青蒿MYB类转录因子编码序列AaMIXTA1及应用
【专利摘要】本发明公开了一种青蒿MYB类转录因子编码序列AaMIXTA1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，该编码序列编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。本发明的编码序列编码MYB类转录因子AaMIXTA1，正调控青蒿分泌型腺毛的密度；利用转基因技术将青蒿AaMIXTA1转录因子过量表达载体稳定转化青蒿可以有效提高青蒿表皮的分泌型腺毛密度，从而提高转基因青蒿的青蒿素的含量；利用转基因技术将青蒿AaMIXTA1转录因子干扰载体稳定转化青蒿可以有效降低青蒿表皮的分泌型腺毛密度，从而降低转基因青蒿的青蒿素的含量。该发明对于为青蒿素的规模化生产提供高产、稳定新药源具有重要意义。
【专利说明】
青富MYB类转录因子编码序列AaM IXTA1及应用
技术领域
[0001] 本发明设及基因工程技术领域，具体设及一种青葛MYB类转录因子编码序列 AaMIXTAl及其应用。
【背景技术】
[0002] 青葛(Artemisia annua L.)是菊科葛属一年生草本植物。其地上部分所提取的含 有过氧桥的倍半祗内醋氧化物青葛素，是目前应用最广泛，治疗效果最好的抗追疾药物，特 别是对脑型追疾和抗氯哇追疾更加有效。目前，青葛素联合疗法（Ar tends in in-based combination therapies,ACTS)是世界卫生组织W册推荐的最有效的治疗追疾的方法。但其 青葛素在植物青葛中的含量低，尚无法完全满足全球的市场每年200吨的需求。青葛具有分 泌型腺毛（glandular trichomes)和非分泌型腺毛(non-glandular trichomes)。在青葛叶 片的正面和背面、茎杆、花上都存在大量分泌型腺毛，运里是大量次生代谢物的合成和储存 场所，包括挥发油、Q-羡締、精脑、青葛酬等，此外还含有黄酬类化合物，青葛素也被认为储 存于此处。
[0003] 表皮毛是一种植物表皮细胞特化出来的结构。根据其功能可W分为简单腺毛和多 细胞分泌型腺毛。简单腺毛可W保护植物不被食草动物和昆虫哨食，增加光线反射，降低叶 表面溫度等功能；多细胞分泌型腺毛具有分泌存储多种植物次生代谢产物的功能。在拟南 芥模式植物中简单腺毛发育机制已经被深入研究，但是对于多细胞分泌型腺毛的发育机制 模型并没有被报道。在拟南芥中，glUGLABROUS 1)功能丧失突变体表现为表皮毛显著减 少，GL1被认为是表皮毛发育起始的关键转录因子。GL1能够直接与两个bHLH类转录因子 (GL3和EGL3)互作，它们都能与一个WD40类蛋白TTGl相互作用。因此，GL1/GL3化化3VTTG1 形成了一个复合体，该复合体能够正调控拟南芥表皮毛的形成。但是研究较多的与多细胞 腺毛发育相关转录因子是MYB类转录因子MIXTA，在许多物种中MIXTA类似基因都被克隆出 来，金鱼草的AmMIXTA属于R2R3MYB家族的转录因子调控金鱼草花瓣裂片上锥形乳突的发 育。
[0004] 目前研究证明青葛素只在青葛分泌型腺毛内合成和胆存，因此研究青葛分泌型腺 毛的发育机制对于提高青葛素含量有着重要的研究意义。而在次生代谢领域，关于多细胞 分泌型腺毛的报道还比较少。而青葛中的影响分泌型腺毛密度的调控机制的相关报道还很 少。
【发明内容】
[0005] 有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明通过青葛分泌型腺毛转录组数据库的MYB转 录因子的分析，从青葛中克隆出可W调控青葛腺毛密度的转录因子，利用基因工程手段提 高青葛叶片分泌型腺毛密度，从而提高青葛中青葛素含量。本研究发明从青葛中克隆了一 个AaMIXTAl基因，利用转基因技术将青葛AaMIXTAl转录因子过量表达载体转化青葛可W有 效提高青葛表皮的分泌型腺毛密度，从而提高转基因青葛的青葛素的含量;利用转基因技 术将青葛AaMIXTAl转录因子干扰载体转化青葛可W有效降低青葛表皮的分泌型腺毛密度， 从而降低转基因青葛的青葛素的含量。该发明对于为青葛素的规模化生产提供高产、稳定 新药源具有重要意义。
