一种紫花苜蓿抗寒基因MsCAMTA1及其编码蛋白和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种紫花苜蓿抗寒基因MsCAMTAI 及其编码蛋白和应用。
【背景技术】
[0002] 紫花苜蓿（MedicagosativaL.)是我国重要的栽培饲用牧草资源，其蛋白质含量 高、营养价值丰富，适口性好，产草量高，抗逆性强，被誉为"牧草之王"。紫花苜蓿是理想的 饲用植物，同时也是良好的绿肥植物，具有很强的固氮、蓄水和保护生态平衡的能力，在农 牧业发展中占重要地位。我国北方地区，由于冬季气候干燥寒冷，许多引进的紫花苜蓿品种 普遍存在越冬率低、容易发生冻害和死亡的现象。低温已成为限制北方紫花苜蓿产业发展 的重要影响因素。紫花苜蓿越冬问题，即紫花苜蓿的抗寒性问题，一直是紫花苜蓿研究人员 亟待解决的难题。
[0003] 低温是植物在生长发育过程中常见的一种非生物逆境胁迫。低温能够引起植物膜 损伤、光合降低、呼吸增强、有害化学物质积累、生长抑制以及代谢失调等现象。低温环境不 仅影响植物的生长、发育、代谢，还影响植物的产量，质量，同时还决定植物的地域分布。大 多数源于温带地区的植物可以通过低温驯化提高植物的抗寒能力，如小麦、大麦、油菜等。 Thomashow将冰点以上的低温激活了转录和新陈代谢的重编，进而增加了植物对冰冻的耐 性过程定义为"冷适应"。该过程涉及植物生理生化的多个过程，如：细胞渗透性的增强、质 膜合成物的改变、抗氧化物增强、初级代谢产物的活跃等，也是植物为了安全度过冬季所要 经历的必须阶段。
[0004] 近年来，植物冷驯化和抗寒分子机理的研究取得了显著进展，紫花苜蓿抗寒基因 工程也取得了较大进步。低温胁迫下，植物细胞中会产生大量的活性氧，从而导致蛋白质、 膜脂、DNA及其他细胞组分的严重损伤，而植物体内的各种酶促和非酶促抗氧化系统可有 效清除活性氧。因此，通过将编码抗氧化酶的基因导入紫花苜蓿，可能会为提高紫花苜蓿 抗逆性开辟一条新的途径。Ca2+信号途径在植物抵抗冷胁迫中起到重要作用，大量研究表 明，细胞内钙离子浓度的瞬时升高是触发植物防御反应的早期信号，这种浓度变化需要通 过Ca2+受体传递给相应的革巴蛋白而起作用。CAMTA(calmodulin-bindingtranscription activator)基因，又称SR(singaling_responsiveprotein)基因是一类能与f丐调素结合 并具有转录激活作用的蛋白。Doherty等发现AtSRl/CAMTA3和AtSR2/CAMTAl在植物耐低 温中起着重要作用。突变体camtal中冷诱导的CBF1、CBF2、ZAT12和G0LS3的表达水平远 低于野生型；双突变体camtal/camta3对低温的耐受性显著低于野生型。CAMTA基因在植 物响应低温胁迫的钙信号通过中起着重要作用，虽然拟南芥、小麦、番茄都有报道，但是紫 花苜蓿中CAMTA基因及相关应用至今尚未见报道。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种紫花苜蓿抗寒基因MsCAMTAI及其编码蛋白和应用。
[0006] 本发明是通过以下技术方案来实现：
[0007] 本发明公开了一种紫花苜蓿抗寒基因MsCAMTAl，该紫花苜蓿抗寒基因MsCAMTAl 的核苷酸序列如SEQ.ID.NO. 1所示，序列长度为3123bp，核苷酸序列的碱基组成为916A 869T748G590C。
[0008] 本发明还公开了由上述的紫花苜蓿抗寒基因MsCAMTAl编码的蛋白，该蛋白的氨 基酸序列如SEQ.ID.N0. 2所示，序列长度为1040个氨基酸残基。
[0009] 本发明还公开了含有上述的紫花苜蓿抗寒基因MsCAMTAl的表达载体，所述表达 载体为PCBM-35S-CATMTA1，含有草甘膦筛选标记基因PPT和组成型启动子35S。
[0010] 本发明还公开了上述紫花苜蓿抗寒基因MsCAMTAl在提高紫花苜蓿对环境抗寒性 能中的应用。
