核重新编程因子的制作方法
【专利摘要】作为用于不利用胚和ES细胞而诱导分化细胞的重新编程，简便且再现性强地建立具有与ES细胞同样的多能性和增殖能力的诱导式多能性干细胞的方法，本发明提供了含有下述3种基因：Oct家族基因、Klf家族基因和Myc家族基因的各基因的产物的体细胞的核重新编程因子。
【专利说明】核重新编程因子
[0001]本申请是申请日为2006年12月06日、申请号为200680048227.7的同名申请的
分案申请。
【技术领域】
[0002]本发明涉及具有使分化的体细胞重新编程来诱导诱导式多能性干细胞的作用的核重新编程因子(nuclear reprogramming factor)。
【背景技术】
[0003]胚胎干细胞(ES细胞)是由人和小鼠的初期胚建立的干细胞，具有能长期进行培养并维持可以分化成存在于生物体中的所有类型细胞的多能性的特征。人们期待利用该性质将人ES细胞作为针对帕金森病、青少年糖尿病、白血病等多种疾病的细胞移植疗法的来源。但是，存在着ES细胞的移植与脏器移植同样会引起排斥反应这样的问题。而且，对于通过破坏人胚胎建立的ES细胞的利用，出于伦理的观点的反对意见也很多。如果能够诱导患者自身的分化体细胞脱分化，建立具有接近于ES细胞的多能性和增殖能力的细胞(该细胞在本说明书中被称为“诱导式多能性干细胞”(iPS细胞)，但也存在被称为“胚胎干细胞样细胞”或“ES样细胞”的情况)的话，则预期能够利用它们作为没有排斥反应和伦理性问题的理想的多能性细胞。
[0004]作为使体细胞核重新编程的方法，已报道了，例如，从将体细胞的核移植到卵细胞中制备的克隆胚中 建立ES细胞的技术(ff.S.Hwang等，Science, 303，pp.1669-74，2004 ;ff.S.Hwang等,Science, 308, pp.1777-83，2005:但是，现已清楚了这些论文都是捏造的，而且已于日后撤下这些论文)。然而，这些技术只是为了建立ES细胞的目的而制备克隆胚，因此与使用不孕治疗中产生的剩余胚的常规ES细胞相比，伦理的问题反而大。而且，现已报道了通过使体细胞与ES细胞相融合使体细胞核重新编程的技术(M.Tada等，Curr.Biol.，11, pp.1553-1558，2001 ;C.A.Cowan 等，Science, 309, pp.1369-73，2005)。但是，即使在该方法中也存在以下问题:无法解决由于导致最终使用人ES细胞而产生的伦理性问题。而且，现已报道了使生长于人中的生殖细胞肿瘤来源的细胞株的提取物和分化细胞反应而使细胞核重新编程的技术(C.K.Taranger 等，Mol.Biol.Cell, 16，pp.5719-35，2005)。该方法，提取物中何种成分诱导重新编程完全不清楚，因此在技术的可靠性和安全性上存在问题。
[0005]另一方面，提出了筛选具有使分化的体细胞重新编程来诱导诱导式多能性干细胞的作用的核重新编程因子的方法(国际公开W02005/80598)。该方法包括以下步骤:使含有在受ECAT (ES cellassociated transcript)基因(ES细胞中特异性表达的基因群:ES细胞相关转录物)的表达调节区域的表达调节位置上存在标记基因的基因的体细胞与被检物质相接触、研究标记基因表达细胞的出现的有无，选择使该细胞出现的被检物质作为体细胞的核重新编程因子的候选物。而且，该出版物的实施例6等中公开了使体细胞重新编程的方法。但是，上述出版物中没有公开实际上鉴定核重新编程因子的报告。[0006]专利文献I国际公开TO2005/80598
【发明内容】
[0007]本发明的课题在于提供核重新编程因子。更具体的是，本发明的课题在于提供用于不利用卵细胞、胚和ES细胞而诱导分化细胞的重新编程，简便且再现性强地建立具有与ES细胞同样的多能性和增殖能力的诱导式多能性干细胞的方法。
[0008]本
【发明者】为了解决上述的课题进行了积极的研究，使用国际公开W02005/80598中记载的核重新编程因子的筛选方法尝试鉴定核重新编程因子。其结果是，发现了 24种候选作为与核重新编程相关的基因，确认了它们中的3种基因是核重新编程所必需的基因。本发明是基于上述发现而完成的。