[0006] 本发明具体通过W下技术方案实现：
[0007] 本发明提供了一种青葛MYB类转录因子编码序列AaMIXTAl,其核巧酸序列如SEQ ID NO. 1 所示。
[000引编码序列AaMIXTAl编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0009] 本发明还提供了一种多肤，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0010] 本发明还提供了一种重组表达载体，其包含如SEQ ID NO. 1所示的核巧酸序列。其 中该重组表达载体可通过本领域常规方法获得，即：将本发明所述的核酸分子连接于各种 表达载体上构建而成。该表达载体为本领域常规的各种载体。该载体较佳地包括:各种质 粒、粘粒、隧菌体或病毒载体等，本发明所述载体优选地为质粒载体。
[0011] 本发明还提供了一种重组表达转化体，其包含如SEQ ID NO. 1所示的核巧酸序列。 其中重组表达转化体的制备方法较佳地为：将上述重组表达载体转化至宿主微生物中制 得。宿主微生物较佳地为本领域常规的各种宿主微生物，只要能满足使上述重组表达载体 稳定地自行复制，且所携带的编码MYC2转录因子蛋白基因可被有效表达即可。其中所述宿 主微生物较佳地为:大肠杆菌D册a，根癌农杆菌EHA105。将前述重组表达载体转化至大肠杆 菌D册a,根癌农杆菌邸4105中，即可得本发明优选的基因工程菌株。本发明转化体中包含前 述的载体。
[0012]本发明还提供了上述青葛MYB类转录因子编码序列AaMIXTA巧提高青葛素含量中 的应用。
[0013] 本发明还提供了一种提高青葛中青葛素含量的方法，包括W下步骤：
[0014] 步骤1、对青葛分泌型腺毛转录组数据库MYB类转录因子分析，从青葛CDNA文库中 克隆得到青葛MB类转录因子AaMIXTAl;
[001引步骤2、将上述AaMIXTAl基因可操作性地连接于表达调控序列，形成含AaMIXTAl基 因的植物过表达载体；
[0016] 步骤3、将含AaMIXTAl基因的植物过表达载体转化宿主菌株，优选为根癌农杆菌， 得到具有上述过表达载体的菌株；
[0017] 步骤4、利用步骤3中构建的菌株转化青葛，经抗生素筛选得到抗性苗，再经PCR检 测为阳性的植株即为转基因青葛；
[0018] 步骤5、对步骤4中得到的转基因青葛进行分泌型腺毛密度统计，得到分泌型腺毛 密度显著提高的转基因青葛，进而得到青葛素含量提高的青葛植株。
[0019] 本发明还提供了一种调节青葛中青葛素含量的方法，包括W下步骤：
[0020] 步骤1、对青葛分泌型腺毛转录组数据库MYB类转录因子分析，从青葛CDNA文库中 克隆得到青葛MB类转录因子AaMIXTAl;
[0021] 步骤2、将上述AaMIXTAl基因可操作性地连接于表达调控序列，形成含AaMIXTAl基 因的植物过表达载体和RNA干扰表达载体；
[0022] 步骤3、将含上述AaMIXTAl基因的植物过表达载体和RNA干扰表达载体分别转化宿 主菌株，得到具有上述植物过表达载体和上述RNA干扰表达载体的菌株；
[0023] 步骤4、利用步骤3中构建的菌株转化青葛，通过抗生素筛选，获得含有青葛MYB类 转录因子编码序列AaMIXTAl的转化细胞，再生转基因植株，上述过表达AaMIXTAl转基因植 株的分泌型腺毛数量显著提高，从而青葛素含量得到提高;干扰AaMIXTAl转基因植株的分 泌型腺毛数量显著降低，从而青葛素含量降低。
[0024] 本发明通过对青葛分泌型腺毛转录组数据库MYB类转录因子分析，从青葛中克隆 AaMIXTAl基因，构建含AaMIXTAl基因的植物过表达和干扰表达载体，优选用根癌农杆菌 EH105介导，采用叶盘法将AaMIXTAl基因过表达和干扰表达载体转化青葛;PCR检测外源目 的基因 AaMIXTAl的整合情况，通过巧光显微镜观察和统计分泌型腺毛密度，获得了分泌型 腺毛密度显著提高的转基因青葛;高效液相色谱-蒸发光散射检测器化PLC-ELSD)测定青葛 中青葛素含量，表明获得的青葛表皮分泌型腺毛密度显著提高的转基因青葛中的青葛素含 量也显著提高。