[0011] 进一步地，构建含有上述基因MsCAMTAl的植物表达载体，再将所构建的植物表达 载体转化到烟草（Nicotianatabacumcv.SR-1)中，筛选获得抗寒性增强的烟草。
[0012] 与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
[0013] 本发明首次公开了一种紫花苜蓿抗寒基因MsCAMTAl，并获得了该基因编码的蛋白 氨基酸序列，同时运用分子生物学及基因工程技术证实了紫花苜蓿抗寒基因MsCAMTAl可 以提高植物抗寒性。通过Real-timePCR方法对MsCAMTAl在过表达转基因烟草中的表达 量进行了检测。结果显示，所获得的转基因植株中MsCAMTAl的表达量显著提高。对获得的 转基因烟草进行抗寒性分析，经分析表明，转基因植株与野生型相比较，存活率升高，膜透 性增加缓慢，抗零下低温能力提高。本发明获得的MsCAMTAl是一个钙调素结合蛋白转录因 子，不仅在提高植物抗寒性方面起到重要作用，对改良牧草品质具有重要的应用和经济价 值。基于此研究结果，为通过基因工程或分子育种提高作物抗寒性和改良牧草品质提供必 要的理论依据和技术支持，具有较大应用前景。
【附图说明】
[0014] 图1为MsCAMTAl氨基酸序列同源性比对分析结果；
[0015] 图2为MsCAMTAl系统进化树分析结果；
[0016] 图3为MsCAMTAl蛋白二级结构预测结果示意图；
[0017] 图4为MsCAMTAl基因表达模式结果；
[0018] 其中，（a)为室外自然降温处理MsCAMTAl表达模式结果；(b)为人工降温处理 MsCAMTAl表达模式结果；
[0019] 图5为MsCAMTAl载体构建图；
[0020] 图6为MsCAMTAl载体构建电泳结果图；
[0021] 其中，a为pMD18T-CAMTAlSal I和Kpn I双酶切胶回收MsCAMTAl ;
[0022] b为pMD18T-CAMTAl和pBlu载体Sal I和Kpn I双酶切；
[0023] c为pCBMSmaI和SacI双酶切；
[0024] d为pBlu-CAMTAl_17KpnI(平滑）和SacI酶切；
[0025] e为pCBM-CAMTAl_25Sma I和Sac I双酶切鉴定；
[0026] f为pCBM-CAMTAl-25转化农杆菌EHA105菌落PCR鉴定；
[0027] g为pCBM-CAMTAl-25转化农杆菌EHA105阳性克隆SmaI和SacI双酶切鉴定。
[0028] 图7为转MsCAMTAl基因抗性苗的PCR鉴定；
[0029] 图8为qRT-PCR分析过表达株系的MsCAMTAl表达量结果；
[0030] 图9为转基因烟草与野生型烟草低温胁迫下的表型结果分析；
[0031] 图9-1为转基因植株电导率；
[0032] 图9-2为转基因植株叶绿素含量；
[0033] 其中，WT，烟草野生型，TR2,过表达株系2。
【具体实施方式】
[0034] 下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而 不是限定。
[0035] 1、紫花苜蓿抗寒基因MsCAMTAl全长cDNA克隆
[0036] 从NCBI数据库中（(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)搜索漠藜苜蓿的蛋白质序 列和CDS序列并保存，用数据库中已知的拟南芥AtCAMTAl序列在BioEdit软件中对保存的 蛋白质序列和⑶S序列文本文件进行LocalBlast，这样就获得了蒺藜苜蓿中CAMTA1基因 ⑶S序列。利用该序列设计引物，引物为：
[0037]MsCAMTAl-F:5'-AGAAGACGAAGAACATTTCG-3'；
[0038]MsCAMTAl-R:5' -GACATATATTAACAGCGGGG-3'。
[0039] 具体流程如下：
[0040] 1)RNA的提取：利用TRIZ0L试剂盒提取，反转录为cDNA，并以此cDNA为模板 RT-PCR扩增MsCAMTAl全长序列；