[0009]也就是，根据本发明，提供了一种体细胞的核重新编程因子，其含有下述3种基因:Oct家族基因、Klf家族基因和Myc家族基因的各基因的产物。根据本发明的优选方式，提供了含有下述3种基因:0ct3/4、Klf4和c-Myc的各基因的产物的上述因子。
[0010]而且，根据其它的优选方式还提供了还含有下述基因:Sox家族基因的基因产物的上述因子，作为更优选的方式，提供了含有Sox2的基因产物的上述因子。
[0011]而且，如果根据其它的优选方式，提供了含有细胞因子，该细胞因子和Myc家族基因的基因产物共同存在、或代替Myc家族基因的基因产物。作为更优选方式，提供了细胞因子为碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和/或干细胞因子(SCF)的上述因子。
[0012]如果根据 特别优选的方式，提供了除Oct家族基因、Klf家族基因、Myc家族基因、和Sox家族基因的各基因的产物之外，还含有TERT基因的基因产物的体细胞的核重新编程因子；以及除了 Oct家族基因、Klf家族基因、Myc家族基因、Sox家族基因，和TERT基因的各基因的产物之外，还含有从由下述的基因:SV40大T抗原、HPV16E6、HPV16E7和Bmil构成的组中选出的一种以上的基因产物的因子。
[0013]除了这些因子，还提供了进一步含有选自于下组中的I种以上的基因的基因产物的上述的因子:Fbxl5、Nanog、ERas、ECAT15-2、Tcll 和 β -连环素(catenin)。
[0014]而且，如果根据上述发明的其它优选方式，还提供了进一步含有选自于下组中的I种以上的基因的基因产物的上述的因子，所述组为:ECAT1、EsgU Dnmt3L、ECAT8、Gdf3,Soxl5、ECAT15-l、Fthll7、Sall4、Rexl、UTFl、Stella、Stat3和 Grb2。
[0015]从其它的观点出发，本发明提供了通过体细胞的核重新编程制备诱导式多能性干细胞的方法，该方法包括使上述的核重新编程因子与体细胞接触的步骤。
[0016]如果根据本发明的优选方式，提供了包括在体细胞的培养物中添加上述的核重新编程因子的步骤的上述方法；包括在体细胞中导入编码上述的核重新编程因子的基因的步骤的上述方法；包括使用含有至少I种以上的编码上述核重新编程因子的基因的重组载体将该基因导入体细胞中的步骤的上述方法；和使用从患者中采集的体细胞作为体细胞的上述方法。
[0017]再从其它的观点出发，本发明提供了由上述方法获得的诱导式多能性干细胞。而且，本发明还提供了诱导上述的诱导式多能性干细胞分化而得到的体细胞。
[0018]而且，根据本发明，还提供了一种干细胞疗法，该方法包括将对诱导式多能性干细胞进行分化诱导而获得的体细胞移植到该患者中的步骤，所述诱导式多能性干细胞是通过使用从患者中分离和采集的体细胞用上述方法获得的。
[0019]而且，本发明还提供了使用对由上述方法获得的诱导式多能性干细胞进行分化诱导而获得的各种细胞来评价化合物、药物、毒物等的生理作用和毒性的方法。
[0020]而且，本发明提供了一种改善细胞的分化能力和/或增殖能力的方法，该方法包括使上述的核重新编程因子与细胞接触的步骤，以及提供了由上述方法获得的细胞和对由上述方法获得的细胞进行分化诱导而得到的体细胞。
[0021]通过使用由本发明提供的核重新编程因子，不利用胚和ES细胞就可以简便且再现性强地诱导分化细胞核的重新编程，可以建立与ES细胞具有同样的分化和多能性和增殖能力的未分化细胞-诱导式多能性干细胞。例如、使用本发明的核重新编程因子能够由患者自身的体细胞制备具有高增殖能力和分化多能性的诱导式多能性干细胞，通过使该细胞分化而获得的细胞(例如心肌细胞、胰岛素产生细胞、或神经细胞等)可以应用于针对心力衰竭、胰岛素依赖性糖尿病、帕金森病和脊髓损伤等多种疾病的干细胞移植疗法中，由此可以回避使用人胚的伦理问题以及移植后的排斥反应，因此极为有用。而且，可以使诱导式多能性干细胞分化的各种细胞(例如心肌细胞、肝细胞等)，作为用于评价化合物、药物、毒物等的药效和毒性的系统极为有用。
附图简述