[0025] 如本文所用，"可操作地连于"指运样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影 响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肤DNA作为前体表达并参与多肤的分 泌，那么信号肤（分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肤DNA;如果启动子控制序列的转 录，那么它是可操作地连于编码序列;如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那 么它是可操作地连于编码序列。一般，"可操作地连于"意味着相邻，而对于分泌前导序列则 意味着在阅读框中相邻。
[0026] 本发明中所设及的农杆菌为根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens)菌株 拙105，该菌株可W从市场上公开购买（来源于澳大利亚CAMBIA公司，菌株编号为Gambar Do
[0027] W下将结合附图对本发明作进一步说明，W充分说明本发明的目的、技术特征和 技术效果。
【附图说明】
[0028] 通过阅读参照W下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、 目的和优点将会变得更明显：
[0029] 图Ia示出了 AaMIXTAl基因过量表达载体构建图谱，图化示出了其RNA干扰载体构 建图谱；
[0030] 图2示出了在青葛中过量表达和抑制AaMIXTAl基因的结果，显示其正调控了分泌 型腺毛密度；
[0031] 图3示出了在青葛中过量表达和抑制AaMIXTAl基因的结果，其正调控了青葛中青 葛素含量。
【具体实施方式】
[0032] 下面对本发明的实施例作详细说明：本实施例在W本发明技术方案为前提下进行 实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施 例。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克 隆：实验室手册(New York = Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件， 或按照制造厂商所建议的条件。
[00扣]实施例1、青葛AaMYBLl基因的克隆
[0034] 1.青葛基因组总RNA的提取
[0035] 取青葛叶片组织，置于液氮中研碎，加入盛有裂解液的1.5mL Eppendo计离屯、管 中，充分振荡后，按照TIANGEN试剂盒的说明书抽提总RNA。用琼脂糖胶电泳鉴定总RNA质量， 然后在分光光度计上测定RNA含量。
[0036] 2.青葛AaMIXTAl基因的克隆
[0037] W所提取的总RNA为模板，在PowerScript反转录酶的作用下合成cDNA;根据 AaMIXTAl基因的序列设计基因特异性引物，如表1所示，通过PCR从总CDNA中扩增AaMIXTAl 基因，并测序。
[0038] 通过上述步骤，获得了青葛中该转录因子的全长编码序列（SEQ ID NO: 1)并推导 出其蛋白编码序列(SEQ ID NO:2)，其中，起始密码子为ATG，终止密码子为TAA。
[0039] 要 IPrR 引物I
[0040]
[0041]
[0042]
[00创 实施例2、含AaMIXTAl基因的植物过量表达载体的构建
[0044] 将AaMIXTAl基因构建在过量表达载体上，为了方便表达载体的构建，正向引物中 引入了 BamHI的酶切位点，反向引物中引入了XbaI的酶切位点，AaMIXTAl基因过量表达载体 构建图谱示于图Ia，引物如表3所示；
[0045] 表3AaPDR 1-P皿载体构建的PCR引物
[0046]
[0u4/」 乂施W d、'式AaMiA IAi驻囚的但'物-TdT兀衣化執悴的勾足