[0041] 利用RNApreppurePlantKit试剂盒（TianGen)提取经低温4°C处理5小时的紫 花苜蓿（MedicagosativaL.)叶片RNA，应用RevertraAce随机引物（Toyobo)反转录为 cDNA〇
[0042] 以合成的紫花苜蓿cDNA为模板进行PCR扩增MsCAMTAl全长序列。
[0043] 2)用TaKaRaExTaqDNA聚合酶进行PCR反应，反应程序：94°C预变性5min;94°C 变性 30sec;54°C退火 30sec;72°C延伸 3min25sec;30 个循环；72°C延伸 10min。PCR反应结 束后，将反应液进行2%琼脂糖凝胶电泳检测反应产物，得到约3310bp的片段，采用Takara 公司的MiniBESTAgaroseGelDNAExtractKit回收目的片段。
[0044] 将回收的PCR产物片段连接到克隆载体pMD?18_T(Takara)中的EcoRV位点。重 组质粒转化到大肠杆菌T0P10中，然后对插入的核苷酸序列进行测序。
[0045] 连接反应体系：在10yl反应体系中，SolutionI5yl，PCR回收产物4yl， pMD?18-Tlyl。混匀后16°C反应16h。重组载体的转化：参考《分子克隆实验指南》；
[0046] 4)最终鉴定得到MsCAMTAl基因0RF的全长序列。MsCAMTAl基因开放读码框全长 为3123bp，其编码的蛋白的氨基酸序列具有1040个氨基酸残基，蛋白分子量为116. 9kDa， 理论等电点（PI)为5. 61。将其氨基酸序列在GeneBank中检索，结果显示MsCAMTAl基因 和MtCAMTAl基因（蒺藜苜蓿，AES63449. 2)相比，氨基酸同源性为96% ;与AtCAMTAl基因 (拟南芥，NP_196503. 1)相比，氨基酸同源性为52%。
[0047] 2、MsCAMTAl基因生物信息学分析
[0048] 1)MsCAMTAl基因生物信息学分析
[0049]MsCAMTAl及其他CAMTA蛋白家族成员包括Medicagotruncatula中的 MtCAMTAl(AES63449. 2)，Glycinemax中的GmCAMTA2 (XP_003547081. 1)和Glycinesoja 中的68〇厶10^2〇(圆39228.1)，厶抑1^(1(^818也&11&仙中的厶比厶10^1(即_196503.3)和 AtCAMTA2(XP_201227. 3)，Cicerarietinum中的CaCAMTA2(XP_004485582. 1)，Nicotiana tomentosiformis中的NtCAMTA2(XP_009600618. 1)的氨基酸序列通过Protein-Protein BLAST分析（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)，显示出较高的同源性，其中 GmCAMTA2 (-致性 76 %，相似性 82 % )，CaCAMTA2 (-致性 86 %，相似性 90 %)，AtCAMTAl( - 致性52%，相似性66%)，MtCAMTAl(-致性96%，相似性97% )同源度最高，参见图1。
[0050] 2)进化树分析
[0051]从NCBI获取拟南芥（At)、野大豆（Gs)、鹰嘴豆（Ca)和蒺藜苜蓿（Mt)CAMTA蛋白 质家族的氨基酸序列，应用MEGA4软件比对并构成系统发育进化树（图2)。进化关系上看， MsCAMTAl蛋白序列与MtCAMTAl和GsCAMTA2蛋白亲缘关系最近。
[0052] 3)二级结构及信号肽预测
[0053] 根据ProtParamtool(http://www.expasy.org/tools/protparam.html)的预测 分析，MsCAMTAl蛋白的分子量为116. 9kDa，等电点为5. 61，具有较高的Ser(10. 2M% )和 Asp(7. 7M% )含量，不含有Pyl和Sec残基。
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