正调控花色苷合成的MYB转录因子的cDNA序列的制作方法
【专利说明】正调控花色苷合成的MYB转录因子的cDNA序列
[0001]
技术领域
[0002]本发明属于植物分子生物技术领域，具体涉及红花香雪兰花瓣分离得到的两个具有功能的，与花朵花色苷合成相关的MYB转录因子和FhPAPm的CDNA序列及其氨基酸序列。
【背景技术】
[0003]影响植物颜色的主要有三大类色素:花色苷、类胡萝卜素和甜菜素。人们对于花色苷的研究抱有极大的兴趣，这源于其对植物生理和人类健康起着非常重要的作用。花色苷是由一系列酶催化合成，这些酶则由相对应的结构基因控制，研究表明:这些结构基因的表达由一个复杂转录调控网络调控，其中MYB转录因子是MBW(MYB-bHLH-WDR)转录因子复合物的重要成员，它发挥着特异性调节的作用。植物MYB转录因子家族是一个具有不同调控功能的大家族，它们对于激活特定的下游基因的表达发挥重要作用。根据MYB蛋白保守结构域的不同，MYB可以分为R2R3 MYB和R3 MYB等。
[0004]到目前为止，人们已经在很多植物中克隆得到正调控花色苷合成的R2R3 MYBJn金鱼草，拟南芥，甘蓝，辣椒，甜橙，淫羊藿，山竹，龙胆，非洲菊，甘薯，牵牛，苹果，苜蓿，杨梅，烟草，矮牵牛，西洋梨，沙梨，碧桃，番茄，马铃薯和葡萄等，但是这些都属于双子叶植物，在单子叶中只有从百合，蝴蝶兰和玉米中克隆得到了花色苷合成相关的MYB转录因子。本发明中涉及到的FhPAPlLl取因是从单子叶植物香雪兰中克隆得到的，编码与植物花色苷合成相关的MYB转录因子，具体说该基因是正调控植物花色形成的转录因子，能促进花色苷的合成，与花色行成密切相关。
【发明内容】
[0005]本发明首次从红花香雪兰花瓣中克隆得到两条正调控花色苷合成的MYB转录因子{FhPAPlLl取FhPAPlL^的cDNA序列，并推测得到了其编码的氨基序列。在拟南芥和烟草中过量表达FhPAPILI取之可以明显地增强植物组织的着色，从而确定其参与正调控植物花色苷合成的功能。
[0006]本发明的主要目的是提供已经得到功能验证的编码FhPAPlLl取FhPAPlLM] cDNA序列和由此推断的氨基酸序列。
[0007]本发明的技术方案:
为了从首次从香雪兰中克隆得到FhPAPlLl取因，本发明人首先利用拟南芥中PAPl序列作为诱饵，对实验室已建立的红花香雪兰花朵盛开时期转录组文库进行本地Blast，筛选与拟南芥中同源性较高的序列。分离得到了长度为212bp的FhPAPlLl片啟，分析该序列显示:此片段与Torenia fournier他R2R3 MYB同源性最高，达到67%，并且该片段包含ATG起始密码子，随后利用RACE法克隆该基因的3’端序列，得到包含TAA终止密码子的长度为717bp的片段，此片段与Elaeis guineGiisis^] MYB75_like同源性最高，达到47%。将上述两条序列拼接，得到全长cDNA序列，接着利用红花香雪兰花瓣总RNA作为模板，设计引物进行RT-PCR，克隆得到929bp的全长J基因，该基因开放阅读框架长702bp，编码233个氨基酸，蛋白质的分子量推测是27，023 Da，等电点为6.23。序列分析表明:此基因与的MYB75_lke同源性最高，达到52%。另外，我们还分离到了长度为755bp的片段，序列分析显示:该片段包含ATG起始密码子和TAA终止密码子。提取红花香雪兰花瓣总RNA作为模板，进行RT-PCR，克隆得到755bp的全长因，开放阅读框架长729bp，编码242个氨基酸，蛋白质的分子量推测是28，076Da，等电点为5.09。序列分析表明:此基因也与Z/aeis的MYB75-1 ike同源性最高，达到53%。
[0008]利用Gal4_GUS拟南芥原生质体瞬时转染体系检测了 FhPAPlLl取FhPAPlLM^i录活性，结果表明-.FhPAPlLl取FhPAPlL2^是转录激活子。
[0009]在pZP211双元表达载体中插入克隆得到的的FhPAPlLl取FhPAPI因，并且转入到农杆菌GV3101细胞中，转染拟南芥和烟草。
[0010]分别运用蘸花法和叶盘法转染拟南芥和烟草，观察转基因植株表型变化。结果显示:转基因植株花色苷的合成显著增强，说明香雪兰中的和因促进了花色苷的合成，初步证明我们克隆得到的基因是香雪兰中正向调控花色苷合成的MYB转录因子。