[004引 1.中间载体祀NTY-AaMIXTAl的构建
[0049] 在AaMIXTAl基因的非保守区域设计上游引物和下游引物，用W构建干扰载体。在 上游引物ATG碱基前添加 CACC四个碱基W构建Gateway入口载体。按照Invitrogen公司 祀NTRT7D-TOPa?Cloning Kit的操作步骤，先用平端酶扩增得到AaMIXTAl的片段，回收 纯化后通过Gateway克隆技术连接到祀NTR/D-T0P0载体。
[0050] 2.植物表达干扰载体抑E化SGATE12-AaMIXTAl的构建
[0化1 ] 按照Invitrogen公司的LRClonase忠 II化巧me试剂盒的操作，将祀NTR-AaMIXTAl 载体中的AaMIXTAl的干扰片段重组到RNA干扰载体P肥化SGATE12的两个可W形成发夹结构 的重组位点中，得到AaMIXTAl的RNA干扰载体抑E化SGATEl2-AaMIXTAl i。
[0052]本实施例将青葛AaMIXTAl基因可操作性地连接于表达调控序列，形成含AaMIXTAl 发卡结构的植物表达干扰载体，该载体可用于通过代谢工程策略来调控青葛中青葛素的含 量。RNA干扰载体构建图谱示于图化，所需引物如表4所示：
[0化3]表 4AaMIXTAl-Phellsgatel2 载体构建的 PCR 引物 [0化4]
[00巧]实施例4、根癌农杆菌介导的AaMIXTAl过表达和干扰载体遗传转化青葛获得转基 因青葛植株
[0056] 1.含AaMIXTAl过量表达和干扰表达载体的根癌农杆菌工程菌的获得
[0057] 将实施例2中含AaMIXTAl的植物双元干扰表达载体采用冻融法转入根癌农杆菌 (如邸A105,为市场有公开出售的生物材料，可W从澳大利亚GAMBIA公司购得，菌株编号为 Gambar 1)，并进行PCR验证。结果表明，含AaMIXTAl的植物双元干扰表达载体已成功并转化 到根癌农杆菌菌株中。
[0化引2.根癌农杆菌介导AaMIXTAl基因转化青葛 [0化9] 2.1.外植体的预培养
[0060] 青葛种子用75%乙醇浸泡Imin,再用20%化Cio浸泡20min，无菌水冲洗3-4次，用 无菌吸水纸吸干表面水分，接种于无激素的MS(Murashige and Skoog, 1962)固体培养基 中，25°C、1化/8h(li曲t/dark)光照培养，即可获得青葛无菌苗。待苗长至5cm左右后，剪取 无菌苗叶片外植体用于转化。
[0061] 2.2.农杆菌与外植体的共培养
[0062] 将所述的叶片外植体，转到共培养培养基（1/2MS+AS 100皿ol/L)中，滴加含活化 好的所述含AaMIXTAl植物过量表达和干扰表达载体的根癌农杆菌工程菌的1/2MS悬液，使 外植体与菌液充分接触，28 °C暗培养3d。W滴加在不带有目的基因的根癌农杆菌的1 /2MS液 体培养基悬液的叶片外植体为对照。
[0063] 2.3.抗性再生植株的筛选
[0064] 将所述的共培养3d的青葛外植体转入到发芽筛选培养基(MS+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.05mg/L+Hyg(过表达)/Kan(干扰)50mg/L+Cb 500mg/L)上于25 °C、1化/她光照培养，每两 周继代培养一次，经过2-3次继代后即可获得Hyg/Kan抗性丛生芽。将生长良好的抗性丛生 芽剪下转入生根培养基（1/2MS+饥125mg/L)上培养至生根，从而获得Hyg/Kan抗性再生青 葛植株。
[00化]3.转基因青葛植株的PCR检测
[0066] 根据目的基因所在表达盒上游的35S启动子区域和AaMIXTAl分别设计正向引物设 计（35SF:GAAGATGCCTCTGCCGACAGTG)和反向引 物（AaMIXTAl-RP: CCCATTCCTCTTCACATTCTTGATCACCC)对目的基因进行检测。结果表明，利用所设计的PCR特异 引物，能扩增出特异DNA片段。而W非转化青葛基因组DNA为模板时，没有扩增出任何片段。