[0022]图1是表示使用在Fbx15基因中敲入了 β geo的小鼠的胎儿成纤维细胞(MEF)的重新编程因子的筛选方法的图。
[0023]图2是表示通过导入表1中所示的24个基因而获得的iPS细胞的形态的照片。还显示了分化细胞(MEF)和正常的胚胎干细胞(ES)的形态作为对照。
[0024]图3是表示iPS细胞中标记基因的表达的图。显示了以从iPS细胞、ES细胞和MEF细胞中提取的总RNA作为模板进行RT-PCR获得的结果。
`[0025]图4是表示iPS细胞中DNA甲基化状态的图。对从iPS细胞、ES细胞、和MEF细胞提取的基因组DNA进行亚硫酸盐处理，对目的DNA进行PCR扩增后，插入于质粒。每个基因分离出10个克隆的质粒，测定序列。甲基化CpG用黑点表示，非甲基化CpG用白点表示。
[0026]图5是表示通过24个基因的群、和从24个基因的群中每次除去I个基因后的23个基因的群的导入获得的G418细胞的克隆数的图。图下侧表示G418选择后一周内获得的集落数，图上侧表示3周内获得的集落数。当除去用四方形围起来的基因(基因的编号与表I所示的相同)时，完全没有获得集落，或是在3周后只发现少数集落。
[0027]图6是表示通过10个基因的群、和从10个基因的群中每次除去I个基因后的9个基因的群的导入而获得的G418细胞的集落数的图。除了 #14、#15、或#20的各基因时一个集落都没有获得。当除去#22的基因时，获得了少数的G418抗性集落，但是细胞呈现出分化的形态，其明显与iPS细胞不同。
[0028]图7是表示由10个基因的群、4个基因的群、3个基因的群、或2个基因的群产生的G418抗性集落(重新编程集落)的出现数的图。显示了各集落的代表性形态及大小。
[0029]图8是表示对将MEF来源的iPS细胞移植到裸鼠皮下形成的肿瘤进行苏木精一曙红(H&E)染色的结果的照片。发现了三胚层系向各种组织的分化。
[0030]图9是表示通过将成体皮肤成纤维细胞来源的iPS细胞移植到小鼠胚泡中，移植到假孕小鼠的子宫中制备的胎儿的照片。由上图可知在左侧的胎儿中来源于iPS细胞的细胞(发出绿色荧光)分布于全身。在下图中清楚了同一胎儿的心脏、肝脏、脊髓的几乎全部细胞为GFP阳性，其源于iPS细胞。
[0031]图10是表示通过RT-PCR确认ES细胞标记基因的表达的结果的照片。图中，Sox2minus表示在MEF中导入3个基因而建立的iPS细胞，4ECAT表示在MEF中导入4个基因而建立的iPS细胞，10ECAT表示在MEF中导入10个基因而建立的iPS细胞，10ECAT皮肤成纤维细胞表示在皮肤成纤维细胞中导入10个基因而建立的iPS细胞，ES细胞表示小鼠ES细胞，MEF表示没有进行基因导入的MEF细胞。其下的编号表示克隆编号。
[0032]图11是表示在由MEF建立iPS细胞中bFGF的效果的图。在常规的饲养细胞(ST0细胞)(左)和导入了 bFGF表达载体的STO细胞(右)上培养的Fbxl50ge°/ege°小鼠来源的MEF中通过逆转录病毒导入4个因子(上部分)或c-Myc以外的3个因子(下部分)。2周内通过G418进行选择，经晶体蓝染色后，拍照。数字表示集落数。
[0033]图12是对采用Nanog-EGFP-1RES-Puro小鼠的实验进行说明的图。A.分离在中心含有小鼠Nanog基因的大肠杆菌人工染色体(BAC)，在Nanog的编码环形区域的上游通过重组插入EGFP-1RES-Puro盒。B.用改良的BAC制备转基因小鼠。发现GFP的表达局限于胚泡的内细胞团块和生殖腺中。
[0034]图13是表示对使用Nanog-EGFP-1RES-Puro小鼠的实验进行说明的图。从Nanog-EGFP-1RES-Puro小鼠的胎儿(受精后13.5日)中除去头部、内脏和生殖腺，建立MEF。用细胞分选器进行分析的结果是，即使在Nanog-EGFP-1RES-Puro小鼠来源的MEF (Nanog)中，与Fbxl50ge°/ ege。小鼠来源的MEF (Fbxl5)和野生型小鼠来源的MEF (Wild)同样，几乎不存在GFP阳性细胞。
[0035]图14 是由 Nanog-EGFP-1RES-Puro 小鼠 MEF(左)和 Fbxl5ege°/fige。小鼠 MEF(右)建立的iPS细胞的照片。分别用嘌呤霉素和G418进行选择。