[0011 ] 香雪兰FhPAPlLl取因的cDNA序列及其编码的氨基酸序列信息如下: 其中1:/?/?/5/"基因的全长核苷酸序列(SEQ ID N0.1)
ATCCAATATTCCTCCCCCTAATGTCTTATCTTGCATGATTCACAATTATGAAACATCAGTACTGCTCCGAGCT
CCGACCTTCGGGCGTTCAGAATCGGAAAGGGGCATGGAACAAAGATGAAGATGAGCTGCTGAGGAAGTGCATTGAAA
AGTATGGAATAGGGAAGTGGAGTACAGTTCCCATGAGGGCAGGACTAAGAAGGTGTCGCAAGAGCTGTCGTCTTCGC
TGGCTGAACTATCTATCCCCTGACATCAACCGAGGAACCTTTAACGACGACGAAGACGACCTCATCCTTCGGCTTCA
CAAGCTCTTGGGCAATAGGTGGTCCCTAATTGCAGGCAGAATCCCCGGCAGGACGGCGAACGACATCAAGAACTACT
GGAACTCTCACTTGGGCAAGAAAGCAGACACCGAGAGAAGGGTACCAGAGAAGACTGACAAGGCTGAGATTGTAAGG
CCACAACCTCAAAGACCGACTTCGACGTGGATTTGGCCGAAGATTAATATTAATCCTCATCAAGAAACTGATCAATT
AGGAACATCTGCCGTGGAGCCAAAACTGCCAACAGTCTTAGAGGAGGAAGAAGCATGGCTGAATGCTTTGATCACCG
ATGATTACAATGAGAATGTGGATGCCGCCTTTTCGGACTTCCATGGCTACGAGATAGGGGGAGGAATATTGGATGAC
ACGCCTTTTTTCGAAGGAGTTACAGGATGGGAGGAACTATACCAGAGAACTGAAAATTAAGTTTAATTTTTCATTGT
TCTAACAATACTGATATCTATATATATATTTTTTTTTTCCTTCGAAGATCAAAGATAGAAAGAAATGAGACCAGTTC
CCCATTGTTGAAAAATAAAGGAATAAGGTTTATGTTTTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAATCGATGTCG
ACTCGAGTC
其中2:由/?/?/5/"基因核苷酸序列推测得到的蛋白质序列(SEQ ID N0.2)MKHQYCSELRPSGVQNRKGAffNKDEDELLRKCIEKYGIGKWSTVPMRAGLRRCRKSCRLRWLNYLSPDINRGTFNDDEDDLILRLHKLLGNRWSLIAGRIPGRTANDIKNYWNSHLGKKADTERRVPEKTDKAEIVRPQPQRPTSTWIffPKININPHQETDQLGTSAVEPKLPTVLEEEEAWLNALITDDYNENVDAAFSDFHGYEIGGGILDDTPFFEGVTGWEELYQRTEN.其中3因的全长核苷酸序列(SEQ ID N0.3)AATGGATCTCAAAGCTTCAGCCCTTCGAAAAGGCGCATGGAGCAAAGAGGAAGACGACCTGCTAAGGAATTGTATCGATAAGTATGGAGAAGGGAAGTGGAGTTCCGTACCCGAACGTGCAGGGCTTAAAAGGTGTCGAAAGAGCTGTCGACTTAGATGGCTGAACTATCTTTCGCCGAAGATCAACCGAGGCAAGTTTTCGGATGACGAGATCGACCTCCTTATCAGGCTTCACAAGCTTCTAGGGAACAGGTGGTCGCTGATCGCGGGCAGAATCCCCGGTAGGACAGCGAACGACATCAAGAATTATTGGAACTCTCACCTGAGCAAGAGAGTGGAAGCAACAAAATGTAGGAGCAAAACTATAGATGCTCAAGTCGCGAGGCCAAATCCTGAGAGAGATTCCGCCAACTGGAGTTGGCCAACAAATATAGGAACAAATTATGGGAACAACTTGGAAGCAGAAGAAACCGAAATGCCGAAACTACGAACAAGTCAAGAGAATCAGGGAGAACGGTCAAATGATTTGATCATGGAGAATGGTTGGGAAGAGTTGATGCTGCATACTTCTGACGTGAGCTTACAGAATTTTCAGATAGACTTCAAGACACCGGAAATGGAGGAACTAACTGAGATGGAGGAACTAACTGAGGAACCAATCTCTCTGGGAGATGAAGGGAATGATTGGACTGCCATGGAAAACTATTTTTTTGATGAGCTCATTAGTTAAGAAAAAAATATATACTAAAATGCGG其中4:由APUZiS因核苷酸序列推测得到的蛋白质序列(SEQ ID N0.4)MDLKASALRKGAffSKEEDDLLRNCIDKYGEGKWSSVPERAGLKRCRKSCRLRWLNYLSPKINRGKFSDDEIDLLIRLHKLLGNRWSLIAGRIPGRTANDIKNYWNSHLSKRVEATKCRSKTIDAQVARPNPERDSANWSWPTNIGTNYGNNLEAEETEMPKLRTSQENQGERSNDLIMENGWEELMLHTSDVSLQNFQIDFKTPEMEELTEMEELTEEPISLGDEGNDffTAMENYFFDELIS.【附图说明】]
图1 FhPAPlLl取(呆守结构域分析；
图2 FhPAPlLl和FhPAPIL2系统进化分析；
图3 FhPAPlLm难]转录激活活性分析；
图4转基因拟南芥表型变化；
图5转基因烟草表型变化；
图6专基因拟南芥表型变化；
图7专基因烟草表型变化。
[0012]
【具体实施方式】
[0013]在下面的具体实施例子中进一步说明了本发明，这并不限制本发明的范围。
[0014]实施例1基因全长的克隆
[实施例1-1]目的片段的获得:根据拟南芥PAPl序列，进行本地Blast。筛选与拟南芥PAPl同源性较高的序列，并进行生物信息学分析，获得长度为212bp的片段，并包含起始密码子ATG。
[0015][实施例基因3’序列的获得:根据转录组测序序列，设计特异性上游引物，即5’ -GGCAGGACTAAGAAGGTGTCG-3’ ；根据mRNA保守的polyA结构设计特异的下游引物:5’ -AAAAAAAAAAAAAAAAATCGATGTCGACTCGAGTC-3’。用 Trizol 试剂盒提取红花香雪兰花朵盛开时期的总RNA，反转录生成cDNA的第一条链，以此作为模板进行RACE，得到的717bp的PCR产物。
[0016][实施例基因全长序列的获得:根据上述测序得到的结果，设计特异的上游引物，即 5’ -CCTCCCCCTAATGTCTTATCTTG-3’ 和 5’ -ATATATAGATATCAGTATTGTTA-3’的下游引物。用Trizol试剂盒提取红花香雪兰花瓣的总RNA，反转录生成cDNA的第一条链，以此作为模板进行RT-PCR，得到/?/?/5^基因全长序列。
[0017]实施例2連因全长的克隆
[实施例2-1]目的片段的获得:根据拟南芥PAPl序列，进行本地Blast。筛选与拟南芥PAPl同源性较高的序列，并进行生物信息学分析，获得755bp的片段，序列分析显示该片段包含ATG起始密码子和TAA终止密码子。
[0018][实施例2-2]因全长序列的获得:根据转录组测序序列，设计特异性上游引物，即 5’ -AATGGATCTCAAAGCTTCAG-3，和 5’ -CCGCAITTTAGTATATAITITITT-3’ 的下游引物。用Trizol试剂盒提取红花香雪兰花朵盛开时期的总RNA，反转录生成cDNA的第一条链，以此作为模板进行RT-PCR，得到的难]基因全长序列。
[0019]
实施例3 FhPAPlLm难]转录活性检测
为了验证和难]转录活性，利用Gal4-GUS为报告基因进行拟南芥原生质体瞬时转染，以⑶-VP为阳性对照。分别将FhPAPlLl取/?/?/5^难]开放阅读框与⑶(Gal4 DNA结合区)融合，35S启动子驱动，克隆到/?況7竭^体上，构建成