[0067] 本实施例将所述的植物表达载体转化根癌农杆菌，获得用于转化青葛的含 AaMIXTAl植物过量表达和干扰表达载体的根癌农杆菌菌株，利用所构建的根癌农杆菌菌株 转化青葛，获得经PCR检测的转基因青葛植株。转基因青葛植株的获得为筛选获得较高青葛 素含量的青葛株系提供了直接素材。
[00側实施例5、转基因青葛表皮腺毛密度和总腺毛数量的统计
[0069] 使用奥林己斯公司的BX51型号显微镜，在波长为450nm-480nm的激发光下观察非 转基因青葛和转AaMIXTAl过量表达和干扰载体青葛的叶片。取同等大小的青葛叶片，在不 同的5个位置随机取样，统计腺毛密度。Image J软件测量青葛叶片总面积，计算得到每个叶 片总腺毛密度。
[0070] 在本发明中AaMIXTAl过量表达青葛的腺毛密度显著提高;AaMIXTAl干扰青葛的腺 毛密度显著降低。图2示出了在青葛中过量表达和抑制AaMIXTAl基因的结果，显示其正调控 了分泌型腺毛密度。
[0071] 实施例6、利用HPLC-ELSD测定转基因青葛中青葛素含量
[0072] 1 .HPLC-ELSD条件及系统适用性W及标准溶液的配制
[0073] HPLC:采用water alliance 2695系统，色谱柱为C-18反相硅胶柱 (SymmetirSiieldTM C18，5皿，250 X4.6mm，Waters)，流动相为甲醇：水，甲醇：水的体积比 为70: 30，柱溫30°C，流速1. OmL/min，进样量1化L，灵敏度(AUFS = 1.0)，理论塔板数按青葛 素峰计算不低于2000。
[0074] ELSD:采用water alliance 2420系统，蒸发光散射检测器漂移管溫度40°C，放大 系数(gain)为7,载气压力化ar;
[0075] 精密称取青葛素标准品（Sigma公司）2.Omg用ImL甲醇完全溶解，得到2mg/mL青葛 素标准品溶液，保存于-20°C备用。
[0076] 本发明中流动相为甲醇(methanol):水，比例为70% :30%时，青葛素的保留时间 为5. Imin,峰型良好。理论塔板数按青葛素计算不低于2000。
[0077] 2.标准曲线的制作
[0078] 将所述对照品溶液在相应色谱条件下分别进样化1，钮1，化1，祉1，IOiil记录图谱 及色谱参数，分别W峰面积(Y)对标准品含量(X，yg)进行回归分析。通过研究，本发明中青 葛素在4-20yg范围内呈现良好的log-log线性关系。青葛素对照品的log-log线性回归方程 为：Y= 1.28e+000X+4.71e+000，R = 0.979546。
[0079] 3.样品的制备和青葛素含量的测定
[0080] 在青葛植株的上，中和下部共取2g新鲜的青葛叶片，于45°C烘箱中烘至恒重。然后 从烘干的枝条上敲下叶和花蕾，磨成粉末。称取约0.1 g干粉于2mL Eppendorf管中，加入2mL 乙醇，用40W超声波处理30min，5000巧m离屯、lOmin，取上清用0.22叫1滤膜过滤，即可用于 HPLC-ELSD测定青葛素的含量。
[0081] 采用HPLC-ELSD测定青葛素含量，样品进样体积为20山，根据峰面积代入线形回归 方程计算出样品中的青葛素含量(mg)，再除W样品的青葛叶干重(g)，从而计算出青葛植株 中青葛素的含量。图3示出了在青葛中过量表达和抑制AaMIXTAl基因的结果，其正调控了青 葛中青葛素含量。
[0082] 本发明的青葛MYB类转录因子编码序列AaMIXTAl能够实现提高植物中青葛素含 量，将所述编码序列连于植物表达调控载体上，构建含所述编码序列的植物表达载体;将表 达载体转入农杆菌，将农杆菌转入青葛;通过抗生素筛选，获得含有所述编码序列的转化细 胞，再生转基因植株;本发明获得的转基因青葛中青葛素的含量受到显著调控，在非转化普 通青葛含量为8mg/g DW时，同时期转AaMIXTAl干扰载体青葛中青葛素的含量平均为6mg/g DW，相反，AaMIXTAl过量表达载体青葛中青葛素的含量平均为15mg/g DW。本发明提供了一 个调控青葛中青葛素含量的转录因子编码序列，为利用该编码序列大规模生产青葛素打下 了坚实的基础。
