埋泵前3天和埋泵后经尾静脉注射丹酚酸A。AngII用O.Olmol醋酸0.9%氯化钠稀释分装后-8(TC保存，AngII释放剂量为200ng/min/kg，每只泵均加入2mlAngII溶液，药物缓释泵释放速度为1(Vl/h。术后肌注青霉素3d预防感染。分别在埋泵后的第1天、3天、7天和14天，动物麻醉后处死取材口自下而上依次剪开左侧肋软骨，暴露胸腔，剪开心包，右心室抽血(每只动物约可以采血6-8ml)，用作血清学检测用Liang-500型毛细管血粘度测定仪测定血液粘度。取出肾动脉，肝素0.9%氯化钠洗涤数次。2.5。/。戊二醛前固定2h、P/。饿酸后固定l-2h。缓冲液漂洗20min。分别用70%、80%、卯％、100%丙酮梯度脱水，每次10min。Epon812包埋、烤箱内45°C(12h)、6CTC(36h)。半薄切片定位，超薄切片于铜网上。醋酸双氧铀和柠檬酸铅染色。PhilipsTECNAI-12型透射电镜观察拍照。实验结果(1)血清学检测发现，与对照组相比，丹参丹酚酸A能够改善血管脑血管内皮功能。(2)电镜观察肾动脉透射镜观察在脑血管内皮损伤组可见到脑血管内皮细胞不同程度的充血、肿胀、剥脱，在某些部位还可见到内弹力板的暴露，但丹酚酸A组仅有轻微损伤，提示丹参丹酚酸A具有很好的保护脑血管内皮细胞的作用。实验五对动脉脑血管内皮损伤大鼠血管内膜增生的影响研究实验方法用3%戊巴比妥钠(50mg/kg)腹腔麻醉大鼠后，将动物背位固定在鼠台上，颈部皮肤用碘酒和酒精常规消毒后，剪开皮肤2-3cm，依次分离皮下组织、肌肉，并暴露气管，在气管左侧游离左颈总动脉l-1.5cm,将远心端结扎，近心端用动脉钳闭夹，于颈动脉远端用动脉剪剪一斜口，将导管插入胸主动脉约4-5cm长，反复牵拉5次，第6次插入胸主动脉后注入高渗液0.1mL保留90s，最后拔出导管，结扎左侧颈总动脉，逐层缝合皮下脂肪、肌肉及皮肤切口,碘酒涂擦切口。造模成功后，将大鼠随机分为6组，假手术组、丹酚酸A组(4mg/kg/d)、丹参丹酚酸B对照组(4mg/kg/d)、正常对照组，病理模型组，每组各10只，除正常对照组、病理模型组外，其余各组均手术后经尾静脉连续给药14d。各组于造模后第14天处死动物，模型组第3天处死部分动物。动脉留取时剖开颈部，游离颈总动脉，向心端依次留取胸主动脉损伤血管病理标本l-2cm长，分别放入10%中性甲醛固定备用。将病理标本在10。/。中性甲醛液中固定24h后,逐级乙醇脱水，石蜡包埋，间断均匀切片(每片厚5pm)，制成组织切片备检。对病理切片进行常规HE染色，光学显微镜观察受损血管病理组织形态学改变，同时病理科协同采用彩色病理图像分析系统进行图像分析,测定血管内膜厚度。实验结果模型组即动脉脑血管内皮损伤后大鼠动脉血管形态，血管内膜脑血管内皮细胞缺如，管腔内凝血，血管内膜剥脱，血管管壁受损伤后缺损。损伤3d后可见动脉血管内膜被覆脑血管内皮细胞，内膜增厚，血管平滑肌细胞增生，血管腔变狭窄。损伤14d后动脉血管内膜被覆脑血管内皮细胞，内膜增厚，血管平滑肌细胞增生。丹参丹酚酸B组大鼠动脉血管内膜大部被覆有脑血管内皮细胞，内膜呈不均匀增厚，其中5只大鼠动脉内膜无明显增厚,增厚部内膜血管平滑肌增生，中膜层弹力纤维清晰，外膜未见异常。丹酚酸A高剂量组大鼠动脉血管管壁厚薄均匀，内膜被覆完整脑血管内皮细胞，内膜无增厚，中膜弹力纤维清晰，平滑肌细胞大小一致，外膜未见异常。实验六对主动脉脑血管内皮细胞障碍的影响实验方法5%戊巴比妥钠50mg/kg腹腔麻醉大鼠后，常规颈部皮肤碘酒和酒精消毒，剪开皮肤约2-3cm长，依次分离皮下组织、肌肉并暴露气管，在气管左侧游离左颈总动脉l-1.5cm，将远心端结扎，近心端用动脉夹钳夹后，于颈动脉远端做一切口，将2F球囊导管插入至腹主动脉，注入O.lml生理盐水使球囊扩张，然后回拉球囊至左颈总动脉与胸主动脉交叉处，回抽生理盐水后重新送回导管，在3个相隔120。