[0036]图15是表示iPS细胞的增殖的结果的图。表示将ES细胞、Nanog-EGFP-1RES-Puro小鼠MEF (左)来源的iPS细胞(Nanog iPS)和Fbx150 geo/0 geo小鼠MEF来源的iPS细胞(FbxiPS)各10万个分别接种于24孔板中，每3天进行一次传代，测定细胞数的结果。数字表示加倍时间的平均。
[0037]图16是表示iPS细胞的基因表达的图。用RT-PCR分析标记基因在MEF、ES细胞、Nanog-EGFP-1RES-Puro 小鼠 MEF(左)来源的 iPS 细胞(Nanog iPS)和 Fbxl50geo/figeo 小鼠MEF来源的iPS细胞(Fbx iPS)中的表达。下面的数字表示传代数。
[0038]图17是表示由Nanog iPS细胞形成畸胎瘤的图。显示在裸鼠的背部皮下注射100万个ES细胞或Nanog iPS细胞，3周后产生的肿瘤的外观(左)和组织图像(右:H&E染色)。
[0039]图18是表示用Nanog iPS细胞制备嵌合体小鼠的图。将Nanog iPS细胞(克隆NPMF4EK-24，传代数6)移植于胚泡中，诞生出嵌合体小鼠。由90个移植胚诞生出4只嵌合体小鼠。
[0040]图19是表示由Nanog iPS细胞出发的种系传递(germline transmission)的图。对通过图18所示的嵌合体小鼠与C57BL/6小鼠的交配所诞生的小鼠进行基因组DNA的PCR分析时，根据在所有的小鼠中存在0ct3/4和Klf4的转基因，确认了种系传递。
[0041]图20是表示由iPS细胞向神经细胞的分化诱导的图。显示由来源于皮肤成纤维细胞的iPS细胞在体外分化成的神经细胞(上:β III微管蛋白阳性)、寡突胶质细胞(左:04阳性)、星形胶质细胞(右:GFAP阳性)。
[0042]图21是表示对不使用药物选择的iPS细胞的建立进行说明的图。在每个IOcm皿中接种I万至10万个MEF，通过逆转录病毒导入4个因子。对照(Mock)中没有产生集落(左)，而导入了 4个因子的皿中，除了扁平的转化集落，还获得了与膨胀的iPS细胞相类似的集落(中央)。一旦将这些细胞传代培养，就获得了与iPS细胞相类似的细胞(右)。
[0043]图22是表示通过无药物筛选建立的细胞的基因表达的图。从图21中所示的建立的细胞中提取RNA，用RT-PCR分析ES细胞标记基因的表达。
[0044]图23是表示人成纤维细胞来源的iPS细胞样细胞的图。显示了通过逆转录病毒将4个因子的人同源基因导入于人胎儿来源的成纤维细胞中而获得的集落(左)、和2次传代后的细胞(右)。
[0045]图24是表示由人成体皮肤成纤维细胞建立iPS细胞的图。通过逆转录病毒将左边部分所示的因子导入到用慢病毒感染了小鼠逆转录病毒受体的人成体皮肤成纤维细胞中。照片表示病毒感染后第8天的相位差图像(物镜X 10)。
[0046]用于实施发明的最佳方式
[0047]本发明的核重新编程因子的特征在于含有下述3种基因:0ct家族基因、Klf家族基因和Myc家族基因的各基因的产物，在优选方式中，特征在于除了上述的3种基因之外还含有Sox家族基因的基因产物。
[0048]作为确认本发明的核重新编程因子的方法，可以利用例如、国际公开W02005/80598中记载的核重新编程因子的筛选方法。通过参照上述出版物的所有公开的内容，包含于本说明书的公开内容中。本领域人员参照上述出版物筛选核重新编程因子，可以确认本发明的重新编程因子的存在和作`用。
[0049]例如,可以利用Fbxl5基因座中敲入了 Pgeo ( β半乳糖苷酶和新霉素抗性基因的融合基因)的小鼠作为容易观察重新编程现象的实验系统。详细内容示于本说明书的实施例中。小鼠Fbxl5基因是在ES细胞和早期胚等的分化多能性细胞中特异性表达的基因。在小鼠Fbxl5基因中敲入Pgeo的且缺失Fbxl5的功能的同源变异小鼠中，通常没有观察到包括分化多能性或发生在内的异常的表现型。在该小鼠中，Pgeo受到Fbxl5基因的增强子和启动子的表达控制，Pgeo在分化的体细胞中不表达，显示出对G418的敏感性。另一方面，敲入了 β geo的同源变异ES细胞显示出对极高浓度(12mg/ml以上)的G418的抗性。利用该现象，可以构建使体细胞的重新编程可视化的实验系统。