[0083] W上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创 造性劳动就可W根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员 依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可W得到的技术 方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
【主权项】
1. 一种青蒿MYB类转录因子编码序列AaMIXTAl，其特征在于，所述编码序列AaMIXTAl的 核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。2. -种青蒿MYB类转录因子编码序列AaMIXTAl，其特征在于，所述编码序列AaMIXTAl编 码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。3. -种多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。4. 一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包含如SEQ ID NO. 1所示的核苷 酸序列。5. -种重组表达转化体，其特征在于，所述重组表达转化体包含如SEQ ID NO. 1所示的 核苷酸序列。6. 根据权利要求5所述的重组表达转化体，其特征在于，所述重组表达转化体的宿主菌 株为农杆菌。7. 根据权利要求1或2所述的青蒿MYB类转录因子编码序列AaMIXTAl在提高青蒿素含量 中的应用。8. -种提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤： 步骤1、对青蒿分泌型腺毛转录组数据库MYB类转录因子分析，从青蒿cDNA文库中克隆 得到青蒿MYB类转录因子AaMIXTAl; 步骤2、将所述AaMIXTAl基因可操作性地连接于表达调控序列，形成含AaMIXTAl基因的 植物过表达载体； 步骤3、将含AaMIXTAl基因的植物过表达载体转化宿主菌株，得到具有所述过表达载体 的菌株； 步骤4、利用步骤3中构建的所述菌株转化青蒿，经抗生素筛选得到抗性苗，再经PCR检 测为阳性的植株即为转基因青蒿； 步骤5、对步骤4中得到的所述转基因青蒿进行分泌型腺毛密度统计，得到分泌型腺毛 密度显著提高的转基因青蒿，进而得到青蒿素含量提高的青蒿植株。9. 根据权利要求8所述的提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特征在于，所述宿主菌株为 根癌农杆菌。10. -种调节青蒿中青蒿素含量的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤： 步骤1、对青蒿分泌型腺毛转录组数据库MYB类转录因子分析，从青蒿cDNA文库中克隆 得到青蒿MYB类转录因子AaMIXTAl; 步骤2、将所述AaMIXTAl基因可操作性地连接于表达调控序列，形成含AaMIXTAl基因的 植物过表达载体和RNA干扰表达载体； 步骤3、将含所述AaMIXTAl基因的所述植物过表达载体和所述RNA干扰表达载体分别转 化宿主菌株，得到具有所述植物过表达载体和所述RNA干扰表达载体的菌株； 步骤4、利用步骤3中构建的所述菌株转化青蒿，通过抗生素筛选，获得含有青蒿MYB类 转录因子编码序列AaMIXTAl的转化细胞，再生转基因植株，过表达AaMIXTAl转基因植株的 分泌型腺毛数量显著提高，从而青蒿素含量得到提高;干扰AaMIXTAl转基因植株的分泌型 腺毛数量显著降低，从而青蒿素含量降低。
【文档编号】C12N15/84GK105924510SQ201610298517
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年5月6日
【发明人】唐克轩, 石璞, 付雪晴, 沈乾, 孙小芬, 江伟民, 马亚男, 郝小龙
【申请人】上海交通大学