的方向各重复3次共9次，最后拔出导管，结扎左颈总动脉，缝合皮下脂肪及皮肤切口。假手术组不插人球囊导管，其余步骤同上。丹酚酸A组从术前7d至术后14d每日灌胃给药，剂量为20mg/kg/d，丹参丹酚酸B组组从术前7d至术后14d每日灌胃给药，剂量为20mg/kg/d。取材及处理术后14天，所有大鼠用5%戊巴比妥钠腹腔麻醉处死，快速开胸，小心取胸主动脉段2cm投于10%福尔马林固定液中，然后脱水、透明、石蜡包埋。形态学观察病理切片HE染色。光镜下观察血管内膜增生情况，用计算机图像分析系统测量大鼠胸主动脉段内膜面积、内膜覆盖率、内膜/中膜面积。实验结果见表3:<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>注与对照组比较"PO.01;与丹参丹酚酸B组比较井共PO.Ol实验六对家兔动脉血管成形术后胶原合成的影响实验方法健康雄性日本大耳兔，随机分为组损伤组(I组，n=6)，丹参丹酚酸B(剂量lmg/kg)+丹参酮11八组(剂量lmg/kg)，丹酚酸A组(剂量lmg/kg)及假手术组(仅结扎右颈外动脉)。前3组均用3.5F球囊导管行右颈总动脉内膜剥脱术。普通饲料喂养,自由饮水。用药组自术后第1d起灌胃给药，直至术后满28d。满28d后处死动物，自心脏取血5mL，取右颈总动脉损伤中段约15mm，用于病理形态学检查。实验结果见表4<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>注与损伤组比较"PO.01;与丹参丹酚酸B+丹参酮IIA组比较絲P0.01。实验结论通过上述实验表明，丹参丹酚酸A对脑血管内皮细胞障碍具有很好的治疗作用，充分说明丹参丹酚酸A具有治疗脑血管内皮细胞障碍的新用途。注本发明所要求保护的具体技术方案，不限于上述实施例所表达的技术方案的具体组合。权利要求1、丹参丹酚酸A在制备治疗脑血管内皮细胞功能障碍药物中的应用。2、根据权利要求1所述的丹参丹酚酸A在制备治疗脑血管内皮细胞功能障碍药物中的应用，其中丹参丹酚酸A含量大于等于50X且小于100%。3、根据权利要求1所述的丹参丹酚酸A在制备治疗脑血管内皮细胞功能障碍药物中的应用，其中丹参丹酚酸A含量大于等于90X且小于100%。4、根据权利要求1所述的丹参丹酚酸A在制备治疗脑血管内皮细胞功能障碍药物中的应用，其中丹参丹酚酸A为活性物质制备的药物制剂。5、根据权利要求4所述的丹参丹酚酸A在制备治疗脑血管内皮细胞功能障碍药物中的应用，其中药物制剂为单位剂量的片剂、胶囊剂、颗粒剂、微丸剂、滴丸剂、口服液剂、软胶囊剂、水针剂、粉针剂、输液剂。6、根据权利要求5所述的丹参丹酚酸A在制备治疗脑血管内皮细胞功能障碍药物中的应用，其中片剂、胶囊剂、颗粒剂、微丸剂、滴丸剂、口服液剂、软胶囊剂单位剂量为5—1000mg。7、根据权利要求5所述的丹参丹酚酸A在制备治疗脑血管内皮细胞功能障碍药物中的应用，其中水针剂、粉针剂、输液剂单位剂量为5—500mg。全文摘要本发明公开了丹参丹酚酸A一种新用途，即在制备治疗脑血管内皮细胞功能障碍药物中的应用，其中丹参丹酚酸A含量大于等于50％且小于100％，优选丹参丹酚酸A含量大于等于90％且小于100％，药效机理研究表明，丹参丹酚酸A对脑血管内皮细胞障碍具有很好的保护作用。文档编号A61P9/00GK101548966SQ20081010334公开日2009年10月7日申请日期2008年4月3日优先权日2008年4月3日发明者李志刚,林治荣,栗艳彬,鄯慧珍,群顾申请人:北京本草天源药物研究院