[0050]利用上述实验系统，可以首先从敲入了 Pgeo的同源变异小鼠的胎儿(受精后13.5天)中分离成纤维细胞(Fbxl50ge°/ege°的MEF)。由于MEF不表达Fbxl5基因，因此也不表达β geo，表现出对G418的敏感性。可是，一旦该MEF与没有进行基因操作的ES细胞(仍然呈现对G418的敏感性)相融合，MEF的核进行重新编程的结果是，表达β geo而形成G418抗性。因此，通过利用该实验系统，可以置换成G418抗性使重新编程现象可视化。
[0051]可以使用上述的实验系统选择核重新编程因子。作为与核重新编程因子相关的基因的候选物，选择出多个显示出在ES细胞中特异性表达的基因和提示在ES细胞的分化多能性维持中起重要作用的基因，通过这些候选物单独或适当组合可以确认是否引出核重新编程。例如，通过组合所有的选择出的初次候选物，确认可以将分化细胞重新编程诱导至接近ES细胞的状态后、制备从前述组合中每次除去I个基因的组合，确认同样的作用，可以选择该基因不存在时重新编程诱导能力减弱，或重新编程诱导能力丧失的二次候选物。对于这样选择出的二次候选物，通过重复同样的步骤，可以选择出必需的核重新编程基因的组合，可以确认Oct家族基因、Klf家族基因和Myc家族基因的3种基因的基因产物的组合作为核重新编程因子起作用，除了这3种基因的基因产物，还可以确认Sox家族基因的基因产物的组合作为核重新编程因子具有极好的性质。核重新编程因子的选择方法的具体例子具体示于本说明书的实施例中，本领域技术人员参照上述的一般的说明和实施例的具体性说明可以容易地确认这3种基因的组合诱导体细胞的重新编程，和这3种基因产物的组合对于核重新编程是必需的。
[0052]由本发明提供的核重新编程因子至少含有Oct家族基因、Klf家族基因和Myc家族基因的基因产物的组合，包括例如0ct3/4、Klf4和c-Myc这3种基因的基因产物的组合。作为Oct家族基因，可以例举例如0ct3/4、0ctlA和0ct6等。0ct3/4是属于POU家族的转录因子，据报道其是未分化标记(K.0kamoto等，Cell, 60，pp461-72，1990)。而且，还有报告指出0ct3/4与多能性维持相关(J.Nichols等，Cell, 95，pp379_91，1998)。作为Klf家族基因，可以例举 Klfl、Klf2、Klf4 和 Klf5 等。据报道 Klf4 (Kruppel like factor-4)是肿瘤抑制因子(A.M.Ghaleb等，Cell Res.，15，pp92_6，2005)。作为Myc家族基因，可以例举c-Myc>N-Myc和L-Myc等。有报道指出c_Myc是与细胞的分化和增殖相关的转录控制因子(S.Adhikary, M.Eilers, Nat.Rev.Mol.Cell Biol.，6，pp635_45, 2005)，且与多能性维持相关(P.Cartwright 等,Development, 132, pp885_96, 2005)。0ct3/4、Klf4 和 c-Myc 以外的各家族基因的NCBI登录号如下所示。
[0053]表1
[0054]小鼠人
[0055]
【权利要求】
1.制备诱导式多能性干细胞的方法，其包括下述步骤(1) - (3): (I)从下面选择基因的组合: (1)在胚胎干细胞表现出特异性或者闻表达的基因； (ii)编码由fct信号或LIF信号激活的因子的基因； (iii)在胚胎干细胞的分化多能性维持中起重要作用的基因；和 (iv)上述基因的豕族基因； 其中，当将所述的基因的组合导入到体细胞的时候，该基因的组合造成内源性Oct3/4基因、Nanog基因在体细胞内的表达； (2)将步骤(1)中选择的基因的组合导入到体细胞中，并且 (3)培养 步骤(2)获得的细胞。
【文档编号】C12N5/074GK103773804SQ201410006027
【公开日】2014年5月7日 申请日期:2006年12月6日 优先权日:2005年12月13日
【发明者】山中伸弥 申请人:国立大学法人京都大学